马铃薯丝氨酸羧肽酶类蛋白StSCPL家族的鉴定及干旱胁迫响应分析.pdf
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1、在全基因组水平上鉴定了马铃薯 基因家族并对其成员的基本特征、蛋白质保守结构域、进化关系和干旱胁迫下的表达模式进行了分析 同时以干旱耐受性不同的马铃薯品种陇薯 号(干旱耐受型)和大西洋(干旱敏感型)为试验材料利用高通量测序分析了干旱胁迫关键差异表达基因 结果表明马铃薯中共鉴定到了 个 不对称分布在 条染色体中多数成员含有多个内含子 其蛋白均含有 个细胞内分泌和转运的信号肽、底物结合位点、糖基化位点以及与催化作用相关的进化保守基序 在非生物胁迫下大多数 都具有多胁迫响应性 在干旱耐受性不同的马铃薯品种中 表现出差异表达特性 同时及其靶 介导的调控网络显示 和 分别是 .和.的靶基因在干旱耐受性不同
2、的品种中显著差异表达可能是马铃薯对干旱胁迫响应的潜在靶点关键词:马铃薯 基因家族鉴定胁迫响应中图分类号:.文献标志码:(.):.()().收稿日期:修回日期:基金项目:国家自然科学基金()省部共建干旱生境作物学国家重点实验室开放基金()甘肃省科技厅青年科技基金()作者简介:晋昕()女甘肃兰州人博士讲师主要从事马铃薯遗传育种研究:.通信作者:司怀军()男甘肃兰州人教授博士生导师主要从事马铃薯遗传育种研究:.:气候的异常变化导致各种生物和非生物胁迫频发严重影响作物正常的生产种植 马铃薯(.)是世界上产量最高的非谷物粮食作物同时也是浅根系作物干旱等非生物胁迫不仅严重抑制其植株的正常生长发育也是导致其
3、块茎产量损失和质量下降的主因 因此深入挖掘抗旱分子元件研究马铃薯耐旱的分子机理对未来培育抗性新品种意义重大 为了应对各种非生物胁迫植物体内形成了多水平且复杂的胁迫响应与耐受机制主要是一系列生化和生理适应依赖于胁迫相关基因的调控表达 丝氨酸羧肽酶类()蛋白属于 羧肽酶中的 家族其在结构和功能上与丝氨酸羧肽酶()基本相似由催化中心和/水解酶三级结构组成均含有 个细胞内分泌和转运的信号肽、个底物结合位点、多个 糖基化位点以及与催化作用相关的进化保守区域 基因家族在生物和非生物胁迫响应过程中表 现 活 跃 在 不 少 作 物 上 得 到 证 实 番 茄(.)中 型 基因在机械损伤和茉莉酸甲酯()诱导下
4、显著上调表达因此被鉴定为“晚期创伤诱导基因”之一水稻(.)中过表达 的转基因水稻植株对丁香假单胞菌的抵抗力显著强于野生型水稻植株且转基因植株中、和.等防御相关的基因均呈组成型上调表达 此外过表达 的植株对氧化应激的耐受性显著增强氧化应激相关基因表达量也显著上升 高感白粉病的黄瓜(.)品种 接种白粉病菌后 个 的表达水平显著上升 个()呈明显下调表达在盐胁迫处理下黄瓜叶片中、和 显著上调表达 的表达量显著下降而黄瓜根中仅 的表达量增加、和 均显著下调表达 小麦(.)中 在干旱、盐和 处理下均显著上调表达且其过表达系干旱处理后的存活率和脯氨酸()含量均显著高于野生型而丙二醛()含量显著低于野生型对
5、 过表达系进行盐处理()后发现所有转基因株系的根长和鲜质量均显著优于野生型 在干旱、盐碱、光照、缺氮、缺磷、极端温度等多种非生物胁迫下植物中花青素也常被诱导产生同时原花青素也参与多种非生物胁迫响应 研究显示在拟南芥中 基因 编码一个花青素酰基转移酶该 酶 是 合 成 酰 化 花 青 素 的 关 键 酶 而 和 异构体 均参与了铁皮石斛花青素的生物合成可能在非生物胁迫中发挥作用 基因在植物非生物胁迫响应中的重要作用已有报道但其在马铃薯中的具体功能研究尚不多见 基于此本研究通过全面描述马铃薯全基因组中 基因家族的数量、结构、染色体位置和系统发育等研究 基因在激素处理、不同胁迫条件下的表达差异同时通
6、过高通量测序对干旱耐受型和干旱敏感型马铃薯品种中 的表达差异进行分析 此外初步构建了 与 互作调控网络以期为进一步分析马铃薯 在干旱胁迫响应中的功能奠定基础 材料与方法.试验材料及试验处理供试马铃薯品种为陇薯 号(干旱耐受型)和大西洋(干旱敏感型)筛选大小一致的马铃薯种薯(重量约 )种植在花盆中置于温室培养温度()自然光照射 待其发芽后每周用完全营养液给植株浇水和施肥 次植株生长至 时选择生长状态整齐一致的植株进行干旱处理(每天 对照组正常浇水干旱处理组浇 的 水溶液)处理 后收集马铃薯植株顶部的第 片叶用于转录组测序()试验设 个重复每个重复 株选取生长状态一致的大西洋盆栽植株进行干旱胁迫处
7、理 其中对照组()土壤含水量保持在 干旱胁迫组为、和 共 组其土壤含水量分别保持在 、和 每天 次(和 )使用 传感器()监测土壤含水量 处理完成后收集马铃薯植株顶部的第 片叶置于液氮中速冻保存于后续用于实时荧光定量()试验每个处理均包含 次生物学重复 干旱地区农业研究 第 卷.试验设计.基因家族鉴定及进化分析马铃薯基因组相关数据从马铃薯数据库 (:/./)下载并构建本地数据库 在 中下载已注册的拟南芥 转录因子序列结合 蛋白家族数据库(:/./)中的隐马尔科夫模 型(.)利 用()比对鉴定在全基因组水平鉴定筛选马铃薯 家族初步比对的候选成员 在(:/./)进行结构域比对分析最终确定马铃薯 家
8、族成员.基因结构和氨基酸保守结构分析参照 等方法分析马铃薯 基因结构 利用 .软件中的 程序对马铃薯与拟南芥 家族成员的蛋白序列进行多序列比对并采用邻接法()构建系统进化树 参数设置为 .家族成员在染色体上的位置分析参照 等方法同时运用(.)软件绘制马铃薯 基因在染色体上的分布图并对其进行共线性分析.家族成员启动子区顺式作用元件分析从马 铃 薯 基 因 组 数 据 库(:/./)中获取马铃薯 基因启动子区序列信息 利用 数据库(:/./)搜索转录起始位点()上游.区域以分析顺式作用调控元件.马铃薯 家族表达分析利用数据库(:/./)中马铃薯基因在不同组织及生长时期的转录组测序()数据对马铃薯
9、在不同组织及生长时期进行表达分析 利用数据库(:/./)中马铃薯基因在不同胁迫条件下的 数据分析 在非生物胁迫、生物胁迫及激素处理下的表达模式利用 转 录 组 测 序 分 析 干 旱 胁 迫 下 马 铃 薯 在 个不同抗旱性品种中的表达差异 测序及数据处理如下:以马铃薯 为模板用 碱基随机引物和逆转录酶合成 第一链并以其为模板进行第二链 的合成 完成文库构建后采用 扩增进行文库片段富集使文库大小为 然后通过 对文库进行质检 根据文库有效浓度以及文库所需数据量将含有不同 序列的文库按比例进行混合 混合文库统一稀释到 通过碱变性获得单链文库 样品经过 抽提、纯化、建库之后采用第二 代 测 序 技
10、术()基于 测序平台对文库进行双末端()测序(南京派森诺基因科技有限公司)样品经过上机测序生成 的原始数据()对每个样品的下机数据()分别进行统计包括样品名、模糊碱基所占百分比、以及(碱基识别准确率在 以上的碱基所占百分比)和(碱基识别准确率在.以上的 碱 基 所 占 百 分 比)数 据 过 滤:()采 用 去除 端带接头的序列()去除平均质量分数低于 的 使用 的升级版 软件(:/./.)将过滤后的 比对到马铃薯参考基因组(.)计算相关基因表达量为进一步分析干旱胁迫下马铃薯 表达模式采用 (艾科瑞中国长沙)使用 荧光定量 仪(罗氏瑞士)进行 反应总体积 其中 .引物(正向和反向引物各.)()
11、模板及.反应程序如下:随后 和 共 个循环内参基因为(:.)试验设 个生物学重复和 个技术重复并用 法计算基因的相对表达量内参基因为 结果与分析.马铃薯 家族的鉴定及进化分析通过(.)扫描、()比对和 搜索相结合的方法在马铃 薯 中 共 鉴 定 出 个 成 员 所 有 的登录号均可在 中获得(表)马铃薯 的 个基因存在长度差异从()到 ()不等编码蛋白长度为(表)为进一步研究马铃薯 的进化关系利用拟南芥(个)和马铃薯(个)家族成员构建了系统进化树(图 见 页)结果显示 个 分别属于 个亚族 其中 组成员最多(个)组为 个成员 组最少(个)与其他物种中 的研究结果相似 第 期 晋 昕等:马铃薯丝
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