梨小食心虫GmolNPC2的基因克隆、表达谱及配体结合特征.pdf

【目的】本研究旨在为深入研究梨小食心虫 尼曼匹克 型蛋白()的嗅觉感受功能提供理论参考【方法】基于梨小食心虫触角转录组数据利用 扩增 的 全长序列进行系统进化分析和 结构模型预测利用 检测 在梨小食心虫不同发育阶段(卵、龄幼虫、蛹和雌雄成虫)、日龄雌雄成虫不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹、足和翅)中的相对表达量利用荧光竞争结合实验测定重组 蛋白对包括 种性信息素和 种寄主植物挥发化合物在内的 种气味配体的抑制常数 值分析结合能力通过分子对接模拟实验计算 与不同气味配体的结合能预测蛋白和配体相互作用的关键氨基酸残基【结果】获得梨小食心虫(登录号:)的 全长序列开放阅读框()长 编码 个氨基酸多序列比对发现 具有昆虫 典型的结构特征系统进化分析表明已知鳞翅目()昆虫的 聚类至 个分枝 与大豆食心虫 、红铃虫 和烟草天蛾 等的 氨基酸序列一致性较高并聚类至同一分枝 检测结果表明 在梨小食心虫雄成虫和卵中的表达量显著高于其他发育阶段的 在 日龄雌雄成虫翅中的表达量最高在触角中的次之在胸、腹和足中的最低 重组蛋白 的结合谱较窄仅能够结合 种气味配体中的 种对其中的乙酸顺十二碳烯酯、苯甲醇和乙酸顺己烯酯表现出强烈的结合能力值分别为()(.)和(.)/分子对接模拟结果显示 与不同气味配体之间的结合能存在差异与上述荧光结合实验的结果较一致 疏水性氨基酸残基和氢键在 结合不同气味配体中发挥着重要作用【结论】具有昆虫 家族的保守结构在卵和成虫以及成虫翅和触角中的表达量较高推测其参与梨小食心虫的多种生理过程重组蛋白 能够选择性地结合性信息素和寄主植物挥发化合物表明 参与对挥发性信息物质的识别和运输关键词:梨小食心虫 尼曼匹克 型蛋白 嗅觉 化学感受 寄主植物挥发物中图分类号:文献标识码:文章编号:()(:)(.()期李春沁等:梨小食心虫 的基因克隆、表达谱及配体结合特征 .):【】().【】.()().().【】(.:).().()(.)(.)(.)/.【】.:昆虫嗅觉系统包括外周嗅觉系统和中枢嗅觉系统两部分外周嗅觉系统负责识别外源气味分子并把气味分子的化学信号转变为电信号中枢嗅觉系统则负责对气味分子的电信号进行整合处理(.)嗅觉结合蛋白是参与外周嗅觉系统的第一类蛋白负责识别和运输气味分子通过感器淋巴液的疏水屏障至位于感受神经元树突膜上的气味受体()附近激发嗅觉信号传导通路(.)目前被学者广泛认同的嗅觉结合蛋白主要有气味结合蛋白()和化学感受蛋白()两类(.昆虫学报 卷)随着众多学者对昆虫嗅觉系统的深入研究在昆虫触角中发现了一类结构与 和 高度相似的尼曼匹克 型蛋白()(.)是一种小分子水溶性溶酶体蛋白最早在脊椎动物中发现其主要功能是负责胞内胆固醇转运和脂类物质分配 基因突变会导致胆固醇和脂质在溶酶体内积累诱发尼曼匹克 型病(.)其中部分 在昆虫触角中高丰度 表 达 如 中 红 侧 沟 茧 蜂 (.)、日 本 弓 背 蚁(.)、苜蓿盲蝽 和(.)被认为是第 类具有昆虫嗅觉结合功能的蛋白(吴帆等)研究 蛋白的嗅觉功能对更深入理解昆虫的嗅觉通讯具有重要意义 属于 相关脂质识别蛋白()超家族蛋白在脊椎动物、哺乳动物中仅有 种 且在不同物种中高度保守(.)而昆虫中 成员较多且不同物种的 之间以及种内 之间分化程度较高生理功能呈现多样性如家蚕 参与促进甘油三酯在 细胞中的积累(.)、黑腹 果 蝇 和 参与蜕皮激素的合成和调解甾醇稳态(.)、黑腹果蝇 和中华蜜蜂 在病原识别和免疫信号通路中发挥重要作用(.党 晓 群 等 )日 本 弓 背 蚁、中红侧沟茧蜂 和腰带长体茧蜂 能够结合芳樟醇和 紫罗兰酮等寄主植物挥发性化合物(.)梨小食心虫 是一种重要的果树害虫主要以幼虫钻蛀取食寄主的嫩梢和果实为害桃、梨是该虫的嗜食寄主植物(.)在复杂生境中梨小食心虫成虫可以依靠灵敏的嗅觉系统准确定位最佳的产卵寄主植物确保子代幼虫数量快速增长进而引发严重的危害(.)性诱剂诱捕和迷向防治是绿色无公害治理该虫的重要手段(.)前期对梨小食心虫 和 的研究发现对雌虫释放的性信息素和寄主植物挥发物均具有选择结合活性(.)对气味分子的结合谱较 窄且结合能力较弱(.)本研究基于梨小食心虫触角转录组数据获得 候选基因的基础上通过 测序和系统进化分析验证了 通过 技术测定了 在梨小食心虫不同发育阶段和成虫不同组织中的相对表达量通过构建原核表达系统表达了重组 蛋白利用荧光竞争结合试验测定分析了重组 结合性信息素和寄主植物挥发化合物的能力对进一步阐明昆虫 参与外周嗅觉系统通讯提供了理论依据 材料与方法.供试虫源及样品收集本研究所用梨小食心虫试虫为延安大学生命科学学院昆虫化学生态学实验室继代饲养的实验种群饲养条件:温度()相对湿度 光周期 幼虫以人工饲料饲养(杜娟等)老熟幼虫化蛹后将蛹分雌雄分别置于不同的养虫盒中羽化成虫羽化后饲喂 的蜂蜜水补充营养 以收集的卵(粒)、龄幼虫(头)、龄幼虫(头)、龄幼虫(头)、龄幼虫(头)、龄幼虫(头)、蛹(头)和成虫(雌雄虫各 头)为测定 在梨小食心虫不同发育阶段相对表达量的样品选取梨小食心虫 日龄成虫分别收集触角(雌雄虫各约 根)、去除触角的头(雌雄虫各 个)、胸(雌雄虫各 个)、腹(雌雄虫各 个)、足(雌雄虫各 条)和翅(雌雄虫各 头)作为测定 基因在梨小食心虫成虫不同组织相对表达量的样品 每个样品各 个生物学重复 所有样品保存于 冰箱待用.克隆和序列分析利用 试剂()提取.节所有样品的总 超微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司)测定各样品总 的浓度利用 试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司)去除总 中残留的基因组 并以()为引物、总 为模板合成 第 链 基于梨小食心虫触角转录组数据利用 .软件设计引物(表)期李春沁等:梨小食心虫 的基因克隆、表达谱及配体结合特征 表 引物信息 引物引物序列()产物大小()用途基因克隆 原核表达 下划线序列 和 分别表示限制性内切酶 和 酶切位点方框表示 个组氨酸所对应的核苷酸序列 .以/为特异性引物、雄成虫触角 为模板利用 扩增 的 全长序列 反应体系():正反向引物(/)各.模板 灭菌 补充至 反应程序:共 个循环 延伸 目标产物送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序验证利用在线程序开放阅读框()(:./)预测 的完整编码区.在线工具预测位于 末端的信号肽序列 从 数据库下载已知昆虫 的氨基酸序列利用(.)软件将 和下载到的其他昆虫的 种 的氨基酸序列进行多序列比对利用 (.)的邻接法()构建系统发育树自举值()为 次重复.的相对表达量测定以.节合成的 为模板以梨小食心虫(登录号:.)和(登录号:.)为内参基因使用 检测 在梨小食心虫不同发育阶段和 日龄成虫不同组织中的相对表达量引物序列见表 反应体系():正反向引物(/)各.()灭菌 补充至 反应程序:(和)/()共 个循环 次生物学重复 次技术重复 参照 等()和 等()的方法计算 的相对表达量.蛋白的原核表达根据 编码区序列去除信号肽序列后设计带有 和 酶切位点的特异性引物用于原核表达(表)以梨小食心虫雄虫触角 为模板、/为引物进行 扩增(表)产物经胶纯化回收后连接至 克隆载体然后转大肠杆菌 感受态细胞在 固体平板培养基上筛选阳性克隆并利用菌液 进行验证 将含有目的片段的/重组质粒 和表达载体()质粒 用 和 限制性内切酶分别进行双酶切经胶纯化回收后利用 连接酶将 片段连接至线性化的()载体上转化至()感受态细胞菌液 鉴定阳性克隆后送测序公司测序验证 将测序正确的菌液以 的比例(/)接种于灭菌的 液体培养基中置于恒温摇床在 /振荡培养.当菌液 值达到.时加入终浓度./的 诱导 离心收集菌体后加入工作浓度为./的溶菌酶水解菌体的细胞壁 然后用细胞破碎仪破碎细胞后 /离心 弃上清收集沉淀(因预实验 检测发现重组 以包涵体的形式存在)使用 /尿素对包涵体进行了剧烈变性再依次经过含有胱氨酸、半胱氨酸辅助 昆虫学报 卷蛋白复性的溶液中使 得到充分复性的可溶蛋白(.)利用 (上海七海复泰生物科技有限公司)对目标重组蛋白进行纯化使用 蛋白定量试剂盒(陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司)测定重组 蛋白的浓度.重组 配体结合能力测定为了测定重组 结合性信息素和寄主植物挥发化合物的能力共选择了 种性信息素和 种寄主植物挥发化合物共 种气味配体(表)其中乙酸顺十二碳烯酯、乙酸反十二碳烯酯、顺十二碳烯醇和十二烷醇为梨小食心虫雌虫性信息素前 种化合物购自北京中捷四方生物科技股份有限公司十二烷醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司 乙酸顺十四碳烯酯和乙酸顺十四碳烯酯为梨小食心虫同域近缘物种李小食心虫的次要性信息素对梨小食心虫雄虫有明显的驱避作用(.)以上两种性信息素委托沈阳北欣景溢贸易有限公司合成 本研究选择的 种寄主植物挥发性化合物均是桃树嫩梢、果实和梨、苹果果实的挥发物(.)对应的化学合成品均购自化学试剂公司用色谱级甲醇将待测的 种气味配体和荧光探针 配制成 /的母液然后再稀释成 /的测试液 将低温冻存的重组蛋白 用 /(.)缓冲液稀释至 /的测试浓度 利用荧光分光光度计(日本日立公司)测定重组 结合气味配体的能力()测定重组 与荧光探针 的抑制常数(记作):移取 /重组蛋白 溶液至 光通径的石英比色皿中然后按 和/的终浓度依次加入设置激发光和发射光的狭缝宽度均为 激发光波长 扫描发射波长 记录每个 浓度下激发的最大荧光强度值 利用 .软件中的非线性回归方程和 方程计算重组蛋白 与 的抑制常数 ()测定重组 和气味配体的抑制常数()值:向比色皿中加入 /重组蛋白 溶液和终浓度为/的 溶液并充分混匀记录重组蛋白 与 结合的初始荧光强度值 然后将每种气味配体按 和/的终浓度依次加入比色皿记录气味配体取代荧光探针 后的荧光强度值 每个样品重复测定 次 依据公式 /(/)计算重组 与不同气味配体的 值其 中 为 气 味 配 体 替 代 使 重 组/复合物初始荧光强度值降低 时的配体浓度表示游离的 的浓度为了更准确地描述重组 结合气味配体能力的强弱规定 /和 /分别表示蛋白对气味配体具有强烈、中等和较弱的结合能力(.).同源建模和分子对接模拟利用 在线工具(:./)在 数据库查找 的晶体结构模板根据 序列和模板序列的相似度和覆盖度最终选择日本弓背蚁(:)和家牛 (:)的晶体结构为模板利用 .软件构建 的 模型根据 赋分选择能量最低的 模型为最佳模型并利用(.)软件进行呈现利用.(.)计算 与不同配体的结合能 在有机小分子生物活性数据库(:./)中下载本研究所用的 种性信息素和 种寄主植物挥发化合物的三维结构数据文件(格式)然后通过 .软件将其转换为 格式文件 蛋白和配体化合物的分子结构经加氢、计算电荷、去除无用水分子和添加蛋白类型等前处理后将其保存至 格式文件 选择.默认的参数进行分子对接分析设定对接 次根据结合能评分对具有最低结合能的构象使用 .和 .进行可视化分析.数据分析 在梨小食心虫不同发育阶段和成虫不同组织中的相对表达量差异用单因素方差分析进行检验在不同性别间的相对表达量差异用独立样本 检验进行检验 结果.的序列和系统进化成功克隆获得梨小食心虫(期李春沁等:梨小食心虫 的基因克隆、表达谱及配体结合特征 登录号:)的 全长序列其 长 编码 个氨基酸 端有 个氨基酸组成的信号肽表明该蛋白属典型的分泌蛋白 具有 个保守的半胱氨酸残基()最显著的分布特点是第 和第、第 和第 个 之间均具有 个其他的氨基酸残基(图)比对发现 与大豆食心虫 的氨基酸序列一致性最高(.)与烟草天蛾 的次之(.)基于 与其他昆虫的 种 氨基酸序列构建系统发育树结果表明鳞翅目昆虫的 聚类至两个大的进化枝 和 梨小食心虫 与大豆食心虫、红铃虫 、烟草天蛾和柑橘凤蝶 的 同源性较高共同聚类至 进化枝(图)图 梨小食心虫 与其他鳞翅目昆虫 的氨基酸序列比对.蛋白来源物种及 登录号 :红边小灰蝶 .:偏瞳蔽眼蝶 .:红点豆粉蝶 .:黑脉金斑蝶 .:大蜡螟 .:梨小食心虫 :大豆食 心虫 .:烟 草天 蛾 .:阿芬眼蝶 .:金凤蝶 .:柑橘凤蝶 .:红铃虫 .:大菜粉蝶 .个保守的半胱氨酸残基用黑色圆点表示 .的表达模式 检测结果表明 在梨小食心虫不同发育阶段(.)、日龄雌雄成虫间不同组织(雌成虫:.雄成虫:.)中的相对表达量存 昆虫学报 卷图 邻接法构建的基于氨基酸序列的梨小食心虫 与其他昆虫 系统发育树(次重复).()在显著差异在梨小食心虫不同发育阶段在卵和雄成虫中的相对表达量最高在雌成虫中的次之在 龄幼虫中的最低(图:)在梨小食心虫 日龄雌雄成虫不同组织中 在翅中的相对表达量最高显著高于其他组织中的(.)在雌雄成虫触角中也有较高的表达相对表达量分别是雌雄成虫翅部表达量的.和.在雌雄成虫胸、腹和足中的相对表达量较低 在触角、去除触角的头、胸、腹和翅中的相对表达量存在显著的性别差异雄成虫触角(.)、去除触角的头(.)和翅(.)中的表达量显著高于雌成虫中的雌成虫胸部(.)和腹部中(.)的表达量显著高于雄成虫中的表达量(图:)期李春沁等:梨小食心虫 的基因克隆、表达谱及配体结合特征 图 在梨小食心虫不同发育阶段()和 日龄成虫不同组织()中的相对表达量.()()图中数据为平均值 标准误()柱上小写字母和大写字母分别表示基因表达量在不同发育阶段、雌成虫不同组织和雄成虫不同组织间差异显著(.单因素方差分析 多重比较)柱上星号、双星号和 分别表示基因相对表达量在相同组织中雌雄成虫间差异显著()、极显著(.)(独立样本 检验)().(.).(.)(.)().重组 蛋白的原核表达 检测表明重组 以包涵体的形式存在(图 泳道)利用 纯化蛋白后得到分子量约 的单一条带表明获得了较高纯度的 重组蛋白(图 泳道).重组 与性信息素和寄主植物挥发化合物的结合能力图 显示随着 终浓度的不断增大荧光 强 度 值 增 加 的 幅 度 越 来 越 小 最 终 达 到 与荧光探针结合的饱和效应 利用非线性回归方程和 方程计算出 与 的解离常数()值为()/在待测的 种气味配体中仅有 种化合物能与 结合表明 的结合谱较窄(表)在待测的 种性信息素化合物中 对乙酸顺十二碳烯酯具有强烈的结合活性(.)/与顺十二碳烯醇和十二烷醇具有中等的结合能力值分别为()和(.)/)与乙酸反十二碳烯酯、乙酸顺十四碳烯酯和乙酸顺十四碳烯酯无明显的结合活性 在 种醇类物质中 能够强烈结合苯甲醇图 检测重组蛋白 的表达和纯化.:蛋白分子量标准 :未经 诱导的 表达产物 :诱导的 表达产物 :诱导 表达产物的上清 :诱导 表达 产物 的沉 淀 :纯 化 的 蛋白 .昆虫学报 卷(.)/对顺己烯醇和正己醇表现出中等强度的结合活性(值分别为(.)和(.)/对其他 种醇类物质无结合活性 在 种醛类物质中 仅与辛醛和苯甲醛具有中等强度的结合能力值分别为(.)和(.)/与其他醛类物质没有结合活性在 种酯类物质中 与乙酸顺己烯酯的结合能力最强(.)/对梨酯具有中等的结合能力(.)/对 丁 酸 丁 酯 的 结 合 能 力 较 弱 (.)/与其他 种酯类物质没有结合活性 在 种萜烯类物种中与橙花叔醇、蒎烯、罗勒烯和 石竹烯具有中等强度的结合活性对其他 种萜烯类物质没有结合能力 对苯甲腈和柠檬腈均具有中等的结合活性值分别为()和(.)/图 重组 蛋白与荧光探针 的结合曲线和线性化的斯卡查德图.表 重组蛋白 对性信息素和寄主植物挥发化合物的结合能力 配体 登记号 .纯度()(/)(/)结合能(/)性信息素 乙酸顺十二碳烯酯().().乙酸反十二碳烯酯().().顺十二碳烯醇().().十二烷醇.().乙酸顺十四碳烯酯().().乙酸顺十四碳烯酯().().寄主植物挥发化合物 甲基丁醇.().顺己烯醇().().反己烯醇().().正己醇.().正庚醇.().异辛醇.().癸醇.().苯甲醇 ().反己烯醛().().己醛.().庚醛.().辛醛.().壬醛.().癸醛.().十二醛.().苯甲醛.().丙酸丁酯 .().甲基丁酸乙酯 .().乙酸异戊酯 .().期李春沁等:梨小食心虫 的基因克隆、表达谱及配体结合特征 续表 配体 登记号 .纯度()(/)(/)结合能(/)丁酸丁酯 .().乙酸顺己烯酯 .().己酸乙酯 .().异戊酸乙酯 .().己酸丁酯 .().水杨酸甲酯 .().梨酯 ().异戊酸叶醇酯 .().芳樟醇.().法尼醇().橙花叔醇.().莰烯.().蒎烯.().罗勒烯.().()水芹烯()().月桂烯.().石竹烯.().苯甲腈.().柠檬腈.().:气味配体替代 使蛋白/复合物的初始荧光强度值降低 时的配体浓度 /:抑制常数 :无法计算出 值 .同源建模及与气味配体的分子对接 具有由 个 折叠形成的球状结构蛋白的 端肽链较长端肽链短 三级结构中 和 连接形成 对二硫键维持空间结构(图:)中共有 个氨基酸残基参与 折叠进而形成空腔结构其中.的残基为疏水性氨基酸显示该空腔为疏水腔推测是结合气味分子重要区域(图:)与气味配体之间的结合能见表 和 种不同气味配体的结合能存在差异与己醛的结合能最大(./)、与 石竹烯的结合能最小(./)与其他配体的结合能介于上述两者之间 除法尼醇外 和其他气味配体结合能的大小与上述荧光结合实验的结果一致 由于乙酸顺己烯酯、乙酸顺十二碳烯酯和苯甲醇是荧光结合实验中与 结合能力最强的 种气味配体通过分子对接预测了蛋白和配体结合的关键氨基酸残基结果表明(图)和 是 和乙酸顺十二碳烯酯发生相互作用的关键氨基酸残基 结合乙酸顺己烯酯主要通过 残基的氨基氢与配体分子的羰基氧形成氢键 和 是 结合苯甲醇的关键氨基酸残基 讨论本研究成功克隆了梨小食心虫 家族中的 个基因 经序列比对和结构分析发现其具有 蛋白家族的进化特征和结构特点 昆虫 蛋白家族与脊椎动物、哺乳动物仅有 个 成员不同其通常具有 个以上的 如在黑腹果蝇和埃及伊蚊 中分别鉴定到 个()和 个()(.)本研究鉴定到的 具有 个保守的 应归属于 蛋白家族第 亚组 系统发育分析发现鳞翅目昆虫的 聚类至 和 两个进化枝与 共同聚类至 进化枝的大豆食心 虫、红 铃 虫、烟 草 天 蛾 和柑橘凤蝶 均属于 家族 昆虫学报 卷图 梨小食心虫 的三维结构模型()和表面模型().()():分别为第 个 折叠 .第 亚组蛋白(图)聚类至 进化枝的 属于第 亚组蛋白表明同一亚组中的 之间其同源性更高昆虫中 家族基因的表达谱呈现多样性 在梨小食心虫不同发育阶段和成虫不同组织中均有表达但表达量存在差异 从不同发育阶段看 在卵和雄成虫中的表达量最高蛹和老熟幼虫的次之在低龄幼虫中的表达量最低(图:)在卵中高丰度表达推测其参与卵的发育或者附肢的形成目前在其他昆虫中尚未有关 在卵中高表达的报道 是否参与卵的胚胎发育尚待进一步研究 从成虫不同组织看 在翅中相对表达量最高在触角、去除触角的头中的次之在胸、腹和足中的最低(图:)翅是昆虫的主要运动器官翅上分布着大量的化学 感 受 器 官(.)推 测 参与梨小食心虫成虫的某些运动感受功能 试验也表明中华蜜蜂(张莉等)、重阳木锦斑蛾 (.)在翅中也有较高的表达量 在触角中的表达量低于翅中的表达量而高于在成虫其他组织中的表达量表明其可能参与该虫的嗅觉通讯 基因在触角中的表达量随昆虫种类的不同差异较大如重阳木锦斑蛾 和(.)、苜蓿盲蝽 和(.)、腰 带 长 体 茧 蜂(.)在触角中的表达量显著高于其他组织的表达量而柑橘大实蝇 (陈 剑 等 )、中 红 侧 沟 茧 蜂(.)在触角中的表达量较低推测 在昆虫中具有多样性的生理功能 作为梨小食心虫触角中的另一类运输蛋白基因其表达模式与 和 基因存在差异大部分 基因特异性表达于梨小食心虫触角中在不同发育阶段主要表达于老熟蛹和成虫中(.)基因在不同发育阶段和成虫不同组织中均有表达部分 基因在成虫触角中的表达量高于其他组织中的表达量(.)以上 种运输蛋白基因虽然在时空表达模式上存在差异但均在主要的嗅觉通讯器官触角中具有较高的表达量表明 与 基因和 基因具有相似的嗅觉生理功能本研究鉴定的梨小食心虫 与其触角内 家族中的 在结构上具有相似性如均具有 个保守的 残基、个疏水性的结合口袋以及 对二硫键(.)(图)但 与 又明显不同 的 二 级 主 结 构 为 螺 旋 而 则为 折叠 中 个保守 期李春沁等:梨小食心虫 的基因克隆、表达谱及配体结合特征 图 重组蛋白 与 种结合力最强的气味配体相互作用的关键氨基酸残基.和 为重组蛋白 与配体相互作用的 结构 和 为重组蛋白 与配体相互作用的 示意图 .的 符 合 (为除 以外的氨基酸)的分布特征(.)而 中 个保守的 符合 的分布特点 的 对二硫键由 和、和、和 通 过 交 叉 连 接 形 成(.)而 的 对二硫键由 和、和、和 连接形成 通过具有较长的 末端而 及其他 的 末端极短 昆虫 和 结合配体的机制相似两种蛋白均具有球状的结合口袋亲水性氨基酸分布于结合口袋表面、疏水性氨基酸分布在内部形成疏水腔(.)配体进入疏水腔后能与疏水性氨基酸残基的某种原子形成分子间弱作用力(如氢键、弱范德华力、键、键等)从而锚定配体 具有多个膜结合位点它通过与跨膜蛋白 结合将胆固醇转移至 又与内质网上的含氧甾醇结合蛋白(昆虫学报 卷 )结合从而介导晚期内涵体()或溶酶体()与内质网接触位点的形成从而使胆固醇从 或 转移至内质网中避免胆固醇等物质在 或 累积(.)通常具有长的 末端在 值中性或者弱酸性的感器淋巴液中 末端肽链为伸展构象当/气味配体复合物从中性感器淋巴液移动至位于嗅觉感受神经元()树突膜上 附近时由于 周围酸性增强 末端肽链从伸展构象转变为第 个 螺旋占据了结合腔迫使 释放气味配体(.)与 相似日本弓背蚁 也在低 条件下释放其结合的醇类、长链脂肪酸等信息化学物质(.)本研究通过分子对接模拟试验预测了 与其偏好结合的配体乙酸顺己烯酯、乙酸顺十二碳烯酯和苯甲醇的相互作用力及关键氨基酸残基发现疏水性氨基酸如脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等是 结合以上 种配体的关键残基 与 种配体之间的相互 作 用 均 有 典 型 氢 键 的 参 与 表 明 氢 键 是 结合配体重要的弱作用力(图)目前 结合、释放挥发性气味分子的机制尚不清楚有待进一步深入研究荧光竞争结合试验发现 与性信息素乙酸顺十二碳烯酯、寄主植物挥发化合物苯甲醇和乙酸顺己烯酯具有强烈的结合活性是待测 种气味配体中 最偏好结合的化合物(表)比较梨小食心虫 和 对性信息素和 寄 主 植 物 挥 发 化 合 物 的 结 合 能 力 发 现 与乙酸顺十二碳烯酯的结合能力较性信 息 素 结 合 蛋 白 的 弱 但 强 于 和(.)、和 (.)、/的结合能力(.陈秀琳等 .)表 明 可以结合性信息素 结合苯甲醇 和 乙 酸顺己 烯 酯 的 能 力 较 所 有 已 知 的强乙酸顺己烯酯是桃、梨、苹果等果树叶片和果实的主要绿叶挥发物(.)也是利用植物源挥发物引诱梨小食心虫的重要组成物质前人诱捕试验发现乙酸顺己烯酯 顺己烯醇 苯甲醛 (/)的混合组分对雌虫的引诱效果与天然桃梢挥发物相当(.)以乙酸顺己烯酯 顺己烯醇 反己烯醛 苯甲醛苯甲腈.组成的混合组分对梨小食心虫成虫有强烈的引诱活性()以顺己烯乙酸酯()罗勒烯()法呢烯 (/)配制的混合物对梨小食心虫雄虫具有明显的引诱效果(.)综上表明 能够识别和结合寄主植物挥发物在梨小食心虫的嗅觉通讯中起着重要作用参考文献().():.:.():.():.陈剑 王兆祥 杨岭 叶海霞 毛丽 桂连友 张国辉.柑橘大实蝇 基因的序列分析和组织表达模式.植物保护():.()(:).:.()(:).():.(:).():.陈秀琳 苏丽 陈丽慧 李怡萍 仵均祥李广伟.梨小食心虫 气味结合蛋白的分子克隆、表达谱及结合特性分析.昆虫学报():.():.党晓群 黄钰彬 李颜 李小青 王程程 周泽扬 许金 期李春沁等:梨小食心虫 的基因克隆、表达谱及配体结合特征 山.中华蜜蜂 的原核表达和鉴定.应用昆虫学报():.:.(:).():.(:).(.)():.杜娟 王艳蓉 仵均祥.不同饲料配方对梨小食心虫生长发育及繁殖的影响.山西农业大学学报(自然科学版)():.():.():.:.:.():.():.():.():.():.():.():.()(:).:.()(:).():.()(:).():.():.()(:).():.:.():.():.:.():.(:).():.(:).():.():.(:).():.():.昆虫学报 卷 .:.:.():.():.:.():.():.().():.:.():.(:).():.():.吴帆 张莉 邱一蕾 李红亮.昆虫嗅觉结合蛋白研究进展.昆虫学报():.():.:.(:).:.:.()(:).():.().:.().():.():.张莉 张楠 江虎强 吴帆 李红亮.中华蜜蜂 基因家族克隆及表达模式分析.中国农业科学():.():.:.(:).():.(责任编辑:马丽萍)