痰检实验室操作规程.doc

痰检实验室操作规程
一、检查程序
　　（一）痰标本收集：在三个痰标本盒上注明病人的姓名、编号、检查日期和容器序号。病人首次留痰前应指导病人，留取“即时痰”、“夜间痰”、“晨痰”合格的痰标本，对所送不合格痰标本除常规检查外，应要求患者重新送检，合格的痰标本包括干酪痰、血痰、粘液痰。唾液或口水用于病人确诊时为不合格痰标本，标本量一般在3～5 ml。
（二）痰涂片制作：
1、检查前对新的玻片用95%的乙醇擦拭脱脂，经干燥、清洁、检查无油污、无划痕后作为合格的玻片备用。在已经准备的痰玻片背面左端的1/3处注明编号 ，挑取痰标本中可疑部分约0.05～0.1 ml，于玻片正面右侧2/3处，均匀涂抹成10×20 mm的卵圆形痰膜。
2、痰膜朝上静置自然干燥后(一般约需要30分钟)进行染色镜检。当气温低，痰膜不易干燥时，严禁将玻片直接在火焰上烘拷，以防产生气溶胶或痰膜脱落。一张载玻片上只能涂抹一份痰标本，一张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于痰涂片染色检查。
　　 3、涂抹完毕后的痰标本，在检查结果报告前，应暂时保留。以备涂片、染色不合格影响镜检结果时，重新涂片和染色之用。
4、萋－尼氏染色油镜检查.
　　（三）实验室登记：按照年度病人序号和痰标本序号在实验室登记本上进行登记，并以同样的号码在痰涂片检查单上进行标记。检验单的病人姓名应与实验室登记本一致。
　　 （四）痰涂片检查结果登记与报告：及时在登记本上登记痰涂片检查结果。当病人的三次痰涂片检查完成后，发现有阳性痰涂片，应在规定时间内报医院防保科，县级结核病防治机构再对痰涂片进行确认。
　　（六）痰涂片的保存：每个查痰点镜检后的全部痰涂片应按实验室登记本序号连续排列，分别存放在各点固定的玻片盒中，供上级实验室复核确认。
　　（七）痰检质量控制：每个痰涂片检查点均按照中国结核病防治规划《痰涂片镜检质量保证手册》的要求，作为一个独立的被质控单位接受室间质量评估和检查工作。

　　二、 萋－尼氏染色
　　1、涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持在10 mm以上的距离；火焰固定(在5秒钟内将玻片置于火焰上来回烘烤4次)。
2、滴加石碳酸复红染液，盖满痰膜，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色5分钟。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。
　　3、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。
4、自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色1分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。
5、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。
6、滴加亚甲蓝复染液，染色30秒钟。
7、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去标本上剩余的水。待玻片干燥后镜检。
一张染色合格的痰玻片，由于被亚甲蓝染色而呈亮蓝色。将染色后的玻片放置在报纸上，如果报纸上的文字透过痰膜不能被看清，表明该玻片涂抹过厚。
　　三、显微镜检查
1、使用10倍目镜双目显微镜读片。
2、取染色完毕且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。首先使用40倍物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态；移开40倍物镜，在玻片上滴1～2滴镜油，使用100倍油镜进行细致观察。在淡蓝色的背景下，抗酸菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。为防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁镜头直接接触玻片上的痰膜。
3、读片方法：首先应从左向右观察相邻的视野；当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推。通常10×20 mm大小的痰膜，使用100倍油镜，每行可观察100个视野，观察三行则约为300个视野。仔细观察完300个视野，一般至少需要5分钟以上。油镜观察，可见单个存在的，也能看到聚集成簇或分枝状排列的菌体，染色良好痰标本，可见菌体内着色较深的异染颗粒。
　　四、镜检结果报告与登记
　　痰涂片镜检的结果报告，不仅是对结核病的诊断提供依据，报告的数量也一定程度的反映疾病严重程度和传染性的大小。痰涂片镜检结果的登记应按照镜检结果的分级报告标准登记在结核病细菌学实验室登记本上和痰检验单上。不能只填写阴性、阳性或(－)、( + )等。
萋尼氏染色镜检结果分级报告标准
抗酸杆菌阴性 (－)：连续观察300个不同视野未发现抗酸杆菌。
报告抗酸杆菌菌数：1～8条/300视野。
抗酸杆菌阳性（1＋）：3～9条/100视野。
抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条抗酸杆菌/10视野。
抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9条抗酸杆菌/每视野。
抗酸杆菌阳性（4＋）：≥10条抗酸杆菌/每视野。
五、抗酸染色玻片的处理
阅读完萋尼氏染色玻片后，应立即用浸满二甲苯（分析纯）的擦镜纸揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。经脱油干燥后的玻片，按实验室序号及涂片编号放置在玻片盒中，存放在阴凉干燥的环境中，以备复检或质控抽检。
六、痰涂片抗酸染色检查注意事项
　　痰涂片抗酸染色检查要注意预防假阳性和假阴性结果的产生。假阳性是指将阴性涂片错误判读为阳性，假阴性是指将阳性涂片错误判读为阴性。属于技术因素的影响要通过一系列实验室内和实验室间的质量控制不断改善。
　　（一）假阳性结果的预防措施
1、必须使用新的载玻片进行痰涂片检查。
2、每个标本均使用一个新竹签完成制片涂抹。
3、所有染液均经过过滤。
4、染色时玻片彼此之间保持一定距离，相互彻底分隔开
5、严禁使用染色缸将玻片放置一起染色。
6、染色时勿使玻片上的染液干燥。
7、滴加镜油时，严禁容器滴口直接接触玻片痰膜。
8、严禁物镜镜头直接接触玻片痰膜。
9、完整、准确的标注痰盒、玻片和实验室登记本的各项内容。
10、登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。　　
11、认真按照要求读片，准确记录和报告结果。
　　（二）假阴性结果的预防措施
　　1、确认标本是痰而非唾液。
2、确认每份标本至少有3 ml。
3、选择脓样、干酪样、粘液分泌物涂抹制备玻片。
4、制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。
5、使用高质量染料、严格按照配方配制染液。
6、严格按照操作程序完成染色过程。
7、判断结果为“阴性”前，必须阅读规定要求的视野数。
8、作为对照，可采用已知结果为阳性的玻片，完成染色镜检过程。
9、完整、准确地标注痰盒、玻片和实验室登记本。
10、登记前对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。
11、准确记录和报告结果。
　　七、痰玻片的保存
　　（一）镜检后的涂片应及时用浸满二甲苯的擦镜纸彻底去除涂片上的镜油。
（二）再次核对实验室登记本与每张涂片实验序号。
（三）严禁在涂片上标记镜检的阴、阳性结果。
（四）按实验室登记本序号连续排列全部涂片，存放于玻片盒内。
（五）涂片保存与实验室登记本记录应保持一致。初诊病人第一张涂片存入涂片盒后需预留出两个空位置，以备第二张、第三张涂片检查后放入。
（六）保存近期3个月的全部痰涂片待各级实验室质量控制抽检，如果年涂片量不足500张，必须全部保存。
　　（七）装满涂片的玻片盒，需用标签注明涂片实验序号区间和日期区间，以便日后盲法复检或现场评价时抽样。
八、实验室管理
　　（一）显微镜日常维护
显微镜作为发现涂片阳性病人的重要设备，实验室工作人员应正确使用并给予正确维护，以保证其正常工作和延长使用寿命。在使用和维护显微镜时应特别遵守下列要点：
1、显微镜应放置在干燥、无尘和通风的环境中。如果显微镜一段时期内停止使用，应拆开并放置在原包装盒内，并放置有效的干燥剂。
2、使用前和使用后必须使用擦镜纸彻底清洁物镜。
3、严禁物镜镜头直接接触玻片上痰膜。
4、使用油镜时，只能使用细螺旋调节焦距。
　　5、使用电光源显微镜时，注意电压和电流是否与仪器要求相匹配。
　　（二）耗材供应与管理
为保障痰涂片检查工作能够连续不断开展，应储存一定数量的实验耗材和相应试剂，储备量可根据工作量来进行计算，一般应准备比平均工作量高20％的相应耗材和试剂。染色试剂应由省结核病参比实验室或经省级结核病参比实验室进行了质量控制的地（市）级结核病参比实验室组织统一配制和供应，其它耗材可根据当地情况由省、地或县统一供应。各项物资、耗材按照需要供应，并保证达到质量要求。
　　（三）实验室人员安全防护
1、严格遵守实验室安全操作规程，实验室的技术人员必须经过生物安全培训后方可上岗。
2、严格遵守实验室安全操作规程，警惕分枝杆菌气溶胶的产生。
3、实验室应严格限制非实验室人员进入，减少实验室内外交叉生物污染。完成实验工作离开实验室，要关好门窗。
4、进入实验室，尽量避免携带非必需物品。实验台上不放任何与实验无关的物件或私人用品。
5、工作人员进入实验室，应穿工作服并注意着装整齐，操作时应戴口罩、帽子和手套，长发者须将头发装束在帽子内。
　 6、实验室内应保持肃静，试验过程中禁止一切与试验无关的活动，以保证集中精力完成实验操作。
7、实验室内禁止吸烟、饮食及用嘴湿润铅笔或标签等，也不要以手抚摩头面部等。
8、实验前须开启紫外灯对实验室和操作区域进行照射消毒1小时以上；实验结束后，开启紫外灯对操作区和实验室进行照射消毒2小时以上。
9、实验结束后，操作人员要用清洁剂（或肥皂）和清水充分洗净。
10、每次实验操作终止后，必须清理好实验台，所有物品归位并用70%酒精或3-5%石碳酸等有效消毒剂擦洗实验台和地面。
11、实验室中的生物危险物要根据检查项目和性质的不同，局限在相应的实验室或试验区域内，不得随意将其带到其它区域进行。
　　（四）污物消毒与处理
1、痰标本、被污染的一次性用品及实验室垃圾应经高压灭菌后丢弃，或者使用专用的焚烧炉或固定的垃圾坑进行焚烧。
2、每次完成检查后，操作台和实验区域内经紫外灯近距离照射消毒2小时以上。
3、实验过程中，如标本被打翻污染了操作台或地面，应以大于污染面积的纱布或卫生纸吸满5%的苯酚溶液或70%酒精，覆盖污染区，30分钟后方可移去，再经紫外线近距离照射。