基于加权基因共表达网络识别糖尿病视网膜病变与免疫相关的关键基因.pdf

临床研究基于加权基因共表达网络识别糖尿病视网膜病变与免疫相关的关键基因袁琳慧张立军刘 新祁媛媛引用:袁琳慧张立军刘新等.基于加权基因共表达网络识别糖尿病视网膜病变与免疫相关的关键基因.国际眼科杂志():作者单位:()中国辽宁省大连市大连医科大学附属大连市第三人民医院眼科()中国辽宁省大连市大连医科大学作者简介:袁琳慧硕士主治医师研究方向:眼底病通讯作者:张立军博士主任医师研究方向:角膜病、屈光手术.收稿日期:修回日期:摘要目的:通过生物信息学的方法探究糖尿病视网膜病变()中免疫相关的关键基因以及免疫细胞的浸润情况方法:/从 数据库获取基因芯片数据集采用“”包获得差异表达基因()并进行 功能注释和 通路富集分析基于 算法分析免疫细胞浸润情况 通过加权基因共表达网络分析()筛选与免疫相关基因模块中的 利用 在线数据库及 软件构建蛋白质互作网络利用 以及 插件进一步并筛选出关键基因结果:共筛选出上调差异基因 个下调差异基因 个 原始 细胞、血浆细胞、记忆型 细胞、调节性 细胞()、型巨噬细胞、型巨噬细胞以及中性粒细胞 种免 疫细胞显著 高 表 达(.)这种免疫细胞低表达(.)分析后与免疫最相关模块中差异基因 个构建 网络后利用插件筛选出 个关键基因利用各差异基因在 中的相关性程度进一步筛选出 个关键基因为 与 结论:利用生物信息学的方式筛选出 患者中免疫细胞浸润情况以及与免疫相关的关键基因可为 的进一步研究与诊疗提供依据关键词:糖尿病视网膜病变生物信息学加权共表达免疫浸润蛋白质互作网络差异基因免疫细胞:./.:.:().:()“”()()().().().:()(.)(.).:.:.:.()():.:/.:.引言糖尿病视网膜病变()是我国工作年龄人群中发病率最高的视网膜血管疾病其处理复杂而难治而且周期长 是近年来国内外眼科临床治疗中较为棘手的疾病之一 为探寻更好的预防、诊断与治疗方式关于 的发病机制一直是研究热点 因此我们仍需要进一步探究 的遗传标记物和治疗靶点为 的诊断和干预提供新的方法视网膜是 一 种 免 疫 特 权 组 织 血 视 网 膜 屏 障()和免疫抑制保护视网膜免受外部和内部入侵和攻击 在 发生时由于广泛的 损伤视网膜免疫特权被破坏免疫耐受性大大降低大量循环免疫细胞浸润视网膜并激活先天或后天免疫反应导致视网膜血管和神经元的进行性改变 小胶质细胞是中枢神经系统()中先天免疫系统的吞噬细胞 视网膜和视神经是中枢神经系统的外延小胶质细胞在眼部疾病的免疫发病机制中起着重要作用 小胶质细胞通过吞噬视网膜视神经节细胞()、分泌细胞毒性物质和破坏 的结构和功能参与 的发病机制 的视网膜血管损伤也与补体系统的激活密切相关 高糖环境刺激局部和全身炎症因子和趋化因子的表达增加由此导致持续存在的炎症反应被认为会促进 中血管和免疫系统的损伤诱导 的破坏进而导致黄斑水肿和视网膜新生血管的产生 上述研究表明免疫在 中起着重要作用 因此本研究旨在研究 中免疫细胞的浸润情况以及寻找 中与免疫相关差异基因为 的诊断与治疗提供新的思路 对象和方法.对象 本研究 /使 用 数 据 集 为 平台更新于 下载于 网站(:/./)该数据集包括 个 患者的视网膜前纤维血管增殖膜 个特发性黄斑裂孔患者的视网膜内界膜以及 个特发性黄斑前膜患者的黄斑前膜的基因表达量芯片检测结果为对照组.方法.筛选 差异表 达 基 因 在 语 言 环 境 下 利 用“”包对数据集中 样本以及对照样本的差异表达基因进行鉴定有差异的判定标准为校正后的 筛选出 患者的差异表达基因().功能注释和 信号通路富集分析 将筛选出来的差异表达基因导入 .数据库依据()数据库以人源基因为背景对差异表达基因进行生物学功能注释并利用()通路数据库进行信号通路的富集寻找 所富集的信号通路.免疫浸润 分析 基于基因表达数据对免疫相关通路进行分析从而对特定免疫细胞浸润情况进行考察 本研究采用 方法分析 患者与对照组间差异的免疫细胞表达水平.加权基因共表达分析使用加权基因共表达分析()分析挑选出与免疫通路相关的共表达编码基因模块 首先对样本进行聚类剔除样本中的离群众后对样本进行聚类 筛选出最佳软阈值 鉴定出共表达模块对各个模块与免疫细胞分数间的相关性进行分析 选取免疫浸润分数差异最显著的模块.蛋白质互作网络与关键基因的筛选 免疫浸润分数差异最显著的模块与 取交集后的结果进行蛋白质互作网络()分析采用 在线数据库去除没有相互作用的孤立点得到蛋白相互作用网络将该网络导入 软件使用 插件识别出总网络中相关性最强的子网络使用 插件筛选出总网络中相关性最强的 个基因 根据 以及 的结果交互选出关键()基因统计学分析:筛选差异表达基因、功能注释和 信号通路富集分析、免疫浸润 分析、加权基因共表达分析数据分析以及可视化采用 .软件进行 蛋白质互作网络与关键基因的筛选数据分析以及可视化采用 在线数据库进行 有差异的判定标准为校正后的 结果.基因差异表达结果数据经过处理后根据 的标准 患者与对照组相比共有 个基因差异表达显著其中 个基因表达上调 个基因表达下调见图、.和 富集分析结果对差异表达的基因进行 富集分析并对前 个最密集的通路进行可视化(图)对差异表达的基因进行 富集分析并对前 个最密集的通路进行可视觉化(图).免疫浸润 分析结果在 个免疫细胞中经过免疫浸润 分析对各个样本免疫细胞占比可视化见图、患者和对照组免疫细胞分数 图 基因差异表达分析火山图国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 :/.电话:电子信箱:.图 基因差异表达热图图 和 富集分析结果:富集:富集进行统计学检验以对照组相比 样本中:原始 细胞、血浆细胞、记忆型 细胞、调节性 细胞()、型巨噬细胞、型巨噬细胞以及中性粒细胞 种免疫细胞显著高表达差异均有统计学意义(.)这种免疫细胞低表达差异有统计学意义(.)见图 .:/.:.图 堆叠图图 免疫浸润差异热图图 差异箱线图:.:.:.图 样本聚类.基因加权共表达结果对样本聚类后利用欧式距离进行层级聚类(图)剔除离群值后进行样本聚类(图)根据算法选择筛选软阈值(图)对共表达模块进行鉴定并合并相似模块后得到 个共表达模块(图)各个模块与免疫细胞分数间的相关性进行分析并可视化(图)当.时选取相关性系数最高国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 :/.电话:电子信箱:.图 剔除离群值后样本聚类图 软阈值筛选图 模块的模 块 为 中 心 模 块 此 模 块 与 相关性系数最高达.因此选择此模块用于后续分析 此模块中的成员与基因显著性的相关性可视化呈现(图).与关键基因的筛选将棕色模块中的基因与.得到的 取交集筛选出棕色模块中的差异基因 个 将这 个基因进行蛋白质互作分析代入 数据库中得到蛋白质互作网络(图)利用 .:/.:.图 共表达模块与免疫细胞分数的相关性图 棕色模块与基因的显著性的相关性软件 中 的 插 件 识 别 核 心 子 网 络(图)与 插件得到的 表达基因相交集得到 个基因:、(图)根据这 个基因在 网络中相关性程度选取相关程度前 的为关键基因最终筛选出 个关键基因:以及(图)讨论本研究通过生物信息学的方法筛选 患者视网膜组国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 :/.电话:电子信箱:.图 网络图 子网络图 表达基因织与对照组的 富集结果发现差异基因均富集于与免疫反应相关的通路上 富集于细胞因子受体作用通路、神经活性配体受体相互作用通路、信号通路、化学信号通路以及钙信号通路等通过免疫浸润分析筛选出与 高度相关的免疫细胞后结合 的方法再此筛选出免疫相关的 利用 中的两组插件结合差异基因的表达量筛选出 个关键基因:以及 这 个关键基因在 组中均表达上调 由于 是慢性炎症性损伤导致的血管损伤性疾病所以炎症相关的差异基因上调比例远远高于下调在生物信息学分析的过程中不断缩小筛选 .:/.:.图 相关性可视化范围后下调基因被过滤掉导致本研究结果中的关键基因表达均呈现上调状态免疫浸润分析后原始 细胞、血浆细胞、记忆型 细胞、调节性 细胞()、型巨噬细胞、型巨噬细胞以及中性粒细胞 种免疫细胞显著高表达其中活化的记忆型 细胞模块相关性最高且差异表达最为显著(.)这一结果证明 与免疫系统的激活密切相关 且研究表明记忆型 细胞的活化主要依赖于葡萄糖的糖酵解过程在对于 型糖尿病的研究中发现记忆型 细胞在 型糖尿病患者体内持续存在且高表达这会导致难以通过免疫抑制治疗改善患者的胰岛素抵抗情况 我们推测记忆型 细胞的存在 中同样会导致视网膜免疫抑制的破坏促进 的发生与发展 大同源相关蛋白()以及极光激酶()均可影响细胞 的 有 丝 分 裂 过 程 且 均 可 在 纺 锤 体 上 定 位 到 是一种细胞周期调控基因的表达产物被证实在多种癌症疾病中通过调控细胞周期产生作用随着 表达量的升高癌症细胞的侵袭性也呈现上升状态所以其被认为是一种致癌蛋白 也被认为是潜在 的 型 糖 尿 病 的 靶 点 可 参 与 激 活 通路可通过各种生长因子、促血管因子促进 的发展 极光激酶()是极光激酶家族成员之一为蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶 是一个重要的有丝分裂调节因子参与多种有丝分裂事件的调节同样 也在多种癌症中起到促进癌症发生、发展的作用 在 的相关研究中实验证明在高氧诱导视网膜新生血管()小鼠模型视网膜中 表达增高抑制 活性可以抑制血管内皮细胞增殖、迁移和小管形进而抑制新生血管的产生综上本研究筛选了 中 个免疫相关靶基因所有这些基因都富集于记忆型 细胞相关通路 与 可作为 诊断和治疗的潜在靶点然而仍需要进一步的研究来确认靶基因与免疫浸润之间的关系并确定靶基因和免疫浸润谱在 发生、发展中的作用参考文献 .:.:.:.:.:.():.:.():国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 :/.电话:电子信箱:.:.():.():.:.:.:.():.():.:刘悦越 国泰 李琦涵.记忆性 细胞的形成及其影响因素.细胞与分子免疫学杂志():.():.():.():.:.().():.:.().():.():.():魏丽娟 苏秀兰.的致癌机制以及在非小细胞肺癌诊断与治疗中的价值.中国组织化学与细胞化学杂志():.:./.():.:.():宦晨阳.在视网膜新生血管中的作用与机制研究.中国人民解放军海军军医大学 .:/.:.