基于mt-roGFP1探针研究除草化合物对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响.pdf

朱雪珍,张晓红,桑杰,等.基于 mt-roGFP1 探针研究除草化合物对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响 J.华南农业大学学报,2023,44(4):539-548.ZHUXuezhen,ZHANGXiaohong,SANGJie,etal.EffectsofherbicidalchemicalsonredoxpotentialsofArabidopsis thalianaroottipcellsbasedonmt-roGFP1probeJ.JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity,2023,44(4):539-548.基于 mt-roGFP1 探针研究除草化合物对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响朱雪珍，张晓红，桑杰，周利娟(华南农业大学植物保护学院/绿色农药全国重点实验室,广东广州510462)摘要:【目的】研究几种代表性商品化除草剂以及植物源除草化合物小檗碱及其类似物对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响。【方法】以靶向线粒体的氧化还原敏感绿色荧光蛋白（Mitochondriatargetedredox-sensitivegreenfluorescentprotein,mt-roGFP1）标记的拟南芥转基因植株为材料，采用不同质量浓度的化合物处理不同时间后，测定拟南芥根冠、分生区、过渡区和伸长区的细胞氧化还原电位的变化。【结果】经几种商品化除草化合物处理后，拟南芥根部分生区的细胞氧化还原电位最小。从分生区到伸长区氧化还原电位逐渐增大，呈现逐渐被氧化的趋势。其中，光系统 II 抑制剂(莠去津和环嗪酮)的氧化还原电位变化规律最为明显，说明 mt-roGFP1 荧光探针能较好地响应光系统 II 抑制剂。氨基酸生物合成抑制剂草甘膦对拟南芥根尖细胞氧化还原的影响具有明显的剂量效应关系，随着草甘膦质量浓度增加，氧化还原电位变化量也逐渐增大，呈正相关关系(R2=0.9956)。小檗碱及其类似物处理后，大多数处理组的拟南芥根尖细胞的氧化还原电位在分生区达到最大还原值，并从分生区开始逐渐被氧化。【结论】研究结果可以为应用 roGFP 荧光探针技术研究除草化合物对根系细胞线粒体的作用机制提供基础。关键词:拟南芥；绿色荧光蛋白；氧化还原电位；除草化合物中图分类号:S482.4文献标志码:A文章编号:1001-411X(2023)04-0539-10Effects of herbicidal chemicals on redox potentials of Arabidopsisthaliana root tip cells based on mt-roGFP1 probeZHUXuezhen,ZHANGXiaohong,SANGJie,ZHOULijuan(CollegeofPlantProtection,SouthChinaAgriculturalUniversity/NationalKeyLaboratoryofGreenPesticide,Guangzhou510462,China)Abstract:【Objective】Theaimofthisstudywastoinvestigatetheeffectsofseveralcommercialherbicidesand the botanical herbicidal compound berberine and its analogues on the redox potential of Arabidopsisthaliana root tip cells.【Method】A.thaliana transgenic plants marked with mitochondria targeted redox-sensitivegreenfluorescentproteinwereusedasplantmaterials.Thechangesofcellredoxpotentialinrootcap,proximalmeristem,transitionzoneandelongationzoneweremeasuredafterbeingtreatedwithdifferentmassconcentrationsofherbicidesfordifferenttime.【Result】Theredoxpotentialoftheproximalmeristematiczone收稿日期：20220701网络首发时间：2023051713:55:51首发网址：https:/ the most obvious,indicating that mt-roGFP1 fluorescent probe could respond better tophotosystemIIinhibitors.Theeffectofglyphosate,anaminoacidbiosynthesisinhibitor,ontheredoxpotentialofA.thalianaroottipcellsshowedanobviousdose-responsemanner.Withtheincreaseofmassconcentration,thechangeoftheredoxpotentialalsograduallyincreased,showingapositivecorrelationwithR2=0.9956.Afterthetreatmentofberberineanditsanalogues,theredoxpotentialofA.thalianaroottipcellsinmosttreatmentgroupsreachedthemaximumreductionvalueintheproximalmeristematiczone,andwasgraduallyoxidizedfromthemeristematiczone.【Conclusion】TheseresultsprovideabasisforapplyingroGFPfluorescenceprobetechnologytostudyingthemechanismofherbicidalcompoundsactingonrootcellmitochondria.Key words:Arabidopsisthaliana;Greenfluorescentprotein(GFP);Redoxpotential;Herbicidalcompound活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)是植物有氧代谢以及逆境代谢过程中的产物。活性氧参与植物的生长发育、细胞循环、细胞的程序性死亡、激素信号等生物过程，是调控各种生物和非生物胁迫反应的重要信号分子1-2。活性氧的性质极为活泼，它的产生伴随着植物正常的有氧代谢，当植物受到环境胁迫时，如除草剂等外源化合物的胁迫，会诱导活性氧的产生3-4。活性氧含量一旦超出了植物的清除能力，就会与蛋白质、脂类和 DNA 等大分子物质发生反应，引起酶活性降低、膜透性增强及突变增加，造成植物体细胞的氧化损伤甚至死亡5。活性氧水平的内源性变化发挥着信号功能，并在适应环境变化方面发挥积极作用6-8。所以测定植物体细胞内 ROS 含量的动态变化对研究植物体内活性氧的具体作用机制、ROS 信号转导网络以及植物的生长发育等具有重要意义。利用氧化还原敏感绿色荧光蛋白(roGFP)检测活体氧化还原电位，是将一个本身不含二硫键且对生物系统没有影响的蛋白，特异性地表达并定位到特定的亚细胞结构中的方法，可以无损伤地检测活细胞内的氧化还原电位。相比荧光染料9-11，roGFP探针因具备非破坏性、局域测定、可逆、实时和动态的优势，成为评估细胞内氧化还原状态的一种手段，适用于许多生物和细胞类型9,12-17。当 roGFP 感应系统可用于哺乳动物系统后，不同的 roGFPs(roGFP14，roGFP-iX)已被用作氧化还原传感器18-25，广泛应用于各个领域，从哺乳动物到植物，尤其是在模式生物拟南芥中。且 roGFP 在线粒体(Mitochondria-roGFP，mt-roGFP)中反映氧化还原电位的能力优于在细胞质(Cytoplasm-roGFP，c-roGFP)的3。目前对拟南芥氧化还原电位影响的研究集中在干旱胁迫、高低温和盐溃等非生物逆境中，研究除草化合物对拟南芥氧化还原电位影响的相对较少。本试验测定不同作用机理的几种商品化除草化合物和具有除草活性的植物源化合物小檗碱及其类似物26-27对 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株根尖的根冠、分生区、过渡区和伸长区在不同测定质量浓度和时间下的氧化还原电位的影响，以期填补外源除草化合物胁迫下拟南芥细胞氧化还原电位变化的研究空白，分析除草化合物处理对植物细胞氧化还电位影响的变化规律，研究其对植物细胞起作用的方式，为应用 roGFP 探针技术研究除草化合物的作用机理提供新思路和理论依据。1 材料与方法 1.1 试验材料拟南芥 Arabidopsis thalianaL.Col 生态型，mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株由加州大学伯克利分校FeldmanLewisJ教授提供。超净工作台购自苏净集团安泰空气技术有限公司；LRH-300-G光照培养箱购自广东省医疗器械厂；ZeissAxiowert 荧光显微镜购自德国 ZEISS公司。二甲戊灵、草甘膦：浙江新安化工集团股份有限公司；氟乐灵、草铵膦：江苏辉丰农化股份有限公司；莠去津：利尔化学股份有限公司；环嗪酮：浙江欣禾化工有限公司；小檗碱：Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司；二氢小檗碱：四川省维克奇生物科技有限公司；次氯酸钠(分析纯)、赤霉素(分析纯)、KNO3、NH4NO3、Ca(NO3)2、FeSO47H2O、MgSO47H2O、MnSO44H2O、CuSO45H2O、540华南农业大学学报(https:/ 和 Na2-EDTA(分析纯)购自广州化学试剂厂；其他化合物均购自成都瑞芬思生物科技有限公司。1.2 方法1.2.1mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株的培养采用竖直培养皿法3培养 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株。配制 1/2MS 培养基，并用 1mmol/L 的 NaOH 溶液调节 pH 至 5.75.8，最后加入 10g/L 的琼脂粉，121 高温灭菌20min，放置干净无菌环境备用。整个种植试验均在超净工作台进行，先将 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因种子放入无菌的 2mL 离心管中，用异丙醇溶液清洗消毒5min，然后用 1.5%()的次氯酸钠溶液充分浸泡10min，再用无菌水清洗 34 次，直至洗出液变为透明，在 4 冰箱放置 23d，使种子春化以备用。将待用仪器及培养皿、培养基等放入超净工作台紫外灭菌 30min。用移液枪吸取 20mL加热溶化后的 1/2MS 培养基到 10cm10cm 方形培养皿中，待其完全冷却凝固。用无菌水将春化后的 mt-roGFP1标记的拟南芥转基因种子清洗 34 次，用移液枪均匀播种到凝固培养基上，每皿 50 颗种子，待水分完全蒸发后，封口膜封口。将培养皿竖直放置在光照强度4000lx、（221）、16h光8h暗的光照培养箱培养 7d。1.2.2拟南芥根尖透明化待 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株生长至 7d，挑选长势一致、健康的拟南芥幼苗。将拟南芥植株用细胞透明液(HGGsolution)透明化28后，使用 ZeissAxiowert 荧光显微镜拍摄。细胞透明液的配制：准确称取 80gddH2O 和三氯乙醛溶液，加入 10mL 甘油和 30mLddH2O，室温下搅拌混匀并放置 35h。选择长势一致的 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株，直接放入细胞透明液中浸泡 1min，用镊子轻轻取出，放在有 1 滴 10%()甘油的干净载玻片上，制片，在荧光显微镜(DIC 通道)下拍摄其明场图片。1.2.3氧化还原电位的测量及分析参考 Jiang 等29的方法，待 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株生长 7d 后，挑选长势一致健康的拟南芥幼苗用作试验。荧光测量采用 ZeissAxiowert 荧光显微镜，激发波长设置为 410nm(DAPI 通道)和 470nm(GFP 通道)，荧光值为 505530nm发射波长。选择长势一致的 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株，放在含有 1 滴 10%()甘油的干净载玻片上，制成玻片，在荧光显微镜(410nm/470nm 通道)下拍摄荧光图片，测量荧光强度，通过减去相邻无细胞区域的荧光强度来校正每幅图像的背景荧光强度，计算 410 与 470nm 荧光强度比率。将同一拟南芥用外源化合物处理一定时间，重新测定 410 与 470nm荧光比率；再将同一拟南芥用 100mmol/LH2O2溶液和 DTT 溶液处理 15min，重新测定 410 与 470nm荧光比率，即为最大和最小氧化还原电位时比率，最大氧化条件(100mmol/LH2O2溶液)下的最大比值设定为 1.00，最大还原条件(100mmol/LDTT 溶液)下测得的最小比值设定为 0.00，将最大还原值和氧化值归一化，然后使用生成的校准曲线将这些标准化的荧光比率转换成氧化还原电位29。这些根尖的图像在 5min 或更短时间内被拍摄并测量保存。在根冠、分生区、过渡区及伸长区中分别测量根尖的氧化还原电位。以 Schwarzlnder 等30的方法计算氧化还原电位。OxDroGFP氧化还原程度()计算如下：OxDroGFP=RRred(I470red/I470ox)(RoxR)+(RRred)，(1)式中，R 为 410、470nm 时的荧光强度比率；Rred为使用 100mmol/LDTT 溶液处理时完全还原的荧光强度比率；Rox：使用 100mmol/LH2O2溶液处理时完全氧化的荧光强度比率；I470ox为完全氧化形式下 470nm 时的荧光强度；I470red为完全还原形式下470nm 时的荧光强度。氧化还原电位(O)计算如下：O=E0roGFP2.303RTZFlg1OxDroGFPOxDroGFP,(2)E0roGFP式中，为 roGFP 的中点电位(272mV，25.15，pH=7)；R 为气体常数(8.314Jmol1K1)；为温度(298.15K，25.15)；Z 为转移电子数(2)；F 为法拉第常数(96485.34Cmol1)。1.2.4除草化合物对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响选取不同作用机理的商品化除草剂(氨基酸生物合成抑制剂草甘膦和草铵膦、微管组装抑制剂二甲戊乐灵和氟乐灵、光系统 II 抑制剂莠去津和环嗪酮)作为代表药剂，选择相同质量浓度(20mgL1)的不同药剂，处理 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株(15min)，研究不同作用机理除草剂对 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株根尖细胞氧化还原状态的影响。测定方法同“1.2.3”。每个处理 3 个重复。1.2.5草甘膦不同质量浓度处理对拟南芥根尖细第4期朱雪珍，等：基于 mt-roGFP1 探针研究除草化合物对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响541胞氧化还原电位的影响选择草甘膦为试验药剂，用相同质量浓度草甘膦、不同时间来处理 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株，研究不同作用时间对 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株根尖细胞氧化还原状态的影响。用不同质量浓度草甘膦来处理 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株，研究不同质量浓度草甘膦对 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株氧化还原状态的影响。测定方法同“1.2.3”。每个处理 3 个重复。1.2.6小檗碱及其类似物处理对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响选择小檗碱及其 10 种类似物做测试药剂，用相同质量浓度化合物来处理 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株，研究小檗碱及其 10 种类似物对拟南芥根尖细胞氧化还原状态的影响。测定方法同“1.2.3”。每个处理 3 个重复。1.3 数据处理用 Excel2010 处理数据，测定的数据均以“平均数标准误”表示，试验重复 3 次，相关试验数据均用 SPSS20.0 统计，方差分析采用邓肯氏新复极差多重比较法(Duncansmultiplerangertest，DMRT)，数据处理由 Office2016 及 OriginPro9.0 完成。2 结果与分析 2.1 拟南芥根尖细胞氧化还原电位测定挑选长势一致健康的 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株幼苗，经透明化处理后制片观察，并按“1.2.3”中的根尖分区测量拟南芥根尖根冠、分生区、过渡区和伸长区的荧光强度变化(图 1)。在 410和 470nm 通道下拍摄 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株根尖的荧光强度图(图 2A、2B)、荧光强度高度转化图(图 2C、2D)和荧光强度高度转化分区图(图 2E、2F)。从图 2 可以看出，生长 7d 的拟南芥根尖分生区的荧光强度最大，根冠和分生区的最远端部分荧光强度较弱，随着近端分生组织细胞停止分裂并逐渐进入过渡区，荧光强度逐渐减弱。当从过渡区进入伸长区时，荧光强度则变得更弱。2.2 氨基酸生物合成抑制剂草甘膦和草铵膦对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响草甘膦和草铵膦对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响见图 3A、3D。20mgL1草甘膦处理拟南芥 15min 后，根冠、分生区、过渡区和伸长区的氧化还原电位分别为350.88、351.82、340.72 和334.48mV，从根冠到分生区呈现被还原趋势，从分生区到伸长区呈现出逐渐被氧化的趋势(图 3A)。氧化还原电位变化量分别为 29.68、22.77、19.98 和 11.61mV，各分区的氧化还原电位变化量之间存在显著性差异（图 3D）。20mgL1草铵膦处理拟南芥 15min 后，根冠、分生区、过渡区和伸长区的氧化还原电位分别为291.42、308.04、313.18 和310.43mV，根冠达到最大电位，从根冠到过渡区呈现出逐渐被还原的趋势，在过渡区达到最小电位值，各分区的氧化还原电位值之间存在明显差异。处理前后的氧化还原电位变化量分别为3.80、15.32、19.67 和 20.43mV，各分区的氧化还原电位变化量之间存在显著性差异(图 3D)。2.3 微管组装抑制剂二甲戊灵和氟乐灵对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响二甲戊灵和氟乐灵对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响见图 3B、3E。二甲戊灵处理拟南芥15min 后，根冠、分生区、过渡区和伸长区的氧化还原电位分别为333.02、342.85、328.21 和320.24mV，从根冠到分生区呈现出逐渐被还原的趋势，在分生区达到最小电位后，从分生区到伸长区呈现出逐渐被氧化的趋势，在伸长区达到最大电位(图 3B)，各分区的氧化还原电位之间存在明显差异。处理前后的氧化还原电位变化量分别为6.55、1.25、0.86 和4.57mV，分生区和过渡区氧化还原电位变化量之间没有显著性差异(图 3E)。20mgL1氟乐灵处理拟南芥 15min 后，根冠、分生区、过渡区和伸长区的氧化还原电位分别为352.74、357.08、343.61 和339.95mV，从根冠PMRCBATZEZ50 m小圆直径为 30m；RC：根冠；PM：分生区；TZ：过渡区；EZ：伸长区Smallcirclediameteris30m;RC:Rootcap;PM:Proximalmeristem;TZ:Transitionzone;EZ:Elongationzone图 1 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株根尖透明化(A)及荧光分区(B)Fig.1 Root tip transparency(A)and fluorescence zoning(B)of mt-roGFP1 labeled transgenic Arabidopsisthaliana plants542华南农业大学学报(https:/ mm50010 00020 00030 000 Z100 150 200 250 300 350 400 450 500550 600Xm50010 00020 00030 000 Z100 150 200 250 300 350 400 450 500550 600Xm50020 00040 000Z100 150200250300 350 400 450 500550 600Xm50010 00020 00030 000Z100 150 200 250 300 350 400 450 500550 600 X50 mBADCFEA、C、E：410nm(DAPI)通道；B、D、F：470nm(GFP)通道；A、B:荧光强度图；C、D:荧光强度高度转化图；E、F:荧光强度高度转化分区图A,C,E:410nm(DAPI)channel;B,D,F:470nm(GFP)channel;A,B:Fluorescenceintensitydiagram;C,D:Fluorescenceintensity-heightconversiondiagram;E,F:Fluorescenceintensity-heightconversionzoningmap图 2 拟南芥根尖荧光强度图Fig.2 Fluorescence intensity diagram of root tip of Arabidopsis thaliana360340320300280伸长区Elongationzone过渡区Transitionzone分生区Proximalmeristem根尖细胞Root tip cell氧化还原电位/mVRedox potential草甘膦 Glyphosate草铵膦 Glufosinate根冠Root cap氧化程度更高More oxidized氧化程度更高More oxidized氧化程度更高More oxidizedA360340320300280伸长区Elongationzone过渡区Transitionzone分生区Proximalmeristem根尖细胞Root tip cell氧化还原电位/mVRedox potential二甲戊灵 Pendimethalin氟乐灵 Trifluralin根冠Root capB360340320300280伸长区Elongationzone过渡区Transitionzone分生区Proximalmeristem根尖细胞Root tip cell氧化还原电位/mVRedox potential莠去津 Atrazine环嗪酮 Hexazinone根冠Root capC01010203040adbcc氧化还原电位变化量/mVChange of redox potentialadbD草甘膦 Glyphosate草铵膦 Glufosinate伸长区Elongationzone过渡区Transitionzone分生区Proximalmeristem根尖细胞Root tip cell根冠Root capaadbccab01010203040氧化还原电位变化量/mVChange of redox potentialE二甲戊灵 Pendimethalin氟乐灵 Trifluralin伸长区Elongationzone过渡区Transitionzone分生区Proximalmeristem根尖细胞Root tip cell根冠Root capbbaaaabbc01010203040氧化还原电位变化量/mVChange of redox potentialF莠去津 Atrazine环嗪酮 Hexazinone伸长区Elongationzone过渡区Transitionzone分生区Proximalmeristem根尖细胞Root tip cell根冠Root cap同种除草剂处理间的不同小写字母表示不同部位差异显著(P0.05，Duncans 法)Differentlowercaselettersofthesameherbicideamongdifferentpartsindicatesignificantdifferences(P0.05,Duncansmethod)图 3 不同作用机理商品化除草剂对拟南芥根尖细胞的氧化还原电位及变化量的影响Fig.3 Effects of commercial herbicides with different action mechanisms on redox potential and its changes of Arabidopsisthaliana root tip cells第4期朱雪珍，等：基于 mt-roGFP1 探针研究除草化合物对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响543到分生区呈现出逐渐被还原的趋势，在分生区达到最小电位后，从分生区到伸长区呈现出逐渐被氧化的趋势，在伸长区达到最大电位，各分区的氧化还原电位之间存在明显差异(图 3B)。处理前后的氧化还原电位变化量分别为 2.96、14.36、11.99 和2.64mV，各分区的氧化还原电位变化量之间存在显著性差异(图 3E)。2.4 光系统抑制剂莠去津和环嗪酮对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响莠去津和环嗪酮对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响见图 3C 和图 3F。20mgL1莠去津处理拟南芥 15min 后，根冠、分生区、过渡区和伸长区的氧化还原电位分别为345.70、360.72、335.48 和329.08mV，从根冠到分生区呈现出逐渐被还原的趋势，在分生区达到最小电位后，从分生区到伸长区呈现出逐渐被氧化的趋势，在伸长区达到最大电位，各分区的氧化还原电位之间存在明显差异(图 3C)。处理前后的氧化还原电位变化量分别为 13.06、10.96、10.99 和 12.47mV，分生区和过渡区氧化还原电位变化量之间没有显著性差异(图 3F)。20mgL1环嗪酮处理拟南芥 15min 后，根冠、分生区、过渡区和伸长区的氧化还原电位分别为341.59、356.23、329.06 和319.47mV，从根冠到分生区呈现出逐渐被还原的趋势，在分生区达到最小电位后，从分生区到伸长区呈现出逐渐被氧化的趋势，在伸长区达到最大电位，各分区的氧化还原电位值之间存在明显差异(图 3C)。处理前后的氧化还原电位变化量分别为 8.92、8.43、3.61 和 1.49mV(图 3F)。从不同作用机理商品化除草剂对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响可以看出，除草铵膦外的5 种化合物的氧化还原电位均在分生区达到最小值，随后从过渡区到伸长区逐渐变大。2.5 草甘膦不同处理时间对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响20mgL1草甘膦不同处理时间对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响见图 4A。拟南芥经20mgL1的草甘膦处理 24、48、72h 后，24 和 48h时的拟南芥生长状况良好，处理 72h 时，拟南芥出现软化黄化情况。处理 24h 后，根冠、分生区、过渡区和伸长区的氧化还原电位分别为373.88、373.39、371.41 和369.17mV，根冠与分生区的氧化还原电位之间没有显著差异。处理 48h 后，根冠、分生区、过渡区和伸长区的氧化还原电位分别为367.95、369.91、366.36 和366.33mV，分生区与其他 3 个分区的氧化还原电位之间存在显著差异。处理 72h 后，根冠、分生区、过渡区和伸长区的氧化还原电位分别为369.52、372.26、371.51 和374.43mV，分生区与过渡区的氧化还原电位之间不存在显著差异，其他分区间存在显著差异。从草甘膦(20mgL1)处理 24、48、72h对拟南芥氧化还原电位的影响(图 4A)中可以看出，24和48h 的氧化还原电位都从分生区到伸长区逐渐呈01020304050aAaCbAcCcBaBcAbBbAdCaA氧化还原电位变化量/mVChange of redox potentialbB伸长区Elongationzone过渡区Transitionzone分生区Proximalmeristem根尖细胞Root tip cell根冠Root cap330340350360370380390cBaAaBbBaAbBbBbAcBaAaA氧化还原电位/mVRedox potentialcBAB伸长区Elongationzone过渡区Transitionzone分生区Proximalmeristem根尖细胞Root tip cell根冠Root cap氧化程度更高More oxidized 24 h 48 h 72 h柱子上不同小写字母表示同一时间不同部位处理差异显著，不同大写字母表示同一部位不同处理时间差异显著(P0.05，Duncans 法)Differentlowercaselettersonthecolumnsindicatesignificantdifferencesamongdifferentpartsatthesametime,anddifferentuppercaselettersindicatesignificantdifferencesamongdifferenttreatmenttimeofthesamepart(P0.05,Duncansmethod)图 4 草甘膦不同处理时间对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响Fig.4 Effect of glyphosate with different treatment time on redox potential of Arabidopsis thaliana root tip cells544华南农业大学学报(https:/ 72h 的氧化还原电位从分生区到伸长区逐渐被还原，在伸长区达到最大还原状态。拟南芥经 20mgL1草甘膦处理 24h 后，在过渡区达到最大氧化还原电位变化量为 32.05mV，在伸长区达到最小氧化还原电位变化量(22.14mV)，根冠与分生区的氧化还原电位变化量之间没有显著性差异，其他各分区的变化量之间都存在显著性差异(图 4B)。处理 48h 后，在根冠达到最大氧化还原电位变化量(28.36mV)，在伸长区达到最小氧化还原电位变化量为 18.21mV，根冠与过渡区的氧化还原电位变化量之间没有显著性差异，其它各分区的变化量之间都存在显著差异(图 4B)。处理72h 后，在分生区到最大氧化还原电位变化量(35.93mV)，在伸长区达到最小氧化还原电位变化量(23.45mV)，各分区的氧化还原电位变化量之间都存在显著差异(图 4B)。每个处理时间的氧化还原电位变化阈值之间相差约10mV，氧化还原电位变化量与处理时间之间未呈现显著的相关性(图 5)。2.6 不同质量浓度草甘膦处理对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响不同质量浓度的草甘膦处理对拟南芥根尖细胞氧化还原电位影响显著(图 5A)。处理质量浓度为 10mgL1时，在根冠达到最小电位(368.72mV)，在伸长区达到最大电位(338.64mV)；处理质量浓度为 20mgL 1时，在分生区达到最小电位(351.82mV)，在伸长区达到最大电位(334.48mV)；处理质量浓度为 50mgL1时，在伸长区达到最小电位(367.14mV)，在根冠达到最大电位(361.35mV)。10 和 20mgL1的氧化还原电位均在分生区达到最小，在伸长区达到最大，50mgL1的氧化还原电位呈现逐渐降低的趋势。从氧化还原电位变化量(图 5B)来看，10 和20mgL1草甘膦处理的变化量有显著性差异，但在过渡区和伸长区的氧化还原电位变化量未发生明显变化(图 5)，50mgL1草甘膦处理时，氧化还原电位变化量变大。3 个质量浓度的氧化还原电位变化量在根冠及过渡区之间均呈现显著性差异。草甘膦质量浓度增大，mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株的氧化还原电位变化量增大，说明氧化还原电位变化量与质量浓度大小之间存在相关性，线性回归方程为 y=0.29x+21.57，R2=0.9956。2.7 小檗碱及其类似物处理对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响20mgL1小檗碱及其类似物处理拟南芥 15min后，拟南芥根尖各分区细胞氧化还原电位和氧化还原电位变化量如图 6 所示。氧化还原电位的结果(图 6A)表明，小檗碱及其类似物对拟南芥根尖细胞的氧化还原电位均有影响。经小檗碱、盐酸血根碱、白屈菜碱、D四氢药根碱、罗通定处理后，拟南芥根部各分区细胞氧化还原电位多数从根冠开始呈现逐渐被氧化趋势，在伸长区达到最大氧化电位，且各分区氧化还原电位之间都存在明显差异。经巴马汀、二氢小檗碱、去亚甲基小檗碱、甲基黄连碱处理后，拟南芥根部细胞氧化还原电位从根冠到分生区呈现被还原趋势，且在分生区达到最大还原值。氧化还原电位的变化量结果(图 6B)表明，小檗01020304050cBaAaAaAaBcCaAbBbBbAaB氧化还原电位变化量/mVChange of redox potentialaC伸长区Elongationzone过渡区Transitionzone分生区Proximalmeristem根尖细胞Root tip cell根冠Root capcCcAaBcCcAaBbBbAbCaBaAcC330340350360370380390氧化还原电位/mVRedox potentialAB伸长区Elongationzone过渡区Transitionzone分生区Proximalmeristem根尖细胞Root tip cell根冠Root cap氧化程度更高More oxidized 10 mg/L 20 mg/L 50 mg/L柱子上不同小写字母表示同一质量浓度不同部位处理差异显著，不同大写字母表示同一部位不同质量浓度处理差异显著(P0.05，Duncans 法)Differentlowercaselettersonthecolumnsindicatesignificantdifferencesamongdifferentpartsunderthesamemassconcentration,anddifferentupper-caselettersindicatesignificantdifferencesofthesamepartamongdifferentmassconcentrations(P0.05,Duncansmethod)图 5 不同质量浓度草甘膦对拟南芥根尖细胞氧化还原电位变化的影响Fig.5 Effects of different concentrations of glyphosate on redox potential of Arabidopsis thaliana root tip cells第4期朱雪珍，等：基于 mt-roGFP1 探针研究除草化合物对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响545碱及其类似物与对照药剂草甘膦的氧化还原电位变化量之间存在明显差异，小檗碱 4 个分区的变化量之间有明显差异，各化合物的变化量各不相同。3 讨论与结论roGFP 感应系统在检测植物细胞内氧化还原状态变化具有快速、可逆、动态和实时等优点，尤其是对拟南芥、烟草等模式植物的研究可探测从细胞到组织的氧化还原水平31-32。本研究在 mt-roGFP1 标记的拟南芥转基因植株根尖细胞中检测到 mt-roGFP1 探针响应外源氧化剂(H2O2)和外源还原剂(DTT)引起的氧化还原状态的变化，证明了 mt-roGFP1 探针的灵敏性和可逆性33。用外源氧化剂处理拟南芥时，mt-roGFP1 探针被氧化，其荧光强度比率升高，用外源还原剂处理时，mt-roGFP1 探针被还原，荧光强度比率降低，证明 mt-roGFP1 探针能够响应组织中氧化还原状态的改变，试验结果与前人的研究结果33相一致。基于 mt-roGFP1 探针，通过测定 6 种不同靶标商品化除草化合物对 mt-r