食管鳞癌组织中CNN2的表达及其临床意义_夏于惠.pdf

食管鳞癌组织中 CNN2 的表达及其临床意义*基金项目:浙江省消化系肿瘤微创诊治与快速康复研究重点实验室开放课题基金资助项目(21SZDSYS08)1通讯作者，E-mail:zhengjingmin enzemedcom317000浙江临海温州医科大学附属台州医院病理科夏于惠，甘梅富，潘怡晓，俞青昕，郭一青，郑敬民1【摘要】目的探讨钙调蛋白 2(CNN2)在食管癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系。方法挖掘癌症基因组图谱(TCGA)数据库中 CNN2 mNA 在食管鳞癌(ESCC)中的表达及与预后的关系;收集 2003 年 1 月至 2018 年 12月 190 例 ESCC 组织和161 例癌旁组织，采用免疫组化法检测上述组织中 CNN2 蛋白表达，并分析其与临床病理特征和预后的关系。采用 MethSurv 数据库分析食管癌中 CNN2 基因的甲基化位点。通过基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析，探讨 CNN2 和共表达基因的生物学功能和肿瘤相关通路。利用 包 GSVA 分析单样本 GSEA(ssGSEA)以评估食管癌中 CNN2 表达与肿瘤免疫浸润细胞的相关性。结果基于 TCGA 数据库，CNN2 mNA 在 ESCC 组织中的表达显著高于癌旁组织(P0.001);生存分析显示，CNN2 高水平的患者总生存期(OS)更长(P=0.006);Cox 多因素分析显示，CNN2mNA 表达水平是影响 ESCC 患者 OS 的独立因素(P=0.014)。基于 190 例 ESCC 临床标本，CNN2 蛋白在 ESCC 组织中的高表达率为 48.9%(93/190)，显著高于癌旁组织的 1.9%(3/161)，且其表达水平与分化程度、T 分期、N 分期、pTNM 分期和高血压有关(P0.05)。CNN2 蛋白高表达患者的中位 OS 为 84.0 个月，高于低表达者的 59.0 个月(P=0.034)。Cox 多因素分析显示，CNN2 蛋白表达与 OS 无关(P=0.111)。MethSurv 数据库分析显示，CNN2 基因甲基化位点 cg22902083 可能与食管癌患者较长的 OS 有关(P=0.019)。GO/KEGG 富集分析发现，CNN2 及其共表达基因参与细胞-细胞紧密连接和构建细胞骨架功能。免疫浸润分析结果显示，CNN2 的表达水平与中央记忆 T 细胞、NK CD56dim 细胞、NK 细胞在肿瘤中的浸润水平呈显著正相关(P0.001)，与 Th17 细胞、嗜酸性粒细胞和浆细胞样树突状细胞在肿瘤中的浸润水平呈显著负相关(P0.001)。结论CNN2 在食管癌组织中表达升高，其表达与临床分期和 OS 有关，并且可能通过调节细胞-细胞连接和肿瘤免疫浸润细胞在食管癌中发挥肿瘤防御因子的作用，有望成为食管癌诊治与预后预测的标志物。【关键词】食管癌;钙调蛋白 2;临床病理特征;预后;生物信息学中图分类号:735.1文献标识码:A文章编号:10090460(2023)03022510Expression and clinical significance of CNN2 in esophageal carcinomaXIA Yuhui，GAN Meifu，PAN Yixiao，YU Qingxin，GUO Yiqing，ZHENG Jingmin Department of Pathology，Taizhou Hospital，Wenzhou Medical University，Linhai 317000，ChinaCorresponding author:ZHENG Jingmin，E-mail:zhengjingmin enzemedcom【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of calmodulin 2(CNN2)in esophageal carcinoma and its relationshipwith clinicopathologic features and prognosis MethodsThe expression of CNN2 mNA of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)in The Cancer Genome Atlas(TCGA)database and its relationship with prognosis was analyzed;From January 2003 toDecember 2018，190 ESCC tissues and 161 adjacent tissues were collected，and the expression of CNN2 protein in the above tissueswas detected by immunohistochemistry，and its relationship with clinicopathological features and prognosis was analyzed MethSurvdatabase was used to analyze the methylation sites of CNN2 gene in esophageal carcinoma Through the enrichment analysis of geneontology(GO)and Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome(KEGG)，the biological functions and tumor-related pathways of CNN2and co-expression genes were discussed The correlation between the expression of CNN2 in esophageal carcinoma and tumor immuneinfiltrating cells was evaluated by using-packet GSVA analysis of single sample GSEA(ssGSEA)esultsBased on the TCGAdatabase，the expression of CNN2 mNA in ESCC tissues was significantly higher than that in adjacent tissues(P0.001);Thesurvival analysis showed that patients with high CNN2 level had longer overall survival(OS)with statistical significance(P=0.006);Cox multivariate analysis showed that the expression level of CNN2 mNA was an independent factor affecting the OS of ESCC patients522临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3(P=0.014)Based on 190 ESCC clinical samples，the high expression rate of CNN2 protein in ESCC tissue was 48.9%(93/190)，significantly higher than 1.9%(3/161)in adjacent tissues，and its expression level was related to the degree of differentiation，Tstage，N stage，pTNM stage and hypertension(P0.05)The median OS of patients with high expression of CNN2 protein was 84.0months，higher than 59.0 months of patients with low expression of CNN2 protein(P=0.034)Cox multivariate analysis showed thatCNN2 protein expression was not associated with OS(P=0.111)MethSurv database analysis showed that the methylation sitecg22902083 of CNN2 gene might be related to the longer OS of esophageal carcinoma(P=0.019)GO/KEGG enrichment analysisshowed that CNN2 and its co-expression genes were involved in cell-cell tight junction and the construction of cytoskeleton The resultsof immune infiltration analysis showed that the expression level of CNN2 was positively correlated with the infiltrating level of centralmemory T cells，NK CD56dim cells and NK cells in the tumor(P0.001)，and negatively correlated with the infiltrating level of Th17cells，eosinophils and plasmacyte-like dendritic cells in the tumor(P0.001)ConclusionThe expression of CNN2 is increased inesophageal carcinoma tissues，which is related to clinical stage and OS，and may play the role of tumor defense factor in esophagealcarcinoma by regulating the cell-cell connection of cancer cells and tumor immune infiltrating cells，which is expected to become amarker for diagnosis，treatment and prognosis prediction of esophageal carcinoma【Key Words】Esophageal carcinoma;Calmodulin 2;Clinicopathological features;Prognosis;Bioinformatics食管癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，2020 年已有 60.4 万例新诊断病例，2021 年病例数将继续增加1。在中国，90%以上的食管癌病例属于食管鳞状细胞癌(ESCC)。由于食管癌早期诊断困难，多数病例在发现时已经处于肿瘤进展期。虽然目前已有手术治疗、辅助化疗、靶向治疗以及免疫治疗等多种手段，但食管癌患者的长期生存仍然不理想。因此，迫切需要进一步探索其机制，寻找新的疾病相关标志物，并开发新的治疗方法来改善患者的预后。钙调蛋白(Calponin)是一组与肌动蛋白丝相关的调节蛋白。该家族包括 3 个成员，即:Calponin 1、Calponin 2 和 Calponin 3，分别由 CNN1、CNN2 和CNN3 基因编码2-3。Calponin 在细胞增殖、粘附、迁移、胞质分裂等生物学功能中起重要作用4。已有研究报道，CNN2 参与肝细胞癌、胰腺导管腺癌等肿瘤的发病机制5-6。此前有研究者检测了3 例 ESCC 患者的蛋白表达谱，发现 CNN2 在肿瘤组织中高表达7。除此之外，尚无研究报道 CNN2 在食管癌中的临床病理意义及可能作用。为探讨CNN2 在食管癌中可能的作用机制，本研究首次检测了 CNN2 在 ESCC 组织中的表达情况，分析其与临床病理特征的关系，并进一步采用生物信息学的方法探讨其与食管癌的关系。1资料与方法1.1病例来源本研究分为两组 ESCC 患者队列:癌症基因组图谱(TCGA)队列和临床病例队列。TCGA 队列从 TCGA 数据库(TCGA-ESCA)下载 80例 ESCC 组织和 10 例癌旁组织的基因表达数据和患者临床病理资料。其中男性 68 例，女性 12 例;年龄 3690 岁，中位年龄 57.5 岁。临床病例队列共有 190 例 ESCC 患者，其中男性 116 例，女性 74 例;年龄 4282 岁，中位年龄 62.5 岁。患者均于 2003年 1 月至 2018 年 12 月在温州医科大学附属台州医院接受根治性手术切除，且术后病理诊断为 ESCC。其中 161 例收集癌旁组织作为对照。根据第 8 版食管癌 TNM 分期标准对病例进行病理分期。排除标准:(1)术前及随访期间确诊其他恶性肿瘤，(2)术前接受抗肿瘤治疗，(3)组织学类型混合。本研究经台 州 医 院 伦 理 委 员 会 审 查 批 准(伦 理 号:K20210625)。1.2随访通过门诊复查、电话等方式进行随访，随访截止于 2022 年 5 月，无 1 例失访。总生存时间(OS)定义为手术至患者死亡或随访截止日期。1.3主要试剂兔抗人多克隆 CNN2 抗体(批号:NBP2-13848)购自美国 Novus 公司，二抗试剂盒(批号:Q7025)购自中山澳泉医疗科技有限公司。1.4免疫组化及马松三色染色免疫组化染色采用 SP 法。所有标本均经 4%中性甲醛固定，石蜡包埋，3 m 连续切片。二甲苯脱蜡，分级乙醇复水后高压修复，3%过氧化氢灭活，用 10%胎牛血清阻断30 min，与 CNN2 抗体(1 1000)在 4 孵育过夜。PBS 洗涤切片，与酶标二抗 37 孵育 30 min 后洗涤，并用二氨基联苯胺显影。同时行苏木精-伊红染色(HE)和马松三色染色。1.5结果判定由两位研究者根据切片的 CNN2染色强度分别对 CSCC 组织和癌旁组织进行盲法判622临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3读。CNN2 蛋白阳性染色呈棕黄或棕褐色颗粒，按阳性细胞百分比及染色强度计分。按阳性细胞百分比:1%计为 0 分，1%50%计 1 分，50%计 2分;按染色强度:无着色计为 0 分，浅黄色计 1 分，棕黄色计 2 分，棕褐色计 3 分。评分差异较大的切片进行重复评分，直至评分一致。两项得分相加，再依据总分进行分组:01 分为弱，2 分为较弱，3 分为中，45 分为强。根据 CNN2 蛋白水平进行生存分析，将患者分为 CNN2 低表达组(弱和较弱)和CNN2 高表达组(中和强)。1.6CNN2 甲基化分析MethSurv 数据库(https:/biitcsutee/methsurv/)是基于 TCGA 数据库提供与基因甲基化相关的生存分析的生信分析网站。本研究通过 MethSurv 数据库分析 CNN2 甲基化位点及其甲基化程度对食管癌预后的影响。1.7基因本体(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析cBioPortal 数据库(https:/wwwcbioportalorg/)整合了来自 TCGA 和国际癌症基因组 Gonsorium(ICGC)等多个数据库的数据，提供癌症基因组数据、基因组数据和临床数据的综合分析。本研究使用 cBioPortal 数据库获取 CNN2 的共表达基因信息，筛选指标为|r|0.6，P0.05，并使用 “clusterProfiler”软件包对共表达基因进行 GO 和KEGG 分析，探讨可能的生物学功能和信号通路。1.8CNN2 免疫浸润分析从 TCGA 数据库下载食管癌的每百万转录本(TPM)标准化 NA-seq 数据。用 包基因集变异(GSVA)分析单样本 GSEA(ssGSEA)，评估肿瘤样本的免疫浸润水平，并计算食管癌的免疫浸润评分。选取 6 种浸润水平与CNN2 表达水平呈正相关或呈负相关的免疫细胞进行 Spearman 相关性分析。1.9统计学分析采用 SPSS17.0 版软件处理数据。符合正态分布的计量资料比较采用独立样本 t检验，不符合者采用 Mann-Whitney U 检验;计数资料比较用卡方检验;生存分析用 Kaplan-Meier 法，并行 Log-rank 检验;多因素分析用 Cox 比例风险回归模型。以P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1基于 TCGA 数据库的分析TCGA 数据库分析显 示，与 癌 旁 组 织 比 较，ESCC 组 织 中 CNN1mNA 水平降低(P=0.036)，CNN2 mNA 水平升高(P0.001)，而 CNN3 mNA 表达水平无明显差异(P=0.793)。为 探 讨 CNN1、CNN2 及 CNN3mNA 的表达水平与患者 OS 的关系，将患者分为高表达组(mNA 水平中位数)和低表达组(mNA水平中位数)。生存分析显示，肿瘤组织中 CNN2mNA 表达水平较高的患者中位 OS 高于表达水平较低的患者(P=0.006)，而 CNN1 和 CNN3 的表达水平与 OS 无关(P0.05)。单因素分析显示，性别和 TNM 分期均与 OS 有关(P0.05)。将上述指标与 CNN2 蛋白共同纳入 Cox 多因素分析，结果显示，在 TCGA 数据库的 80 例 ESCC 患者中，性别和 TNM分期与 OS 无关(P0.05)，而 CNN2 蛋白表达水平是影响患者 OS 的独立因素(H=0.28，P=0.014)。见表 1、表 2、图 1。表 1影响 ESCC 患者 OS 的单因素分析(月)临床病理参数n中位 OS(95%CI)P年龄(岁)0.607584025.0(2.1747.83)584025.0(19.5730.43)性别0.004男6823.0(18.6527.35)女1249.0()饮酒史0.168是1929.0()否5925.0(21.8028.20)TNM 分期0.021、5425.0(7.9342.07)、2419.0(14.4023.60)CNN2 表达0.006低4019.0(17.4920.51)高4045.0(22.6167.40)表 2影响 ESCC 患者 OS 的 Cox 多因素分析因素H(95%CI)P性别(男性 vs女性)0.000(1.6536E-1738.969E+161)0.949TNM 分期(期 vs 期)1.92(0.784.73)0.159CNN2 表达(高 vs低)0.28(0.100.78)0.0142.2临床病例 ESCC 组织中 CNN2 蛋白的表达对临床病例队列 190 例 ESCC 组织进行免疫组化染色。结果显示，CNN2 蛋白表达主要分布于细胞质。其在 ESCC 组织中的高表达率为 48.9%(93/190)，高于癌旁组织中的 1.9%(3/161)，差异有统计学意722临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3A:CNN1 mNA;B:CNN2 mNA;C:CNN3 mNA;D:不同 CNN1 mNA 表达水平;E:不同CNN2 mNA 表达水平;F:不同CNN3 mNA 表达水平图 1TCGA 数据库中 CNN1、CNN2、CNN3 mNA 在 ESCC 组织中的表达水平及患者的 OS 曲线义(P0.001)。其中，肿瘤细胞免疫组化评分为弱、较弱、中、强分别为 41、56、59、34 例，癌旁组织评分为弱、较弱、中、强分别为142、16、3、0 例。部分肿瘤基质也表达 CNN2，经马松三色染色后证实为胶原纤维。见图2。A:癌旁组织和肿瘤组织中 CNN2 的表达(SP 100，放大图:SP 400);B:肿瘤组织中胶原纤维(HE 200);C:肿瘤组织中胶原纤维 CNN2 的表达(SP 200);D:肿瘤组织中胶原纤维(马松三色200)图 2ESCC 和癌旁组织中 CNN2 的表达情况2.3CNN2 蛋白表达与 ESCC 临床病理特征的关系根据 CNN2 免疫染色强度评分，分析 190 例 ESCC组织中 CNN2 蛋白表达水平与临床病理特征的关系。结果显示，CNN2 蛋白表达与分化程度、T 分期、N 分期、pTNM 分期和高血压有关(P0.05)，而年龄、性别、肿瘤最大径以及糖尿病与 CNN2 蛋白表达无关(P0.05)。见表 3。822临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3表 3CNN2 表达水平与 ESCC 临床病理特征的关系 例(%)临床病理参数nCNN2 蛋白表达水平弱较弱中强P年龄(岁)0.557639522(23.2)25(26.3)28(29.5)20(21.1)639519(20.0)31(32.6)31(32.6)14(14.7)性别0.081男11622(19.0)37(31.9)31(26.7)26(22.4)女7419(25.7)19(25.7)28(37.8)8(10.8)肿瘤最大径(cm)0.61349518(18.9)*31(32.6)*29(30.5)*17(17.9)*48322(26.5)23(27.7)26(31.3)12(14.5)分化程度0.036低4212(28.6)*9(21.4)*18(42.9)*3(7.1)中、高14528(19.3)46(31.7)40(27.6)31(21.4)T 分期0.021T1T27816(20.5)15(19.2)*33(42.3)14(17.9)T3T411125(22.5)40(36.0)26(23.4)20(18.0)N 分期0.017N09914(14.1)30(30.3)39(39.4)16(16.2)*N1N39027(30.0)26(28.9)20(22.2)17(18.9)pTNM 分期0.02310215(14.7)29(28.4)40(39.2)18(17.6)*8626(30.2)26(30.2)19(22.1)15(17.4)糖尿病0.543是175(29.4)5(29.4)6(35.3)1(5.9)否17336(20.8)51(29.5)53(30.6)33(19.1)高血压0.048是5411(20.4)16(29.6)23(42.6)4(7.4)否13630(22.1)40(29.4)36(26.5)30(22.1)注:*:数据存在缺失2.4CNN2 蛋白表达水平与临床病例 OS 的关系为了研究临床病例队列中 CNN2 蛋白的表达水平是否与 OS 有关，根据肿瘤组织 CNN2 蛋白的表达水平，将患者分为 CNN2 高表达组和 CNN2 低表达组。生存分析结果显示，在临床病例队列中，CNN2 蛋白高表达患者的中位 OS 为 84.0 个月，高于低表达者的 59.0 个月，差异有统计学意义(P=0.034)。见表 4、图 3。随后进行单因素分析以筛选影响 ESCC 患者OS 的其他因素。结果显示，性别、pTNM 分期、高血压与 OS 有关(P 0.05)。进一步将上述指标与CNN2 蛋白共同纳入 Cox 多因素分析，结果显示，性别、pTNM 分期和高血压是影响 OS 的独立因素(P0.05)。见表 4、表 5。图 3不同 CNN2 蛋白表达 ESCC 患者的 OS曲线922临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3表 4影响 ESCC 临床病例 OS 的单因素分析(月)临床病理参数n中位 OS(95%CI)P年龄(岁)0.148639584.0()639560.0(31.5188.50)性别0.009男11654.0(37.4070.60)女74118.0(79.56156.44)分化程度0.777低4265.0(36.8993.11)中、高14565.0(39.6190.39)pTNM 分期0.001102未达8630.0(14.5745.44)高血压0.006是5448.0(24.6971.31)否13690.0CNN2 表达0.034低9759.0(35.4182.59)高9384.0()表 5影响 ESCC 患者 OS 的 Cox 多因素分析因素H(95%CI)P性别(女性 vs男性)0.56(0.360.88)0.011pTNM 分期(期 vs 期)2.77(1.804.28)0.001高血压(是 vs否)1.96(1.263.04)0.003CNN2 表达(高 vs 低)0.71(0.471.08)0.1112.5CNN2 基因甲基化分析结果DNA 甲基化在基因表达调控中起重要作用。为了探讨 DNA 甲基化是否也参与了 CNN2 的表达调控，我们利用 Meth-Surv 工具检测了食管癌患者 CNN2 基因的 DNA 甲基化 位 点。共 发 现 14 个 甲 基 化 位 点，其 中cg22902083 与食管癌患者的预后有关(H=0.573，P=0.019)。见表 6。生存分析结果显示，食管癌患者 cg22902083 位点 CpG 的 DNA 甲基化水平越高，OS 越长。甲基化频率最高的位点为 cg05220090 和 cg10730425。虽然两个位点对 OS 的影响无显著差异，但呈现的趋势与 cg22902083 相同。见图 4。2.6共表达分析及 GO 和 KEGG 富集结果为进一步探讨 CNN2 基因在食管癌中的可能作用，我们使用 cBioPortal 数据库进行基因共表达分析，对筛选出的 500 个转录相关基因(|r|0.6，P0.05)进行 GO 和 KEGG 分析，结果显示，筛选出的基因在“细胞-细胞连接组织”、“基于肌动蛋白的细胞投影簇”、“顶端连接复合物”、“肌动蛋白结合”以及“细胞骨架结构成分”中富集。KEGG 通路分析显示，CNN2 共表达基因在“紧密连接”中高度富集。见图 5。表 6CNN2 基因高甲基化水平对食管癌患者 OS 的影响CpGHPcg229020830.5730.022cg107304250.6360.053cg077544071.5550.062cg052200900.6670.078cg110155490.7100.184cg029451921.3720.248cg165091420.7430.256cg094677110.7710.257cg255472321.3360.294cg028383091.2610.316cg043767190.7990.332cg101927360.8000.336cg065340221.1950.498cg195712930.8570.5282.7CNN2 与食管癌免疫细胞浸润的相关性为进一步探讨 CNN2 的可能作用，本研究对 CNN2 表达与免疫细胞浸润的相关性进行分析。ssGSEA 算法量化的食管癌中 CNN2 表达与 24 种免疫细胞浸润存在相关性(图 6A)。CNN2 表达与中央记忆 T细胞(Tcm)、自然杀伤(NK)CD56dim 细胞、NK 细胞、Th2 细胞、Tgd 细胞、巨噬细胞浸润呈正相关(P0.05)，与 Th17 细胞、嗜酸性粒细胞(Eosinophils)、浆细胞样树突状细胞(pDC)、CD8+T 细胞、NKCD56bright 细胞、B 细胞、效应性记忆 T 细胞、T 细胞、肥大细胞浸润呈负相关(P0.05)。选取 6 种与CNN2 表达水平呈正相关或负相关显著性最强的免疫细胞进行 Spearman 相关性分析，结果显示，Tcm细胞(r=0.315，P0.001)、NK CD56dim 细胞(r=0.303，P0.001)、NK 细胞(r=0.298，P0.001)与CNN2 表达呈正相关，Th17 细胞(r=0.490，P0.001)、嗜酸性粒细胞(r=0.482，P0.001)、pDC(r=0.427，P0.001)与 CNN2 表达呈负相关(图 6B图 6G)。032临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3A:CNN2 基因甲基化水平的瀑布图;B:cg22902083 位点 CNN2 基因甲基化的生存分析;C:cg05220090 位点 CNN2 基因甲基化的生存分析;D:cg10730425 位点 CNN2 基因甲基化的生存分析图 4食管癌组织 CNN2 基因的甲基化及与 OS 的关系3讨论在本研究中，我们首次研究了食管癌组织中CNN2 的表达，并将其与临床病理特征联系起来。TCGA 数据库分析结果显示，与癌旁组织比较，CNN1 mNA 在肿瘤组织中的表达水平显著降低，而 CNN2 mNA 表达水平显著升高，而 CNN3 mNA在肿瘤组织及癌旁组织中的表达差异不明显。CNN2 mNA 水平更高的患者 OS 更长。CNN1 和CNN3 mNA 的表达水平与 OS 无关。考虑到基因主要通过其编码的蛋白质而不是 mNA 发挥作用，我们进一步通过免疫组化法检测了 CNN2 蛋白在ESCC 组织中的表达水平。结果显示，CNN2 蛋白在ESCC 组织中的表达显著高于癌旁组织，这与 TCGA数据库中 mNA 的研究结果一致，并且 CNN2 的表达水平主要在肿瘤细胞以及间质成纤维细胞中升高。此外，CNN2 蛋白的表达水平与肿瘤分期和 OS有关。以上结果提示，CNN2 可能参与 ESCC 的发病机制，并起到肿瘤防御因子的作用。DNA 甲基化在调控基因表达方面发挥着重要作用，从而参与了人类多种疾病的发病机制。异常的 DNA 甲基化在多种恶性肿瘤中均有报道。启动子内 DNA 甲基化的增加往往导致基因沉默，而基因高水平的甲基化(基因体，5UT 和 3UT)与基因表达增加有关8。为了确定 DNA 甲基化是否也参与 CNN2 的表达调控，我们在食管癌患者的 CNN2132临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3A:500 个共表达基因中与 CNN2 相关性最强的前 20 个基因;B:CNN2 与 500 个共表达基因的 GO/KEGG 富集分析图 5CNN2 基因在食管癌中的 GO/KEGG 富集分析结果A:ssGSEA 算法量化 CNN2 表达与免疫细胞浸润的关联分析;B:Tcm;C:NK CD56dim;D:NK 细胞;E:Th17 细胞;F:嗜酸性粒细胞;G:pCD图 6食管癌组织中 CNN2 表达与肿瘤免疫细胞浸润的相关性基因中发现了 3 个基因内甲基化位点。其中，两个高度甲基化位点(cg05220090 和 cg10730425)位于基因体区，另一个高度甲基化位点(cg22902083)位于基因的 5UT 区，提示这些位点的 DNA 甲基化可能是食管癌患者 CNN2 表达升高的原因。有趣的是，5UT 区另一个 CpG 位点(cg22902083)的甲基化水平与预后有关，该位点甲基化频率越高的患者OS 越长。表明 CNN2 可能参与了食管癌的病理过程，这进一步支持了我们的观点，即 CNN2 可能在食管癌中发挥肿瘤防御因子的作用。细胞骨架是细胞的基本结构，在细胞的形态改变、运动和侵袭过程中起着关键作用。细胞-细胞连232临床肿瘤学杂志 2023 年 3 月第 28 卷第 3 期Chinese Clinical Oncology，Mar 2023，Vol28，No3接包括粘附连接和紧密连接9。当肿瘤失去细胞间的连接时，肿瘤细胞就会从原发部位侵袭并扩散，从而发生肿瘤转移10。GO 富集分析显示，CNN2 和 500 个互作基因参与细胞-细胞连接组织和细胞骨架结构组成。KEGG 通路分析显示，CNN2 及其共表达基因在紧密连接中高度富集。因此，我们认为 CNN2 的高表达及其共表达基因可能通过调控细胞骨架、细胞-细胞连接等相关机制影响食管癌的增殖和转移。肿瘤的发生、发展通常需要一个合适的微环境，肿瘤微环境包括复杂的细胞外基质成分网络和不同类型的细胞，如浸润性免疫细胞11。在本研究中，我们还通过 ssGSEA 研究了 CNN2 mNA 表达水平与免疫细胞浸润水平的关系。结果显示，CNN2表达水平与 Tcm 细胞、NK CD56dim 细胞、NK 细胞浸润水平呈正相关，与 Th17 细胞、嗜酸性粒细胞、pDC 浸润水平呈负相关。Tcm 一直被认为是肿瘤复发转移的抑制因子，一旦受到肿瘤抗原的再暴露刺激，可以迅速激活并分化为有效的 T 细胞12。NK细胞能够直接杀伤某些肿瘤细胞和病毒感染细胞，在肿 瘤 的 监 测 和 控 制 中 具 有 重 要 作 用13。CD56dim NK 细胞是血液中大多数 NK 细胞的代表，具有细胞毒性，可以通过直接释放溶解颗粒杀死肿瘤细胞14。Th17 细胞是 CD4+T 细胞的一个谱系，已被证明在一些肿瘤中充当慢性炎症的启动子15。有研究者发现，Th17 细胞能够促进血管生成并驱动肿瘤进展16。作为一种广为人知的血液循环颗粒细胞，嗜酸性粒细胞与多种疾病相关，例如炎症和过敏反应。值得一提的是，由于其生成多种促进血管生成的因子的功能，嗜酸性粒细胞可能通过血管生成促进肿瘤生长17。慢性潜伏炎症诱导 pCD 招募到肿瘤部位，由于浸润肿瘤的 pCD 往往具有耐受性而非免疫原性，因此 pCD 向肿瘤的招募往往与不良预后有关。且 pCD 能够产生两种与血管生成有关的免疫因子:肿瘤坏死因子-(TNF-)和趋化因子 8(CXCL8)，两者也可能参与肿瘤血管生成18-19。总之，Tcm、CD56dim NK 细胞和 NK 细胞在杀伤肿瘤细胞方面发挥着重要作用，而 Th17 细胞、嗜酸性粒细胞和 pCD 则与慢性炎症或血管生成相关，进一步推动肿瘤的发展。CNN2 表达水平与肿瘤杀伤细胞浸润水平呈正相关，与慢性炎症或血管生成相关细胞浸润水平呈负相关。免疫检查点是在免疫细胞中表达的细胞表面受体，程序性死亡受体 1(PD-1)是最受关注的免疫检查点之一。程序性死亡配体 1(PD-L1)主要在人类恶性肿瘤中表达，通过与免疫细胞上的 PD-1 结合，参与肿瘤免疫逃逸20。PD-L1 在不同细胞中可被多种信号通路诱导，包括MEK、MAPK、PI3K 和 Akt 以及多种转录因子，包括HIF-1、STAT3 和 NF-B21。值得一提的是，在肝细胞癌中，CNN2 通过调控 MAPK 通路中 EK1/2的磷酸化水平影响肿瘤进展;而在胰管腺癌中，CNN2 通过抑制 PI3K/Akt 和 NF-B 通路影响肿瘤进展5-6。因此，我们推测在食管癌中 CNN2 可能通过上述某些途径调控 PD-L1 在肿瘤细胞中的表达，从而影响 PD-1 的参与，进而影响免疫浸润。上述结果表明，在食管癌中 CNN2 与免疫浸润之间存在潜在的相关性，然而其具体机制仍需进一步研究探索。本研究尚存在一些局