实验性脊髓损伤后大脑血管可塑性的磁共振血管尺寸成像研究.pdf

第40 卷第2 期2023年0 6 月Chinese J Magn Reson,2023,40(2):158-168波谱学杂志Chinese Journal of Magnetic ResonanceVol.40 No.2Jun.2023doi:10.11938/cjmr20223036实验性脊髓损伤后大脑血管可塑性的磁共振血管尺寸成像研究田雨1,2.3，周臣2.3，张亚男2.34，王鹏4，张彩云4，宋天玮2,34，钱俊超1,2.3*1.安徽医科大学基础医学院，安徽合肥2 30 0 32；2.中国科学院合肥肿瘤医院，安徽合肥2 30 0 31；3.中国科学院合肥物质科学研究院，健康与医学技术研究所，医学物理与技术安徽省重点实验室，安徽合肥2 30 0 31；4.滨州医学院，山东烟台2 6 40 0 3摘要：本文应用7 T高场磁共振血管尺寸成像技术研究了大鼠脊髓半切损伤后大脑血管的可塑性.通过感兴趣区域分析发现，损伤4周后，与损伤部位同侧锥体相比，对侧锥体区域的平均血管直径、微血管密度和血管尺寸指数显著增加，提示对侧皮质脊髓束白质区域血管生成或活化。该结果经由免疫荧光实验证实，损伤4周后，对侧锥体区域血小板内皮细胞粘附分子和胶质纤维酸性蛋白的染色强度也显著增加以上结果表明磁共振血管尺寸成像技术可为脊髓损伤后大脑相关区域的血管生成提供有价值的信息，并有可能成为诊断脊髓损伤患者脑部血管病变的新工具.关键词：大脑血管可塑性；血管尺寸成像；大鼠；脊髓损伤；高场磁共振成像中图分类号：R338;R445.2;0482.53In vivo MR Vessel Size Imaging of Brain Vascular Plasticity AfterExperimental Spinal Cord InjuryTIAN Yul.2.3,ZHOU Chen23,ZHANG Yanan2.3.4,WANG Peng*,ZHANG Caiyunt,SONG Tianwei2.3.4,QIAN Junchaol,2,3*1.School of Basic Medical Sciences,Anhui Medical University,Hefei 230032,China;2.Hefei Cancer Hospital,Chinese Academy of Sciences,Hefei 230031,China;3.Anhui Province Key Laboratory of Medical Physics and Technology,Institute of Health and Medical Technology,HefeiInstitutes of Physical Science,Chinese Academy of Sciences,Hefei 230031,China;4.Binzhou Medical University,Yantai 264003,ChinaAbstract:In vivo magnetic resonance vessel size imaging at 7 T high field was used to explore the changes in cerebralvascular plasticity after spinal cord hemisection injury in rats.Region of interest(ROI)analysis showed that four weeks afterinjury,mean vessel diameter(mVD),microvascular density(Density)and vessel size index(VSI)values were significantlyincreased in the contralateral side compared with the ipsilateral pyramid of the injury site,suggesting angiogenesis orvascular activation in the white matter region of the contralateral corticospinal tract(CST).Immunofluorescence resultsshowed that the intensity of staining for platelet endothelial cell adhesion molecule 1(CD31)and glial fibrillary acidic protein(GFAP)also increased significantly in the contralateral pyramid four weeks after injury.These results suggested thatmagnetic resonance vessel size imaging could provide valuable information on neovascularization in brain after spinal cordinjury and may be a novel tool to diagnose brain vascular pathologies in spinal cord injury patients.Keywords:brain vascular plasticity,vessel size imaging,rats,spinal cord injury,high field magnetic resonance imaging文献标识码：A收稿日期：2 0 2 2-11-2 2；在线发表日期：2 0 2 3-0 1-2 9基金项目：国家自然科学基金资助项目(U1932158，8 18 7 10 8 5，8 2 2 7 1519)；山东省自然科学基金肿瘤防治联合基金重点项目(ZR2019LZL018)；安徽省自然科学基金杰出青年项目(2 2 0 8 0 8 5J10)；中国科学院合肥大科学中心协同创新培育基金重要项目(2 0 19HSC-CIP003)；中国博士后科学基金项目(2 0 19M652403)；山东省博士后创新项目(2 0 2 0 0 2 0 48)通信作者(Corresponding author):*E-mail:.第2 期引言脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）会导致沿皮质脊髓和其他神经束的神经元轴突变性-4。然而，有研究表明SCI后，人和大鼠的大脑发生可塑性变化，可形成新的神经回路，从而在不同程度上恢复感觉和运动功能5-8 。虽然大脑神经可塑性变化的过程已被广泛研究，但具体机制仍不清楚轴突芽生、突触重组和神经新生是影响神经回路重建的关键因素9,10 ，而损伤部位相关区域的血管生成或重建可提供更多的氧气和营养物质，从而有助于轴突再生和神经新生11,12 .已有研究3 表明，SCI后，大鼠大脑的锥体和大脑脚等区域可观察到星形胶质细胞的增殖和活化激活的星形胶质细胞可刺激和招募成纤维细胞和内皮细胞，从而促进损伤区域血管生成13 此外，SCI后，激活的星形胶质细胞将表达肝细胞生长因子（hepatocytegrowth factor，H G F）和间质表皮转换因子（c-mesenchymal-epithelial transition factor，c-M e t)，促进包括脊髓在内的大鼠、小鼠及人体各种组织和器官的血管生成14-16 因此，我们推测星形胶质细胞可能在SCI后的大脑相关脑区血管生成过程中发挥重要作用.高场磁共振血管尺寸成像（magneticresonancevessel size imaging）可用于检测大脑中微米级的微小血管17 。它是一种通过确定平均血管直径（meanvesseldiameter，mVD）、微血管密度（Density）和血管尺寸指数（vessel size index，VSI)等参数来评估血管生成和形态变化的定量成像方法18,19.其中，mVD和Density分别代表局部血管网络中微血管的大小和密度；VSI是一个定量指标，能够反映微血管直径的分布，有助于监测体内微血管的扩张和收缩19,2 0 Ielacqua等2 1 采用高场动态磁敏感对比磁共振成像（dynamicsusceptibility contrast-magnetic resonance imaging，D SC-M R I）联合注射造影剂的方法，获得了脑淀粉样变性小鼠的弛豫位移指数Q（r e l a x a t i o n s h i f t i n d e x Q)，从而计算出大脑微血管密度已有研究2 2 表明，磁共振血管尺寸成像得到的mVD、D e n s i t y 和VSI与组织学的估计值具有良好的相关性，可用于评估大鼠脑胶质瘤的血管生成在另一项研究中，Xu等19 利用9.4T高场磁共振血管尺寸成像，研究了阿尔茨海默病（A lz h e im e r s d is e a s e，A D）转基因小鼠的脑血管大小和密度与AD进展的关系.高场磁共振血管尺寸成像可为传统MRI提供补充信息，但利用该技术对大鼠SCI后大脑血管可塑性变化的研究至今未见报道.本文利用7 T高场磁共振血管尺寸成像技术研究了大鼠SCI后沿皮质脊髓束（corticospinal tract，CST）区域（经锥体、大脑脚、内囊和皮质的通路）的血管生成，并通过组织学观察进行证实。田雨等：实验性脊髓损伤后大脑血管可塑性的磁共振血管尺寸成像研究1591实验方法1.1仪器与试剂7T小动物MRI扫描仪（Bruker公司）；冰冻切片机（Leica公司，型号：CM3050S）；正置荧光显微镜（Leica公司，型号：DM6B）；超小超顺磁性氧化铁（ultrasmall superparamagnetic ironoxide，U SPIO）造影剂（上海羧菲生物医药有限公司）胶质纤维酸性蛋白（glial fibrilaryacidicprotein，G FA P）是星形胶质细胞中间丝的主要成分，是星形胶质细胞活化的常用标志物2 3 血小板内皮细胞粘附分子（plateletendothelialcelladhesionmolecule1，C D 31）是来自免疫球蛋白大家族的130 KDI型跨膜糖蛋白，是血管生成的标志物2 4 因此，选取GFAP抗体（Millipore公司，货号：MAB360）和CD31抗体（Abcam公司，货号：ab281583）分别标记星形胶质细胞和新生血管相应的荧光二抗为山羊抗小鼠IgG抗体（Invitrogen公司，货号：A-11005）和山羊抗兔IgG抗体（Abcam公司，货号：ab150077）.1601.2大鼠脊髓半切模型的建立本实验所涉及的动物实验程序均经由中国科学院合肥物质科学研究院实验动物伦理委员会批准实验选取6 只雄性Sprague-Dawley大鼠（购买于安徽医科大学动物实验中心），年龄约8 周龄，体重在2 0 0 2 50 g范围内实验开始前均在温度为2 2 2 6、相对湿度为50%7 0%、12 h昼夜交替照明的环境中饲养一周.采用3.5%剂量的异氟烷混合氧气诱导麻醉后，将大鼠俯卧放置在实验台上胸髓T。节段半切手术的术中使用1.5%2.0%剂量的异氟烷使大鼠保持麻醉状态。备皮消毒后，切开背部皮肤，分离皮下组织以暴露T-T1o棘突和椎板在T。处行背侧单侧椎板切除术，充分暴露脊髓以后正中静脉为界线，用眼科显微剪刀横断右半侧脊髓3 术后，将大鼠放置在单独的笼子里，可以自由获得水和食物每天人工排空膀胱至少三次，直至大鼠排尿反射恢复.1.3体内磁共振血管尺寸成像SCI术后4周，利用7 T小动物MRI扫描仪进行磁共振血管尺寸成像选择4周的时间点与先前功能磁共振成像（functionalMRI，f M R I）发现大脑有多个区域被激活的研究相吻合2 5 采用3.5%剂量的异氟烷混合氧气诱导麻醉后，将大鼠俯卧放置在扫描床上扫描期间，使用1.5%2.0%剂量的异氟烷使大鼠保持麻醉状态，在尾静脉中放置导管以注射造影剂，并使用生理监控设备监测其呼吸频率和体温。T2*加权图像（T2WI）采用2 D梯度回波（gradient-echo，G E）序列快速小角度激发（fastlow-angleshot，FLASH）成像获得，扫描参数如下：回波时间（echotime，T E）=3.5m s；重复时间（repetitiontime，T R）=800ms；翻转角=50；层厚为1mm；层数为2 4；视野范围（fieldofvision，FO V）=2 5m m x 2 5m m；矩阵=2 56 2 56，平均次数为2 T2加权图像（T2WI）采用自旋回波（spin-echo，SE）序列获得，扫描参数如下：TE=35ms；T R=450 0 m s；层厚为1mm；层数为2 4；FOV=25mm25mm；矩阵=2 56 2 56，平均次数为2 弥散图像采用多次激发自旋平面回波成像（echo-planar imaging，EPI）序列获得，扫描参数如下：TE=25ms；T R=30 0 0 m s；激发次数为8；层厚为1mm；层数为2 4；FOV=25mm25mm；矩阵=128128；平均次数为2.在注射USPIO26之前和之后5min，通过重复SE和GE序列扫描获得横向弛豫率变化R,和R此外，表观弥散系数（apparentdiffusioncoefficient，A D C）图像从30 个方向的弥散加权自旋回波图像（b=800s/mm）和参考图像（b=0s/mm）中获得造影剂（0.0 2 mL/kg）的注射速度为0.02mL/s每只动物的MRI扫描时间约为2 h.1.4数据处理本文使用ImageJ软件分析MRI数据集来量化本研究中观察到的皮质脊髓束的变化.首先使用ImageJ软件在T2WI图像上勾勒出除皮肤和颅骨以外的大鼠脑模板SCI会导致损伤部位以外的沿皮质脊髓束的变性2 7 ，故而选取双侧大脑锥体（pyramid，PY）、大脑脚（cerebral peduncle，CP）、内囊（intermalcapsule，IC）和皮质（cortex，CT X）作为感兴趣区域（regionsofinterest，R O Is）并将T2WI上勾画的所有ROIs转移到mVD、D e n s i t y 和VSI图像上.基于先前的描述计算每个ROI 的和AR,和R,21SR 2lnTESpostARlnTE波谱学杂志preprepost第40 卷(1)(2)第2 期其中Spre和Spost代表SE图像造影前和造影后的信号强度，Spr。和Spost代表GE图像造影前和造影后的信号强度.每个ROI内的mVD、D e n s i t y 和VSI参考文献192 12 2 中给出的计算公式：其中，ADC是指在梯度系统的30 个方向上得到的ADC的平均值；Bo代表静磁场强度；代表质子的旋磁比；由血管内的造影剂引起的血管外和血管内的磁感应强度差异x被认为等于0.57 ppm19.1.5免疫荧光实验MRI数据采集完成后，分别使用生理盐水和4%多聚甲醛对大鼠进行心脏灌流，断头取脑，将脑组织放在4%多聚甲醛中固定：之后将完全固定的脑组织浸入30%蔗糖溶液中，待组织沉底后利用冰冻切片机进行切片，切片厚度为2 0 m选取与T2加权图像大致相同层面的脑片进行后续处理.脑片经0.5%TritonX-100透膜后，用5%山羊血清封闭用GFAP（1:2 50）和CD31（1:2 0 0）抗体4孵育过夜后，与相应的荧光二抗（山羊抗小鼠IgG抗体和山羊抗兔IgG抗体）避光孵育6 0 min，然后采用正置荧光显微镜进行观察.通过ImageJ软件来评估荧光的分布情况和表达强度，从而量化大鼠脑组织单位面积内GFAP和CD31蛋白表达水平.1.6数据分析使用GraphPadPrism9.0软件进行统计学分析，所有数据均以平均值标准差（meanSD）表示大鼠脊髓半切损伤部位的对侧和同侧水平之间的统计学差异采用配对t检验进行分析，p0.05表示差异有统计学意义.2结果与讨论2.1体内磁共振血管尺寸成像注射USPIO前后T2WI的对比分析如图1所示，可观察到注射USPIO后上矢状窦内信号降低损伤4田雨等：实验性脊髓损伤后大脑血管可塑性的磁共振血管尺寸成像研究Density=329(AR)(AR（）ADCVSI=0.424(B）注射USPIO前161prepostARmVD:AR2注射USPIO后(3)(4)(5)图1注射USPIO后，T2WI图像中上矢状窦内信号降低。白色箭头指向上矢状窦Fig.1Reduced signal in the superior sagittal sinus after USPIO injection on T2-weighted images.White arrows point to the superior sagttal sinus162周后大鼠大脑的代表性磁共振图像的对比分析如图2 所示，我们发现同侧和对侧锥体区域的mVD、D e n s i t y和VSI表现出明显差异定量结果（表S1）显示，损伤4周后，与同侧锥体相比，对侧锥体的mVD、Density和VSI分别增加了6 5%33%（p=0.0026）、16 0%10 4%（p=0.0 0 1）和8 3%12%（p0.0001).然而，同侧和对侧大脑皮质、内囊和大脑脚区域的mVD、D e n s i t y 和VSI无显著性差异（图3）.波谱学杂志第40 卷T2-weighted imagemVD(a.u.)Density(vessel mm-2)vSI(um)CTXIpsilateralContralateralPY200(a.u.)图2 脊髓半切损伤4周后，大鼠脑的代表性的不同层的磁共振图像，在TWI图像上勾画ROIs，并转移到mVD、D e n s i t y和VSI图像上CTX：皮质，包括初级运动皮质（M1)；I C：内囊；CP：大脑脚；PY：锥体Fig.2Representative magnetic resonance images of different layers of a rat brain after spinal cord hemisection injury for fourweeks.The ROIs were delineated on T2-weighted images and transferred to the mVD,Density and VSI images.CTX:cortexincluding primary motor cortex(M1);IC:internal capsule;CP:cerebral peduncle;PY:pyramid3000(vessel mm-2)20(um)第2 期田雨等：实验性脊髓损伤后大脑血管可塑性的磁共振血管尺寸成像研究163CTX15-(ne)aAu10-IC15-(ne)aul10CP157(ne)au10-PY15-*(ne)au10-555-0000contralateral400730020010004007300-200-100-0400300-200100-04007300-200-100-0*15710(un)/IS515-10-(u)/IS515-10-(um)/IS515-10-(uml)/IS0contralateral图3脊髓半切损伤4周后，6 只大鼠同侧与对侧脑区的各感兴趣区域的mVD、D e n s i t y 和VSI定量分析。CTX：皮层，包括初级运动皮质（M1）；IC：内囊；CP：大脑脚；PY：锥体柱状图由平均值土标准差表示，其中*表示p0.01Fig.3 Quantitative analysis of mVD,Density,and VSI for each region of interest in the ipsilateral and contralateral brain regions ofsix rats after spinal cord hemisection injury for four weeks.CTX:cortex including primary motor cortex(M1);IC:internal capsule;CP:cerebral peduncle;PY:pyramid.Data were represented by mean standard deviation,*p0.012.2新生血管和星形胶质细胞的免疫荧光检测为了进一步证实MRI实验的结果，我们用免疫荧光染色标记新生血管和星形胶质细胞.对侧锥体区域免疫荧光染色结果与以往的研究3 一致，即在同一区域观察到星形胶质细胞的增殖和活化损伤4周后，与同侧锥体相比，对侧锥体区域CD31和GFAP染色强度显著增加然而，同侧和对侧大脑皮质、内囊和大脑脚区域的CD31和GFAP染色强度无显著性差异（图4）.定量结果（表S2）显示，损伤4周后，与同侧锥体相比，对侧锥体区域CD31和GFAP染色强度分别增加了116%2 4%（p0.0001）和16 9%49%(p=0.000 1)(图 5).164波谱学杂志ipsilateral CD31contralateralCD31第40 卷ipsilateral GFAPcontralateralGFAPCTX50umICCPPY图4脊髓半切损伤4周后，大鼠代表性脑区的免疫荧光染色白色箭头指向反应性星形胶质细胞CTX：皮质，包括初级运动皮质（MI)；I C：内囊；CP：大脑脚；PY：锥体Fig.4 Immunofluorescence staining of representative brain region of a rat after spinal cord hemisection injury for four weeks.White arrows point reactive astrocytes.CTX:cortex including primary motor cortex(MI);IC:internal capsule;CP:cerebralpeduncle;PY:pyramidCTX3ICCPPY3*2CD312000ntralcontralpsilateral3333GFAP2222000contralateral图5脊髓半切损伤4周后，6 只大鼠同侧和对侧脑区CD31和GFAP荧光强度定量分析。CTX：皮质，包括初级运动皮质（M1)；IC：内囊；CP：大脑脚；PY：锥体柱状图由平均值标准差表示，*表示p0.01Fig.5Quantitative analysis of immunofluorescence intensity of CD31 and GFAP in the ipsilateral and contralateral brain regionsof6 rats after spinal cord hemisection injury for four weeks.CTX:cortex including primary motor cortex(M1);IC:internal capsule;CP:cerebral peduncle;PY:pyramid.Data were represented by mean standard deviation,*p0.01第2 期2.3讨论在这项研究中，我们利用7 T高场磁共振血管尺寸成像技术，研究了大鼠脊髓半切损伤后沿皮质脊髓束的大脑相关脑区血管可塑性，并通过免疫荧光实验进行证实。SCI 导致损伤部位以外的沿皮质脊髓束的变性2 7 ,以及进一步的轴突芽生和血管新生等可塑性变化.基于磁共振血管尺寸成像的结果，我们发现与损伤部位同侧锥体相比，损伤4周后的对侧锥体表现出血管活化另外，免疫荧光染色结果显示，同一区域激活的星形胶质细胞也显著增加星形胶质细胞是中枢神经系统数量最多、分布最广的细胞2 8 ，在维持中枢神经系统稳态和功能方面发挥重要作用2 9 SCI后，星形胶质细胞活化增生形成胶质瘢痕30 ，通过分泌抑制性因子，如硫酸软骨素蛋白聚糖（chondroitin sulfateproteoglycans，C SPG s）31，抑制少突胶质前体细胞（oligodendrocyte progenitorcells，O PC s）分化32 、轴突再生和再髓鞘化33.然而，另一些研究34 表明，星形胶质细胞增多和瘢痕形成并不总是对SCI有害的.在SCI的急性期，激活的星形胶质细胞会迅速迁移到损伤区域，从而限制炎症细胞的浸润，加强病变区域的收缩35，抑制神经毒性炎症从周围组织向中枢神经实质扩散36 同样，SCI后，星形胶质细胞可清除细胞外过量的谷氨酸，从而减弱兴奋性神经毒性损伤37 38 除了隔离毒性微环境外，一些研究13 表明，中枢神经系统损伤后，反应性星形胶质细胞还可通过刺激和招募成纤维细胞和内皮细胞加速损伤区域血管生成.大鼠SCI 两周后，在损伤区域发现反应性星形胶质细胞与新生血管共定位39 .另一项研究14 发现，SCI1周后，损伤区域周围激活的星形细胞中HGF和c-Met的表达同时上调，发挥多种神经营养作用在SCI后的恢复阶段（亚急性期和慢性期)，HGF可减弱炎症细胞浸润，保护神经元并促进损伤区域血管生成16.40 .此外，在中枢神经系统损伤后，激活的星形胶质细胞也可分泌血管内皮生长因子（vascularendothelial growthfactor，VEG F）来增强内皮细胞的增殖，从而促进血管生成41.42 小鼠索曼中毒三个月后，在受损脑区观察到伴随GFAP表达增加的血管生成43，这与我们关于星形胶质细胞和血管生成之间关系的假说一致因此，我们推测SCI后对侧锥体区域的血管生成可能与激活的星形胶质细胞有关：另一方面，星形胶质细胞也是血-脊髓屏障的重要组成部分，在维持血-脊髓屏障的正常结构和功能方面起着不可或缺的作用44.Whetstone等45 发现，在 SCI 后血-脊髓屏障的恢复阶段，星形胶质细胞邻近的新生血管上葡萄糖转运蛋白-1（g l u c o s e t r a n s p o r t e r-1，G L U T-1）的表达量增加，相反，其他不表达GLUT-1的新生血管可能没有正常的屏障功能，这也说明星形胶质细胞在SCI后血管的重塑和功能恢复中发挥重要作用此外，星形胶质细胞通过在突触发生、突触成熟中发挥重要作用来调节突触可塑性，是大脑神经可塑性的关键调节因子46 例如，星形胶质细胞可以通过分泌神经营养因子，如富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secretedproteinacidic andrich in cysteine，SPA R C)，促进神经元的生长、控制突触形成并调节突触发生47 星形胶质细胞通过释放各种神经活性物质（例如谷氨酸、GABA、D-丝氨酸和ATP等），作用于突触前和突触后元件来调控突触传递48 ,本研究具有一定的局限性，比如只在损伤4周后的时间点观察相关磁共振图像的变化我们没有进行纵向研究的主要原因是本研究的重点是利用活体无创的血管尺寸成像技术研究脊髓损伤后大脑血管可塑性变化。因此，本研究并不能真正代表长期纵向研究而纵向研究对于客观评价血管生成的变化至关重要我们将在后续的研究中解决这些问题.田雨等：实验性脊髓损伤后大脑血管可塑性的磁共振血管尺寸成像研究1653结论本文通过7 T高场磁共振血管尺寸成像技术证明了大鼠脊髓半切损伤4周后，对侧皮质脊髓束白质区166域（主要是锥体区域）的mVD、D e n s i t y 和VSI和同侧相比显著增加此外，在同一区域发现更多激活的星形胶质细胞和新生血管以上结果表明，磁共振血管尺寸成像可为SCI后大脑相关区域血管生成提供有价值的信息，并有可能成为诊断SCI患者脑部血管病变的新工具.致谢感谢“国家自然科学基金资助项目（U1932158，8 18 7 10 8 5，8 2 2 7 1519）；山东省自然科学基金肿瘤防治联合基金重点项目（ZR2019LZL018）；安徽省自然科学基金杰出青年项目（2 2 0 8 0 8 5J10）；中国科学院合肥大科学中心协同创新培育基金重要项目（2 0 19 HSC-CIP003）；中国博士后科学基金项目（2 0 19 M652403）；山东省博士后创新项目（2 0 2 0 0 2 0 48）”对本研究的支持.利益冲突无附件材料（可在波谱学杂志期刊官网http:/获取）表S1脊髓半切损伤4周后，6 只大鼠同侧与对侧脑区的各感兴趣区域的mVD、D e n s i t y 和VSI的值.表S2脊髓半切损伤4周后，6 只大鼠同侧和对侧脑区CD31和GFAP荧光强度定量分析.波谱学杂志第40 卷参考文献：1WRIGLEY P J,GUSTIN S M,MACEY P M,et al.Anatomical changes in human motor cortex and motor pathways following completethoracic spinal cord injuryJ.Cereb Cortex,2009,19(1):224-232.2 ILVESMaKI T,KOSKINEN E,BRANDER A,et al.Spinal cord injury induces 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