近红外荧光探针在口腔癌诊断中应用的研究进展.pdf

2023-07 50（4）国际口腔医学杂志 International Journal of Stomatology近红外荧光探针在口腔癌诊断中应用的研究进展姜玥莹 何宇添 李婷 周蓉卉口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院口腔颌面外科 成都 610041摘要 荧光成像因具有侵入性低、灵敏度高、可实时检测等优点，在癌症诊断及药物靶向等研究领域备受关注。自体荧光检查术可利用病变组织与正常组织对同一波长激发光产生的荧光差异对癌变组织进行诊断，或是利用药物本身的荧光对癌变组织进行示踪。然而，上述荧光诊断技术的特异性较差且检测灵敏度相对较低。与现有荧光诊断方法相比，近红外荧光诊断技术受背景信号干扰小且能对更深部组织进行成像，可有效弥补自体荧光检查术的不足，对辅助临床上口腔癌症的诊断具有重要意义。基于此，本文综述了应用于口腔癌诊断领域的第一、二近红外荧光窗口成像探针的构建方法，并进一步讨论了其在标记口腔癌症中的研究进展，为实现口腔癌实时精准诊断研究提供参考。关键词 口腔癌；近红外荧光；诊断；纳米探针；分子探针中图分类号 R 782 文献标志码 A doi 10.7518/gjkq.2023068Research progress on the application of near infrared fluorescence probe in the diagnosis of oral cancer Jiang Yueying,He Yutian,Li Ting,Zhou Ronghui.(State Key Laboratory of Oral Diseases&National Clinical Research Center for Oral Diseases&Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,West China Hospital of Stomatology,Sichuan University,Chengdu 610041,China)This study was supported by the National Science Fund for Distinguished Young Scholars(82102694).Abstract Fluorescence imaging has attracted much attention in cancer diagnosis and drug targeting due to its advantages of low invasion,high sensitivity and real-time detection.Autofluorescence can be used to diagnose cancerous tissue by the difference of fluorescence generated by the same wavelength excitation light between pathological tissue and normal tissue,or to trace cancerous tissue by the fluorescence of the drug itself.However,the specificity and sensitivity of these fluorescence diagnostic techniques are poor.Compared with the existing fluorescence diagnosis methods,near-infrared fluorescence diagnosis technology is less interfered by background signals and can image deeper tissues,which can effectively make up for the deficiency of autofluorescence examination,and has important significance for the clinical diagnosis of oral cancer.Based on this,this paper reviews the construction methods of the first and second near-infrared fluorescent window imaging probes applied in the field of oral cancer diagnosis,and further discusses its research progress in the labeling of oral cancer,providing a reference for the real-time and accurate diagnosis of oral cancer.Key words oral cancer;near-infrared fluorescence;diagnosis;nanoprobe;molecular probe口腔癌是指口腔上皮来源的恶性肿瘤总称，属于全球第六大最常见癌症头颈部恶性肿瘤，其病程短、恶性程度高，5年平均生存率仅为50%1。通常，口腔局部组织细胞异常增生所形成的局部肿块在早期无明显症状，但晚期肿瘤则可破坏组织、器官的结构和功能，进而严重影响发声、进食与颜面美观，对人类身体健康产生重大影响2。因此，临床医生应从战略上着眼于口腔癌的早期检测及诊断，尽早对病变组织进行干预，为随后的治疗提供充足时间，并减少疾病的复发及降低死亡率3。目前，组织病理活检能从组织细开放科学（资源服务）标识码（OSID）口腔肿瘤学专栏 收稿日期 20221111；修回日期 20230202基金项目 国家自然科学基金青年基金（82102694）作者简介 姜玥莹，博士，Email：通信作者 周蓉卉，副研究员，博士，Email： 407国际口腔医学杂志 International Journal of Stomatology2023-07 50（4）胞水平最为准确地诊断疾病，是口腔癌诊断的“金标准”。但是，活检也具有检测周期长，创伤性因而无法频繁实施等不足之处，不适合作为早期诊断及长期监测的手段4-6。相较组织活检，影像学检查创伤较小，且能更早地提供诊断依据，但检测成本较高且难以发现病变组织的前期状况2,7。近年来，荧光光谱诊断技术因操作简单、快速、创伤小，光源易进入，在口腔等浅表性肿瘤的诊断中得以应用1,8-9。荧光分子在特定波长激发光激发下，会发出特有波长的荧光，荧光的性质与所处环境的性质密切相关。因此，可利用这一特性，对机体病变组织和正常组织加以区分。例如，自体荧光成像检查术可利用病变组织与正常组织对同一波长激发光产生的荧光差异对黏膜癌变组织进行诊断，目前已成为临床筛查口腔白斑病癌变的重要手段10-11。除自体荧光检查术外，现有荧光诊断策略则主要通过荧光材料对病变组织进行标记，利用肿瘤细胞相较于正常细胞对荧光物质更强的亲和力，将病变组织与正常组织荧光光谱进行对比以确定肿瘤位置。其中，荧光靶向诊断技术则是利用肿瘤发展过程中伴随着一些标志性分子水平升高或降低的特性，利用带有荧光基团并能够靶向细胞或组织内特异性分子的探针标记细胞，将肿瘤组织与正常组织区分开。与药物荧光光谱诊断相比，细胞亲和性增加，靶向性增强，图像分辨率及灵敏性更高12-13。例如，Du等14将光敏剂孟加拉红（Rose Bengal，RB）（一种蒽醌类荧光素的衍生物，特征发射光谱570600 nm）作为口腔肿瘤癌前病变诊断用的荧光材料，通过细胞核着色以标记口腔癌前病变及口腔癌组织。Ghanim等15合成了一种水溶性荧光探针HA-FA-HEG-OE（激发光325 nm，发射光445 nm），可由口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）细胞膜上的CD44受体介导并聚集于囊泡中，实现靶向口腔癌细胞的荧光成像。尽管传统有机荧光染料因其种类多、容易获得等优势得到广泛关注，但大部分染料的荧光在可见光范围内，组织穿透力有限且易受组织中水、血红蛋白等的干扰（图1），致使检测信噪比低。此外，该类染料亲水性较差、抗光漂白能力较差且量子产率较低、导致其在生物体系中检测灵敏度较低，极大地限制了其在医学领域的应用。近红外（near infrared，NIR）荧光成像是应用NIR荧光材料对靶向性配体分子定位标记并转化为光信号进行成像的过程16。与可见光相比，生物组织在NIR区域（650 nm）成像时对光的散射和吸收较少，自发荧光背景较低，使得NIR荧光成像具有时空分辨率高、背景信号干扰弱等优点，在提供生理和病理信息方面具有显著的优势。目前，NIR荧光材料已广泛应用于生物定性或定量分析、生物医学诊断癌症、标记转移淋巴结、药物靶向研究、疫苗技术等多种领域17-18。根据发射波长，NIR光区可分为第一NIR荧光成像窗口（NIR-，波长650900 nm）和第二NIR荧光成像窗口（NIR-，波长1 0001 350 nm）19。NIR-探针具有发射波长较长、自体荧光干扰小、对光吸收和散射少、组织穿透度深等优点，主要用于细胞和组织中金属离子、生物分子的检测；NIR-探针由于具有更长的发射波长，且光的散射强度随波长的增长成指数下降，使得其对组织的散射、吸收和自发荧光背景更低，具有更深的穿透性，因而可穿透深层组织进行立体及实时成像，并对图 1 水、血红蛋白的吸收峰波长范围Fig 1 The absorption peak wavelength range of water and hemoglobin 408第4期姜玥莹，等：近红外荧光探针在口腔癌诊断中应用的研究进展肿瘤边缘进行精准定位20-21。因此，NIR荧光成像技术在一定程度上弥补了可见光（400650 nm）荧光诊断的缺点，有利于在现有的荧光探针研究基础上开发出稳定性更高、组织渗透性更强、背景信号干扰更低、灵敏度更高的探针，以弥补现有口腔癌诊断方法的不足，辅助临床上对口腔疾病的诊断（图1）。基于此，本文分别总结了近年来NIR分子探针与纳米探针在标记口腔癌成像方面的应用及相应的构建方法，为NIR材料在口腔癌诊断中的研究以及方法的完善提供参考。1 NIR分子荧光探针目前，传统有机荧光染料由于其合成方法简单、优良的发光特性、较高的稳定性，仍是当前NIR荧光探针的主流。诸如花菁类染料、酞菁、氟硼二吡咯甲烷类似物和卟啉衍生物，是目前常用的NIR荧光分子探针。其中，最具代表性的则是 目 前 经 临 床 批 准 的 吲 哚 菁 绿（indocyanine green，ICG），其最佳激发波长位于745 nm，而最大发射波长则位于820 nm。通过抗体标记，该染料已在多种癌前病变和恶性肿瘤中得以广泛应用22。例如，Ito等23将ICG与恶性肿瘤特异性表达的平足蛋白（podoplanin，PDPN）的抗体结合，对体内外高表达PDPN的OSCC细胞进行成像。动物实验中，将ICG-PDPN抗体探针注射进裸鼠腹腔中，随后使用手提式光动力可视系统（photodynamic eye，PDE）检测系统对PDPN高表达的肿瘤组织进行实时NIR成像。结果显示，直径大于3 mm皮内、皮下或舌的肿瘤可实现清晰的成像，与非NIR和自体荧光检测相比，可检测到更小的肿瘤组织，实现了对OSCC高敏感性、半定量性分析及实时成像。但该方法具有一定的侵入性，无法排除与抗体相关的副反应，且20%30%PDPN阴性的OSCC及癌前病损可能无法通过此装置检测。低氧是肿瘤微环境的特征，不仅在肿瘤进展中起着重要作用，还反映了肿瘤细胞的侵袭性。硝基还原酶（nitroreductase，NTR）在低氧肿瘤中高表达，是检测肿瘤低氧状态的有效靶点。基于此，Chen等24将异佛尔酮和4-羟基-3-硝基苯甲醛结合起来开发了一种新型荧光探针HNT-NTR，用于可视化检测体内外人舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）细胞Cal-27和人口底鳞状细胞癌细胞系HSC2肿瘤中NTR水平。结果证实，HNT-NTR在体内外均可有效区分肿瘤组织和正常组织，并同时可通过荧光强度反映肿瘤细胞的侵袭性，具有响应速度快、选择性高、灵敏度高、细胞膜通透性好、细胞毒性低等优点。因此，HNT-NTR在检测实体肿瘤，区分肿瘤良恶性方面有巨大的潜力。IRDye800CW 是 一 种 NIR 染 料（激 发 波 长775 nm，发射波长795 nm），有很高的肿瘤背景对比度25。研究表明，NIR荧光标记抗表皮生长因子受 体（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗体panitumumab-IRDye800CW对头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）高度敏感和特异。有学者26将荧光标记抗体探针panitumumab-IRDye800应用于口腔癌的切缘（距肿块5 mm）检测，并与组织处理后的病理结果相对比，结果显示，此抗体检测肿瘤边缘具有95%的灵敏度和89%的特异度。Nishio等27使用荧光标记抗体探针panitumumab-IRDye800评估了36个组织切片，共216个数据点，病理组织学显示119处为肿瘤，97处为正常组织，肿瘤组织的荧光激发比是正常组织的3倍以上，肿瘤检测的曲线下面积为0.86（95%可信区间为0.810.91），说明使用panitumumab-IRDye800CW可以对减少冷冻切片分析的组织取样误差。Jiao等28研制了一种NIR荧光探针IFP-O2，对O2-具有良好的灵敏度和选择性，检测下限低至10 nmolL-1。细胞实验表明，IFP-O2具有低毒、良好的膜通透性和线粒体靶向能力。IFP-O2可以在口腔癌Cal-27细胞线粒体中检测到内源性O2-，是研究口腔癌发生过程中ROS与细胞凋亡的关系的一种新工具。二氢卟吩（Ce6）是从活体小球藻中提取出来的叶绿素衍生物，它的两性分子结构使它容易透过细胞膜，在405 nm的激发下可发射波长665 nm的荧光。Low等29将病毒体包裹的Ce6与EGFR抗体结合组成Ce6-Vir-EGFR 探针，体外实验验证该探针可成功进入细胞并进行荧光成像。仓鼠颊袋模型实验表明，与单独Ce6分子相比，Ce6-Vir-EGFR 探针静脉注射后使用经过改装的短弧疝灯激发可显示出明显的肿瘤聚集性，背景信号明显减弱，且Ce6的红色荧光强度会随着病变的发展而逐渐增强，表明该探针在口腔癌荧光诊断中具有巨大潜力。409国际口腔医学杂志 International Journal of Stomatology2023-07 50（4）由于OSCC组织中高表达胃泌素释放肽受体（gastrin-releasing peptide receptor，GRPR），Li等30在此基础上将AF750-6Ahx-Sta-BBN（一种加载荧光探针可与GRPR特异性结合肽）与NGO通过氢键和-相互作用合成了NGO-BBN-AF750探针。将口腔舌癌细胞HSC3与GRPR阻滞剂预先孵育10 min后加入探针，实验结果显示无荧光产生，该探针仅对GRPR阳性的HSC3具有较强的亲和力和特异性。当探针与HSC3细胞孵育40 min后通过流式细胞学技术检测发现，BBN-AF750可以在探针与GRPR结合后脱落并发挥靶标作用。使用靶向GRPR的AF750-6Ahx-Sta-BBN探针对OSCCNIR荧光成像，为实现非侵入性、靶向OSCC及中空器官癌症早期诊断提供了新的思路，也为口腔癌的治疗提供了理论依据。尽管现有多种NIR-型探针已应用于口腔癌相关实验的体内外标记，但生物组织中的光散射和正常组织中不能忽略的背景信号依然导致了较低的图像分辨率，进而限制了其在临床上的应用31。与NIR-探针相比，NIR-探针受生物体内源性物质的干扰较少，可以穿透更深的深度并具有更低的组织背景信号21,32。虽然目前对NIR-材料的研究较多，但在OSCC领域鲜有将NIR-材料与肿瘤治疗相结合的报道。Wang等33通过Suzuki反应合成了用于检测舌癌和OSCC转移性淋巴结的新型多模式NIR-型加载TQTPA纳米探针HTCDDP。通过体内及体外实验发现，该探针除拥有良好的稳定性、水溶性、低毒性和pH/透明质酸酶敏感性外，HA包裹CDDP和TQTPA提高了探针的靶标能力并促进肿瘤中NPs的积累。此外，良好的组织渗透性使探针曝光于NIR后具有标记裸鼠舌癌边界和转移性淋巴结轮廓的功能，且精确度可达到1 mm，24 h信噪比肿瘤可达到8.06，淋巴结LN#2可达到3.55。与临床上应用的肿瘤成像NIR-型小分子药物ICG相比，具有更高荧光强度，除了实现转移性淋巴结的高敏感成像外，还可实现肿瘤血管网可视化，多方面满足临床需要，为未来临床新诊断疗法的应用奠定了坚实的基础。2 NIR纳米荧光探针相较于传统有机荧光染料，荧光纳米材料不仅毒性低、生物相容性好，且因其具有大的斯托克斯位移，光稳定性也优于荧光小分子，这些优势使得荧光纳米材料在生物光学传感及成像分析领域中有着举足轻重的地位。由于荧光纳米粒子的发射光谱更集中且易调控，目前基于量子点（quantum dots，QDs）、荧光金纳米团簇(Au nanoclusters，AuNCs)、上转化纳米粒子（upconversion nanoparticles，UCNPs）等构建了大量NIR荧光纳米探针以实现有效的荧光组织穿透性并获得高质量的目标组织图像34-36。2.1 纳米金探针荧光AuNCs是在一定分子层的保护下，由几个到几百个金属原子组成的聚集体，由于尺寸与电子费米能级接近，纳米团簇受量子局限效应较强，因而具有独特的光学性质。金纳米团簇具有特定的激发和发射光谱，且发射光谱随纳米团簇组成和粒径变化具有可调节性。此外，可以通过改变组成纳米团簇金原子的数目以及模板获得从紫外可见光区到NIR光区范围内的任意发射波长的金纳米团簇。Yan等37将牛血清白蛋白包裹金纳米粒子富集于氨基功能化的介孔二氧化硅（mesoporous silica，MSN）中合成MSNAuNCsNIR纳米粒子用于靶向标记Cal-27癌细胞。研究表明，MSNAuNCs无细胞毒性，成像灵敏度较未富集的AuNCs有所提高。同时，借助于金纳米团簇的大斯托克斯位移，可有效解决了纳米粒子浓度过高而导致的荧光淬灭效应问题，证实该纳米粒子在口腔癌诊治方面具有一定的应用潜力。Wang等38开发的孟加拉玫瑰共轭金纳米棒（Bengal Rose-gold nanorods，RB-GNR）探 针 在790810 nm区域表现出较强的光学吸收，对口腔癌细胞具有高特异性。通过监测NIR吸收波长的聚集诱导红移效应，实现了Cal-27口腔癌细胞裂解液的特异性定量分析，检测限为每毫升2 000个细胞。2种互补检测方法证实，RB-GNR探针的高灵敏度和特异性，有利于实现口腔癌细胞的无创光学诊断、筛查和监测。2.2 半导体QDs探针QDs是直径为210 nm，通常由周期表中的-，-，-或-族中元素组成的二元或三元原子团39。QDs 具有宽激发光谱、窄发射光谱、较高的荧光强度和稳定性、易于修饰等优点，并且在活体生物成像中具有很高的时空分辨率,是目前NIR荧光成像材料的研究热点。QD800由纳米级的原子簇组成，含几百到几 410第4期姜玥莹，等：近红外荧光探针在口腔癌诊断中应用的研究进展千个原子的半导体材料（镉与硒或碲），涂有硫化锌的半导体外壳，是一种最大发射波长位于800 nm的NIR QDs。据研究40报道，其可穿过血管，渗透组织直达肿瘤细胞，敏感性比CT和MRI高100倍。有学者将QD800与EGFR多克隆抗体结合形成QD800-EGFR抗体探针，靶向BcaCD885细胞及肿瘤组织中的EGFR以实现OSCC可视化。该探针稳定性良好且背景信号弱，体外标记BcaCD885细胞的荧光信号可持续24 h，体内对颊鳞状细胞癌组织具有高度穿透性，显像可持续6 h，且在15 min到6 h间维持高信噪比，可为术者提供充足的操作时间，因此在OSCC的体内成像和个性化手术疗法的开发方面具有广阔的前景。Lin等41设计的RENPCAu(UCA)纳米探针可以用于靶向TSCC的成像和治疗。RENPCAu（UCA）通过增强的上转换发光进行NIR成像，在约650 nm和1 064 nm处的2个峰相对稳定，猝灭较少，适合于发光生物成像。同时，多肽cMBP作用于OSCC细胞表面，靶向OSCC组织中高表达的c-met跨膜蛋白，作用于HGF/cMBP信号通路，实现精确靶向。体外体内实验均表明，所设计的探针对Cal27具有靶向性成像和治疗作用，表明其在TSCC的诊断和治疗中具有潜在的临床应用价值（表1）。3 总结与展望NIR荧光成像在口腔疾病诊断中具有诸多优点，如发光强度高、侵入性低、组织穿透性强、可实时成像等，可显著提高OSCC的诊断灵敏度，在多个领域及场景中显示出巨大的应用潜力，有望成为临床研究中OSCC实时精准可视化诊疗的有力工具。除上述提及的各种已应用于标记口腔癌细胞及组织的NIR探针外，一些探针在标记其他组织器官恶性肿瘤及生物感应的研究中也显示出优异的性能，如Wang等42构建的NIR纳米探针Mn-Doped Ag2Se可标记4T1细胞，有助于肿瘤的精确定位，还可以提高放射治疗的效果。尽管NIR荧光探针具有诸多优势，但作为一种辅助诊断方式，其特异性和敏感性相较于活检仍不足以独立应用于临床诊断。其次，当前材料仍处于研究的初级阶段，多种NIR探针与靶标结合时会伴随有毒重金属的快速释放（比如Cd、Pb、Ag等），具有优异性能的可实时成像的无重金属元素的NIR探针有待开发和研究；部分NIR探针生物相容性、水溶性及组织渗透性较差，未来可以开发出生物相容性更高、组织渗透性及穿透性更强、光学性能更好、灵敏度更高的探针；多数NIR探针因缺少靶向性可能会影响正常细胞及组织的生长和功能。因此，未来挖掘更多OSCC的靶标，更多探针的新材料、新结构至关重要。最后，深入研究NIR材料与口腔癌变细胞、组织的关系，提高口腔各类疾病诊断准确性，仍是未来口腔疾病诊断领域的重要研究课题。利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。表 1 不同类型NIR荧光探针的发射峰及其应用Tab 1 Emission peaks of different types of near-infrared fluorescent probes and their applications探针类型分子探针纳米探针金纳米QDsNIR荧光材料ICG-PDPN AbHNT-NTRpanitumumab-IRDye800CWIFP-O2Ce6-Vir-EGFRNGO-BBN-AF750HTCDDPMSNAuNCsRB-GNRQD800与EGFR AbRENPCAu(UCA)荧光发射峰/nm8206757956456657501 057600650790810800650和1 064应用UMSCC-81、HSC3体外荧光标记，裸鼠UMSCC-81、HSC3移植瘤HSC2、Cal-27体外荧光成像，裸鼠HSC2、Cal-27异种移植肿瘤HNSCC体外荧光成像Cal-27体外荧光成像Cal-27体外荧光成像，仓鼠颊囊致癌剂诱导模型HSC3体外荧光成像HSC3、SCC-4体外荧光成像，裸鼠HSC3异种移植舌癌及转移淋巴结NIR成像Cal-27体外荧光成像Cal-27体外荧光成像BcaCD885体外荧光成像Cal-27体外荧光成像，小鼠TSCC的NIR成像文献232426-272829303337384041 411国际口腔医学杂志 International Journal of Stomatology2023-07 50（4）4 参考文献1Vonk J,de Wit JG,Voskuil FJ,et al.Improving oral cavity cancer diagnosis and treatment with fluorescence molecular imagingJ.Oral Dis,2021,27(1):21-26.2Chakraborty D,Natarajan C,Mukherjee A.Advan-ces in oral cancer detectionJ.Adv Clin Chem,2019,91:181-200.3Neville BW,Day TA.Oral cancer and precancerous lesionsJ.CA A Cancer J Clin,2002,52(4):195-215.4Wu JX,Hanson M,Shaha AR.Sentinel node biopsy 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