利用CRISPR_Cas9系统构建LMNA基因突变 AC16人心肌细胞系.pdf

第 41 卷 第 3 期2023 年 5 月 广西师范大学学报(自然科学版)Journal of Guangxi Normal University(Natural Science Edition)Vol.41 No.3May 2023DOI:10.16088/j.issn.1001-6600.2022040602http:邹镭,邢兵,杨柳.利用 CRISPR/Cas9 系统构建 LMNA 基因突变 AC16 人心肌细胞系J.广西师范大学学报(自然科学版),2023,41(3):163-170.ZOU L,XING B,YANG L.Construction of AC16 human cardiomyocyte cell line with mutant LMNA gene by CRISPR/Cas9J.Journal ofGuangxi Normal University(Natural Science Edition),2023,41(3):163-170.利用 CRISPR/Cas9 系统构建 LMNA 基因突变AC16 人心肌细胞系邹 镭1,2,邢 兵1,2,杨 柳1,2(1.广西师范大学 生命科学学院,广西 桂林 541006;2.珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室(广西师范大学),广西 桂林 541006)摘 要:LMNA 基因突变引发核纤层蛋白(LaminA/C)及其互作蛋白表达异常,引起机体一系列生理学反应,导致核纤层蛋白病发生,目前其具体致病机制尚不清楚。本文利用 CRISPR/Cas9 技术,选取符合 sgRNA 筛选原则的致病突变位点,成功构建了携带 LMNA 突变 Q517X 的细胞系,并对突变细胞系与 LaminA/C 相连或互作的 LaminB1、PCNA、P53、PKC等基因的 RNA 表达水平与蛋白表达水平及突变细胞核膜骨架形态进行检测,发现:Q517X 突变细胞的 LaminB1、P53、PCNA 基因 mRNA 表达量显著降低约 70%;LaminA/C 蛋白几乎不表达,PKC、LaminB1、P53 等蛋白的表达量分别降低75%、60%、80%。结果表明,Q517X 突变通过改变 AC16 人心肌细胞 LMNA 相关基因的表达进而影响细胞核正常骨架结构与功能。关键词:LMNA;核纤层蛋白;核纤层蛋白病;CRISPR/Cas9;基因编辑中图分类号:Q78;R542.2 文献标志码:A 文章编号:1001-6600(2023)03-0163-08LMNA 基因位于染色体 1q22 上,编码区全长约 24 kb,包含 12 个外显子,主要编码 A 型与 C 型 2 种核纤层蛋白1。这 2 个异构体是通过 LMNA 基因 10 号外显子内的不同剪接产生的。核纤层蛋白 A 在结构上由 螺旋杆区的 1A、2A、1B、2B 这 4 个卷曲片段构成 Ig 尾部的免疫球蛋白(Ig)折叠体、分离线圈和 Ig域的核定位信号(NLS)组成2。核纤层蛋白 A 属于核中间丝家族,它与核纤层蛋白 B 交叉结合形成核纤层,排列在所有分化细胞的核膜内表面。自从在 LMNA 基因中发现了导致常染色体显性 Emery-Dreifuss 肌营养不良症的第 1 个突变,近 20 年来又发现了许多其他突变,按照发病的特定组织可以区分为心肌(扩张型心肌病)、骨骼肌(emery-dreifuss肌营养不良)、脂肪组织(家族性部分脂肪营养不良 2 型)、外周神经(charcot-marie-tooth 疾病 2B1 型)以及全身性疾病(早衰综合征)等一系列疾病,当前它们统称为核纤层蛋白病3-4。其中 LMNA 基因突变造成的扩张型心肌病占遗传性扩张型心肌病的 10%15%,其发病进程快,易诱发心率衰竭,猝死率高,且无法治愈5-7。目前,已经报道了 400 多种不同的 LMNA 突变,其中绝大多数为错义突变(http:www.umd.be/LMNA/)。这些突变散布在 LMNA 基因中。不同的 LMNA 突变会影响核纤层蛋白的不同功能和作用,例如核形态、完整性、机械传感和机械转导、与转录因子的直接相互作用、突变前核纤层蛋白的功能改变、核纤层蛋白加工的改变和相互作用的染色质改变等4。当前关于 LMNA 突变引发扩张型心肌病的具体分子机制尚未明确,为深入研究 LMNA 基因在遗传性扩张型心肌病发生发展中的重要作用,本文根据已报道的 LMNA 致病突变,利用基于 CRISPR/Cas9 系统的单碱基编辑技术构建 LMNA 突变人心肌细胞,并在基因表达水平与细胞水平研究其突变后对核膜及 LaminA/C 蛋白相连或互作的相关蛋白 LaminB1、PCNA、P53、PKC 等的基因表达及蛋白表达的影响,拟为后续开展深入的机制研究实验与药理实验奠定收稿日期:2022-04-06 修回日期:2022-07-27基金项目:国家自然科学基金(31560319)通信作者:杨柳(1983),男,河南汝南人,广西师范大学讲师,博士。E-mail:广西师范大学学报(自然科学版),2023,41(3)基础。1 材料与方法1.1 sgRNA 表达载体构建pncas9-cmv-pbece 与 pGL3-U6-sgRNA-puromycin 为中科院天津生物工业技术研究所毕昌浩教授馈赠。首先,根据模板 sgRNA 质粒片段,设计合成包含各突变点对应 gRNA 片段的环形 PCR 引物,再经过环形PCR,Dpn 酶消化降解模板质粒,与 Golden Gate 重连接的方法,将突变碱基所在的目的序列 gRNA 片段(N20)插入到 sgRNA 模板质粒上。gRNA 片段与对应突变点信息如表 1。环形 PCR 反应及 Golden Gate反应体系与反应程序见表 2 与表 3。表 1 gRNA 片段与对应突变点Tab.1 gRNA fragments with corresponding mutation sites突变缩写碱基gRNA 序列质粒简称R25Cc.73CTCACCCGCATCACCCGGCTGCS2L92Fc.274CTGACCCTTGACTCAGTAGCCAL4R435Cc.1303CTCGCACGCACTAGCGGGCGCGL5Q517Xc.1549CTGCACAGAACACCTGGGGCTGS5G608Gc.1824CTGTGGGCGGACCCATCTCCTCL7首先,对构建成功的 sgRNA 质粒序列进行测序鉴定,确保其准确性;然后,将其转化至 DH5 感受态细胞(索莱宝 Cat:C1100)内进行扩增;最后,使用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒(Cat:DP118-02)进行质粒的提取。2Super Pfx Mastermix 的 PCR 反应条件为:预变性 98 3 min;变性 98 10 s,退火 62 15 s,延伸72 150 s;变性到延伸进行 35 次循环,再 72 7 min 充分延伸,最后 25 5 min 完成反应。表 2 环形 PCR 反应体系Tab.2 Ring PCR reaction system组分容积/L2Super Pfx Mastermix2510 mol/L 前引物1.510 mol/L 后引物1.5模板质粒1DMSO3ddH2O18 表 3 Golden Gate 反应体系Tab.3 Golden Gate reaction system组分容积10BsaI(Eco31I)Buffer2 L10T4 连接酶 Buffer2 LBsaI(Eco31I)酶1 LT4 连接酶1 L胶回收产物100 ngddH2O补足至 20 LGolden Gate 反应条件:酶切 37 3 min,连接22 4 min、55 1 s,酶切和连接共25 个循环;酶灭活80 5 min、25 5 min、4保存。1.2 筛选单克隆细胞AC16 人心肌细胞用中桥新舟 F12 完全培养基(Cat:ZQ-601)进行培养,在细胞生长汇合至 80%左右用 1PBS 与 EDTA 胰蛋白酶(索莱宝 Cat:T1300)进行消化传代处理,传代比例为 1 传 5。将 AC16 细胞消化计数后,按照每孔 5104个细胞铺至 24 孔板内。按照 Lipo3000 脂质体转染试剂盒(赛默飞 Cat:L3000015)说明书将 2 个质粒共转染至 24 孔板 AC16 细胞内。再利用 sgRNA 质粒具有嘌呤霉素抗性基因的特性,在转染 24 h 后给细胞更换含有 4 mg/L 嘌呤霉素的 F12 完全培养基,杀伤未被转入质粒的细胞,461http:同时根据细胞杀伤情况,每隔 1224 h 吸出死细胞,更换含嘌呤霉素的新鲜 F12 完全培养基。转染 72 h后,将培养基中嘌呤霉素浓度降为 2 mg/L;转染 7 d 后,给观察到还有细胞存活且存活细胞呈单个或数个分布的细胞孔换成无嘌呤霉素的 F12 完全培养基,继续培养并进行扩大培养,再将筛选出来的细胞提取DNA 进行测序验证。若得到含有突变细胞系的细胞,则通过 96 孔板有限稀释法筛选出携带点突变的单克隆细胞。1.3 荧光定量将筛选出的突变细胞 Q517X 与野生型 AC16 细胞扩大培养后,消化下来,用诺维赞快速总 RNA 提取试剂盒(Cat:RC112)提取总 RNA,再用 TaKaRa 反转录试剂(Cat:RR036A)与荧光定量试剂(Cat:RR820A)结合相关 PCR 仪进行逆转录与荧光定量验证实验,以人源 GAPDH 基因为内参基因,检测 LMNA突变对核膜功能相关基因 mRNA 表达量的影响。内参基因及检测目的基因的名称与对应引物序列见表 4。表 4 本实验所用荧光定量引物Tab.4 Primers for fluorescence quantification in this experiment基因前引物(53)后引物(53)GAPDHCATCTCTGCCCCCTCTGCTGAGGATGACCTTGCCCACAGCCTP53CCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCGCAGCGCCTCACAACCTCCGTCATNup88GGGCGTATACCGCATCTCTAAGTTATCTTCAGCCGCAGGALaminB1AAGCATGAAACGCGCTTGGAGTTTGGCATGGTAAGTCTGCPCNAGGAAATGGAAACATTAAATTGTCACGAGTGGCTTTTGTAAAGAAGTTCAGPKCGCAAAGGAGCAGAGAACTTACTGCACTCTGTAAGATGGP21GGATGTCCGTCAGAACCCATGTGGGAAGGTAGAGCTTGGG1.4 蛋白免疫印迹提取突变细胞与野生型 AC16 细胞的总蛋白,并进行免疫印迹实验。以-Actin 蛋白为内参蛋白,检测突变对核膜功能相关基因蛋白表达量的影响。其中,免疫印迹所用一抗按照 1 1 000 稀释溶于 TBST质量浓度为 5%脱脂牛奶内,所用二抗按照 1 5 000 稀释于相同溶液。蛋白免疫印迹及后续免疫荧光实验所用相关抗体信息见表 5。表 5 本实验所用抗体Tab.5 Antibodies used in this experiment抗体名称规格公司WB 抗体LaminB1 Rabbit pAbA16909爱博泰克生物PCNA Rabbit pAbA0264爱博泰克生物LaminA/C Rabbit pAbA0249爱博泰克生物PKC Rabbit mAbA11107爱博泰克生物P53 Rabbit pAbA0263爱博泰克生物Emerin/EMD Rabbit pAbA1132爱博泰克生物Anti-beta Actin Mouse mAbGB12001武汉赛维尔生物Anti-rabbit IgG Antibody7074sCSTAnti-mouse IgG Antibody7076sCST免疫荧光抗体LaminA/C Rabbit pAbA0249爱博泰克生物Rabbit IgG(H+L)Cross-AdsorbedSecondary AntibodyA11011Thermo Fisher561广西师范大学学报(自然科学版),2023,41(3)1.5 免疫荧光将 2 种细胞消化铺板至已放入细胞爬片的 24 孔板内,同时转入带绿色荧光的标签质粒,利用免疫荧光技术对突变细胞与野生型 AC16 细胞的 LaminA/C 蛋白进行染色,并用 DAPI 对细胞核进行染色,检验突变对核膜蛋白及细胞核结构造成的影响。实验过程使用的抗体按照 1 100 稀释溶于 1PBS 质量浓度为 5%的 BSA 溶液内。使用 Zeiss 激光共聚焦显微镜(LSM 710)进行拍照。1.6 统计方法数据采用 GraphPad Prism 8 软件进行 one-way ANOVA 分析,将 2 个突变细胞分别与野生型细胞进行对比。图标制作使用 Office PowerPoint、ImageJ 与 GraphPad Prism 8 等软件。实验数据的统计结果以平均值标准差(standard deviation,SD)表示,P0.05 表示有统计学差异,P0.01 表示统计学差异显著,P0.001表示统计学差异非常显著。2 结果与分析2.1 成功构建 5 个 sgRNA 表达载体利用环形 PCR 与酶切酶连的方法,成功构建出 5 个含有目标突变点 N20 的 sgRNA 质粒。质粒电泳凝胶鉴定结果与测序结果见图 1。重组质粒 PCR 产物电泳结果与预期一致,表明质粒 Golden Gata 成功;测序结果表明插入片段与设计的 sgRNA 相同。L4、L5、L7、S2、S5 分别为 L92F、R435C、G608G、R25C、Q517X 等突变的对应重组质粒图 1 重组质粒鉴定结果Fig.1 Identification of recombinant plasmid results661http:2.2 成功筛选出 Q517X 单克隆突变细胞系通过转染与筛选,成功得到携带致病单碱基突变的细胞系 Q517X。突变细胞系测序结果见图 2。图 2 突变细胞测序结果Fig.2 Sequencing results of mutant cells2.3 LMNA 突变影响 LMNA 及其相关基因 mRNA 的表达量荧光定量实验结果表明,相对于野生型 AC16 细胞,Q517X 突变细胞的 LaminB1、PKC、P53、PCNA 基因 mRNA 表达量显著降低,见图 3。表示 P0.01图 3 突变细胞荧光定量结果Fig.3 Fluorescence quantitative analysis of mutant cells2.4 LMNA 突变影响核纤层蛋白及其相关蛋白的表达量将野生型细胞与突变细胞消化后提取蛋白,并将多次独立蛋白样品进行免疫印迹检测,结果见图 4(a);使用测量灰度值的方法,将多次独立样品蛋白表达量进行定量分析与均一化处理后得到数据模型图(图 4(b)。蛋白免疫印迹结果表明,Q517X 突变细胞几乎不表达 LaminA/C 蛋白,且其 PKC、LaminB1、P53 蛋白的表达量均显著降低,其余相关蛋白的表达量变化不显著。2.5 LMNA 突变影响核膜骨架结构的稳定利用免疫荧光技术显示出 LaminA/C 蛋白的表达量与分布结构变化,结合 DAPI 染色显示细胞核可以发现,Q517X 突变细胞与 WT-AC16 细胞相比,LaminA/C 蛋白表达量减少,核膜形态突变后由正常的椭圆形变为不规则形状,核骨架结构不完整,细胞核膜稳定性被破坏,见图 5。3 讨论LMNA 无义突变 Q517X 在 2012 年首先发现于德国的一名扩张型心肌病患者,德国研究团队通过DNA 测序筛查与建立家族遗传图谱的方法,确定了该基因突变为扩张型心肌病的病因,并将其归类为核纤层蛋白病8。后续研究发现,蛋白激酶 C(PKC)与核纤层蛋白 A/C 存在相互作用,Q517X 突变可能会影响 LMNA 基因与 PKC 的结合位点,而蛋白激酶 C(PKC)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,属于传统 PKC761广西师范大学学报(自然科学版),2023,41(3)图 4 突变细胞免疫印迹结果Fig.4 Immunoblotting results of mutant cells红色为 LaminA/C 蛋白标记荧光,绿色为转染 GFP 绿色荧光标签质粒后所显示荧光,蓝色为细胞核经 DAPI 染色后所发荧光图 5 突变细胞免疫荧光染色结果Fig.5 Results of immunofluorescence staining of mutant cells家族的成员,具有 4 个保守区域(C1 至 C4)9。这种普遍表达的 PKC 同种型响应于许多不同种类的刺激而被激活,并与细胞质内的脂质结合,转移到细胞核、黏着斑等发挥作用的特定区域。因此,PKC 参与包括增殖、凋亡、分化、迁移和炎症等多种细胞功能的调节10-11。同时有研究表明,LMNA 基因突变导致的扩张型心肌病与 DNA 损伤通路中肿瘤蛋白 P53 的减少紧密相关12-13。这说明 LMNA 基因发生突变后,不仅影响核纤层蛋白自身的表达量及结构与功能,而且会通过影响与其相连或相互作用蛋白的表达与功能,从而引起机体一系列生理反应,最终导致疾病发生。本文研究结果表明,Q517X 无义突变会降低LaminB1、P53、PCNA 等与细胞核骨架稳定或细胞增殖能力相关基因的表达,从而在细胞水平上破坏了核膜结构,使细胞核的正常功能受到破坏。有关核纤层蛋白病的致病机制可以归纳为基因表达假说、机械损伤假说,或两者的结合14-15。作为一种主要由 LMNA 突变引起的疾病,由于基因突变的随机性及对患者进行基因测序诊断可能涉及到患者隐私安全问题,目前已经发现并报道的 LMNA 突变相关扩张型心肌病患者仍然不多,这给其致病机制的探究与治疗方法的筛选带来障碍。但随着 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的发展及完善,以及随之而来的大批与基因突变相关遗传病研究成果的产出,特别是 2021 年哈佛大学刘如谦团队报道了应用碱基编辑技术逆转 LMNA 突变小鼠的早衰症状,为碱基编辑技术在核纤层蛋白病的应用提供了指引16-21。861http:4 结语本文通过应用碱基编辑技术构建了 1 种携带 LMNA 致病单碱基突变的人心肌细胞,并证实了这些突变确实会对该细胞核纤层蛋白相关蛋白及核膜功能相关蛋白产生影响,破坏细胞核膜稳定;初步证实了该细胞模型的正确性,但其具体关联机制及如何通过药物或其他方法抑制 LMNA 突变造成的破坏有待进一步深入研究。参 考 文 献1 LIN F,WORMAN H J.Structural organization of the human gene encoding nuclear lamin A and nuclear lamin CJ.Journal of Biological 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Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection(Guangxi Normal University),Ministry of Education,Guilin Guangxi 541006,China)Abstract:Mutations in LMNA(LaminA/C)gene trigger abnormal expression of nucleofibrillar proteins andtheir linked or interacting proteins,causing a series of physiological responses in the body and leading to thedevelopment of nucleofibrillar protein disease,however,the specific pathogenic mechanism of the disease is stillunclear.In this paper,a cell line carrying LMNA mutation Q517X is successfully constructed by using CRISPR/Cas9 technology to select pathogenic mutation loci in accordance with the sgRNA screening principle,andexamined the RNA expression levels and protein expression levels of LaminB1,PCNA,P53,PKC and othergenes linked to or interacting with LaminA/C in the mutant cell line and the nuclear membrane of the mutantcells.It was found that Q517X mutant cells were not mutated,and the mRNA expression of LaminB1,P53 andPCNA genes were significantly reduced by about 70%in Q517X mutant cells,and the expression of LaminA/C,PKC,LaminB1 and P53 proteins were significantly reduced by 75%,60%and 80%respectively in Q517Xmutant cells.The results showed that the Q517X mutation altered the expression of LMNA-related genes inhuman cardiomyocytes and thus affected the normal cytoskeletal structure and function of the nucleus.Keywords:LMNA;LaminA;Laminopathies;CRISPR/Cas9;gene editing(责任编辑 马殷华)071