林下连作种植参根际土壤可培养微生物区系及细菌群落对酚酸类化感物质的响应.pdf

广西科学,2 0 2 3年,3 0卷,第3期 G u a n g x i S c i e n c e s,2 0 2 3,V o l.3 0 N o.3收稿日期:2 0 2 2 1 1 3 0 修回日期:2 0 2 3 0 1 1 8*广西科技基地和人才专项(桂科A D 1 8 2 8 1 0 6 6),广西科技重大专项(桂科AA 1 8 2 4 2 0 2 6)和广西民族大学科研基金项目(2 0 1 7 K J Q D 0 0 6)资助。【第一作者简介】陈福慧(1 9 9 7-),女,在读硕士研究生,主要从事微生物在绿色农业上的应用研究。【*通信作者】王一兵(1 9 7 4-),女,博士,研究员,硕士研究生导师,主要从事海洋生物资源开发与利用研究,E m a i l:w y b g x u n 1 6 3.c o m。【引用本文】陈福慧,谢勇俊,贾清文,等.林下连作种植参根际土壤可培养微生物区系及细菌群落对酚酸类化感物质的响应J.广西科学,2 0 2 3,3 0(3):4 6 8 4 7 7.C HE N F H,X I E Y J,J I A Q W,e t a l.R e s p o n s e o f C u l t u r a b l e M i c r o f l o r a a n d B a c t e r i a l C o mm u n i t y t o P h e n o l i c A l l e l o c h e m i c a i n R h i z o s p h e r e S o i l o f C o n t i n u o u s C r o p p i n g P a n a x g i n s e n g C.A.M e y e r u n d e r F o r e s t J.G u a n g x i S c i e n c e s,2 0 2 3,3 0(3):4 6 8 4 7 7.生物科学林下连作种植参根际土壤可培养微生物区系及细菌群落对酚酸类化感物质的响应*陈福慧1,谢勇俊1,贾清文2,申乃坤1,姜明国1,李枢妍1,李时勇1,王一兵1*(1.广西民族大学海洋与生物技术学院,广西多糖材料与改性重点实验室,广西南宁 5 3 0 0 0 8;2.白山市科学技术研究所,吉林白山 1 3 4 3 0 0)摘要:为探究酚酸类成分对林下连作参根际土壤中微生物区系及可培养细菌群落的影响,以未栽培人参(P a-n a x g i n s e n g C.A.M e y e r)林地土壤(1#样品)、连作未发病土壤(2#样品)和连作发病土壤(3#样品)为研究对象,探究根际土壤中微生物区系及可培养细菌群落结构、多样性的变化。同时,通过高效液相色谱(H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y,H P L C)分析方法对土壤样品中的酚酸进行定性和定量分析。结果表明,2#样品和3#样品土壤可培养微生物总数量与1#样品相比分别下降6 1.3 7%和6 8.2 4%;可培养细菌分别下降6 1.3 6%和6 8.1 8%;可培养放线菌分别下降7 2.9 7%和7 5.6 8%;可培养真菌分别为1#样品的1.4 0倍和0.4 7倍。3种样品共分离到1 9 3株细菌,分属于4门6纲1 3目1 9科3 9属9 6种。3种样品中最优势菌纲均为芽孢杆菌纲B a c i l l i(相对分离频率分别为5 1.6 7%、6 4.0 0%、4 8.2 8%),1#样品、2#样品最优势菌属为芽孢杆菌属B a c i l l u s(相对分离频率分别为1 5.0 0%、2 1.3 3%),3#样品最优势菌属为链霉菌属S t r e p t o m y c e s(相对分离频率为2 4.1 4%)。多样性分析显示,3种样品土壤可培养细菌多样性差异小且分布均较为均匀。3#样品中大量积累的香豆酸可能是人参连作障碍的主导化感物质。连作和土传病害未导致人参根际土壤可培养细菌群落多样性下降。土壤微生物总量的减少、可培养微生物区系的变化、高丰度的链霉菌属,以及香豆酸的积累可能是导致人参土传病害严重和连作障碍的主要原因。关键词:人参;根际土壤;土传病害;连作障碍;微生物多样性;酚酸;化感物质中图分类号:S 5 6 7 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 5 9 1 6 4(2 0 2 3)0 3 0 4 6 8 1 0D O I:1 0.1 3 6 5 6/j.c n k i.g x k x.2 0 2 3 0 4 0 7.0 0 1 人参(P a n a x g i n s e n g C.A.M e y e r)是五加科(A r a l i a c e a e)人参属(P a n a x L.)多年生宿根草本植物,是一种名贵的中药材,在中国主要分布于长白山地区,具有治疗神经系统、心脑血管系统疾病,抗肿瘤864陈福慧,谢勇俊,贾清文,等.林下连作种植参根际土壤可培养微生物区系及细菌群落对酚酸类化感物质的响应等方面的作用1。由于野生人参资源较为稀少,早在西晋时期便开始人参栽培,清朝乾隆至同治年间,人参栽培发展迅速,规模逐渐扩大2。如今随着市场需求的增加,人参的栽培已较为常见,其中林下参的品质较高。人参极易发生土传病害和连作障碍,有关文献表明,酚酸类自毒物质的积累,是导致人参连作障碍的主要原因3,4。但李崇玮等5研究发现西洋参连作过程中出现了酚酸类代谢产物含量降低的现象。杨莉等6证实人参根际分泌物中有机酸类物质(苯甲酸、邻苯二甲酸、己二酸、丁二酸)即公认的化感物质,对人参生防菌的促进作用大于病原菌,对部分病原菌生长具有直接的抑制活性。连作是土传病害的主要成因,林间连续种植人参,使得人参土传病害的致病菌连年繁殖,在土壤中大量积累进而形成病土,并且可以通过土壤和病残体进行传播,从根部或茎部侵害作物导致其发生病害,并且土传病害具有分布广、传播快、危害大等特点7。人参作为以根部入药的植物,土传病害严重影响了人参的产量及质量8。本研究采样地为吉林省临江市人参实验基地,2年参苗移栽4年后出现了健康和严重土传病害(人参根腐病和人参锈腐病)两种现象,为开展连作和土传病害对土壤微生物群落影响的研究提供了可靠样本。有关人参连作障碍和土传病害的研究大多集中于土壤病原真菌、土壤微生物群落的变化,以及化感物质的成分组成及含量,而关于土壤微生物群落对酚酸类化感物质变化响应的相关研究较少。因此本研究以空白林地土为对照,以连作健康林地参、连作土传病害严重林地参根际土壤为研究对象,从土壤可培养细菌群落入手,研究酚酸类化感物质对连作人参根际土壤中微生物区系及可培养细菌群落多样性的影响,并探讨连作后健康和土传病害严重两种样品可培养细菌优势菌属差异,为人参连作障碍的研究提供参考。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 土壤样品 供试土壤样品由吉林省白山市科学技术研究所进行采集,实验基地位置:吉林省临江市蚂蚁河乡三棚湖村(北纬4 1 5 1 0 2.8 0,东经1 2 7 6 2 1.8 1),海拔8 3 3 m。采用五点采样法,所选区域去表层1 0 c m土后,采 集 人 参 根 际 土 并 混 匀。所 采 样 品 置 于 冰 箱-2 0 保存,用于土壤微生物区系及可培养细菌的变化分析,其余样品自然风干后用于酚酸类物质的提取。对所采样品进行编号,1#样品为未种植人参的林地土壤,2#样品为2年参苗移栽连作4年、健康林地参根际土壤,3#样品为2年参苗移栽连作4年、产生严重土传病害林地参根际土壤。每个土壤样品设置3组重复。1.1.2 试剂 细菌D NA提取药品C h e l e x 1 0 0 s o d i u m(美国S I GMA公司),琼脂粉(德国B i o f r o x x公司),色谱级乙腈(诺尔施科技有限公司)。1.1.3 仪器与设备 Z H J H C 1 1 0 6 B型超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司),Z X S D B 1 1 6 0型生化培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司),ZWY 2 2 1 2 B型全温度恒温 摇 床(上 海 智 城 分 析 仪 器 制 造 有 限 公 司),G 1 5 4 D P型全自动立式高压灭菌锅 致微(厦门)仪器有限公司,B C D 5 2 1WD PW型冷藏冷冻冰箱(青岛海尔股份有限公司),A R 2 2 4 C N型电子天平 奥豪斯仪器(常州)有限公司,T 1 0 0型梯度P C R仪(美国B I O R A D公司),L E G E N D M I C R O 1 7型微量台式离心机(美国T h e r m o F i s h e r公司),D YY 6 C型电泳仪(北京六一生物科技有限公司),J Y 0 2型紫外透射仪(北京君意东方电泳设备有限公司),L C 1 0 0型高效液相色谱仪(上海伍丰科学仪器有限公司),OAA C 1 8色谱柱 月旭科技(上海)股份有限公司,OAA型保护柱 月旭科技(上海)股份有限公司。1.2 方法1.2.1 土壤酚酸类成分的提取与鉴定 土壤酚酸提取参照李崇玮等5的方法。酚酸混标:分别精密称取香豆酸5.1 m g、香草酸4.6 m g、水杨酸5.0 m g、苯甲酸5.4 m g、肉桂酸4.4 m g、没食子酸4.8 m g、丁香酸4.6 m g、阿魏酸5.0 m g,分别置于1 m L容量瓶中制成母液。梯度稀释后经高效液相色谱(H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y,H P L C)分析,以酚酸浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行标准曲线绘 制。在2 8 0 n m紫 外 波 长 下 进 行H P L C检测分析。甲酸水溶液(0.1%,V/V)和乙腈做流动相,进样体积2 0 L,流速1.0 m L/m i n,洗脱梯度为5%-1 0%乙腈(0-1 0 m i n),1 0%-1 0%乙腈(1 0-2 0 m i n),1 0%-3 5%乙腈(2 0-6 0 m i n),3 5%-6 0%乙 腈(6 0-7 5 m i n),6 0%-6 0%乙 腈964广西科学,2 0 2 3年,3 0卷,第3期 G u a n g x i S c i e n c e s,2 0 2 3,V o l.3 0 N o.3(7 5-8 5 m i n),6 0%-5%乙腈(8 5-8 6 m i n),5%-5%乙腈(8 6-9 0 m i n)并保持5 m i n。每次进样间隔用流动相使柱平衡1 0 m i n。1.2.2 土壤可培养微生物数量的测定 土壤细菌、真菌、放线菌数量的测定采用稀释平板计数法9。细菌使用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,真菌使用虎红(孟加拉红)琼脂培养基,放线菌使用高氏一号琼脂培养基。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基:牛肉膏3 g、蛋白胨1 0 g、氯化钠 5 g、琼脂2 0 g、水1 0 0 0 m L、p H值7.4-7.6。高氏一号琼脂培养基:硝酸钾 1 g、磷酸氢二钾 0.5 g、七水硫酸镁 0.5 g、氯化钠 0.5 g、硫酸亚铁 0.0 1 g、可溶性淀粉2 0 g、琼脂2 0 g、水1 0 0 0 m L、p H值7.4-7.6。虎红(孟加拉红)琼脂培养基:蛋白胨5 g、葡萄糖1 0 g、磷酸二氢钾1 g、七水硫酸镁 0.5 g、琼脂2 0 g、孟加拉红0.0 3 3 3 g、氯霉素0.1 g、水1 0 0 0 m L。1.2.3 土壤中可培养细菌的分离纯化 采用L B、N B、T S A、Z o b e l l 2 2 1 6 E、R 2 A 5种培养基,通过稀释涂布和平板划线的方法进行可培养细菌的分离纯化1 0。取-2 0 保存的土壤样品各2.5 g,加入盛有2 2.5 m L无菌水和适量无菌玻璃珠的无菌三角 瓶 内。于 摇 床 上2 0 0 r/m i n、2 5 振 荡1 0 m i n,静置后取上清液梯度稀释后涂布。涂布后置于3 0 恒温培养箱倒置培养3 d。随后采用平板划线的方法对其进行分离纯化。纯化为单一菌株后用甘油管置于-2 0 冰箱保存。L B培养基:胰蛋白胨1 0.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、氯化钠1 0 g/L、琼脂1 5.0 g/L、p H值7.00.2(2 5)。N B培养基:蛋白胨1 0.0 g/L、牛肉浸粉3.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、琼脂1 5.0 g/L、p H值7.20.2(2 5)。T S A培养基:胰蛋白胨1 5.0 g/L、大豆胨5.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、琼脂1 5.0 g/L、p H值7.30.2(2 5)。Z o b e l l 2 2 1 6 E培养基:蛋白胨5.0 g/L、酵母粉1.0 g/L、柠檬酸铁0.1 g/L、氯化钠1 9.4 5 g/L、氯化镁5.9 8 g/L、硫酸钠3.2 4 g/L、氯化钙1.8 g/L、氯化钾0.5 5 g/L、碳酸钠0.1 6 g/L、溴化钾0.0 8 g/L、氯化铯0.0 3 4 g/L、硼酸0.0 2 2 g/L、硅酸钠0.0 0 4 g/L、氟化钠0.0 0 2 4 g/L、硝酸铵0.0 0 1 6 g/L、磷酸氢二钠0.0 0 8 g/L、琼 脂1 5.0 g/L、p H值7.60.2(2 5)。R 2 A培养基:胰蛋白胨0.2 5 g/L、酸水解酪蛋白0.5 g/L、酵母浸粉0.5 g/L、可溶性淀粉0.5 g/L、磷酸氢二钾0.3 g/L、硫酸镁0.1 g/L、丙酮酸钠0.3 g/L、琼脂1 2.0 g/L、蛋白胨0.2 5 g/L、葡萄糖0.5 g/L、p H值7.20.2(2 5)。1.2.4 细菌1 6 S r D NA分子鉴定 纯化为单一菌株后进行1 6 S r D NA提取及P C R扩增。采用1 0%的C h e l e x 1 0 0溶液提取细菌D NA,细菌1 6 S r D NA的 鉴 定 选 择 通 用 引 物2 7 F(5 AGAG T T T GAT C C T G G C T AG 3)和1 5 4 1 R(5 AAG GAG G T GAT C C AG C C G C A 3)作 为 引 物,利用5 0 L体系(P C R M i x 2 5 L、d d H2O 2 2 L、引物2 7 F 1 L、引物1 5 4 1 R 1 L、D NA模板1 L)进行P C R扩增,1%琼脂糖凝胶电泳检测后,送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果输入E z B i o C l o u d数据库以及N C B I网站进行比对,获得所培养菌株的最相似模式菌株,获取模式菌株1 6 S r D NA基因序列。通过ME GA 6.0软件,采用邻接法(N e i g h b o r j o i n i n g)和K i m u r a双参数模型进行聚类分析并构建系统发育树,设定自展值(B o o t s t r a p v a l u e)1 0 0 0评估系统发育树的拓扑结构稳定性。1.2.5 可培养细菌多样性指数 采用辛普森(S i m p s o n)多样性指数(D)、香农威纳(S h a n n o n W i e n e r)指数(H)、香农威纳(S h a n n o n W i e n e r)均匀度指数(E)计算3种样品可培养细菌多样性1 1。计算公式如下:D=1-Si=1(Pi)2=1-Si=1(NiN)2,H=-Si=1Pil nPi,E=Hl nS,式中,S为菌种数。Pi为第i种的多度比例,即群落中物种i的个体占总个体的比例。Ni是第i种的菌株数,N是所有菌株数总和。1.2.6 实验数据处理 采用E x c e l软件对实验数据进行统计及初步分析;采用S P S S S t a t i s t i c s 2 1软件进行数据的显著性分析;采用单因素方差分析(O n e w a y ANOVA)比较显著差异性,显著性水平设置为0.0 5;采用最小显著性差异(L e a s t S i g n i f i c a n t D i f f e r e n c e,L S D)法进行多074陈福慧,谢勇俊,贾清文,等.林下连作种植参根际土壤可培养微生物区系及细菌群落对酚酸类化感物质的响应重比较分析;采用O r i g i n 2 0 1 9进行图表的制作。2 结果与分析2.1 3种土壤中酚酸类成分及含量的测定 图1为8种酚酸混标及3种土壤样品中酚酸类物质的高效液相色谱分离图,8种酚酸均可良好分离,峰形良好。经高效液相色谱分析,3种土壤样品中均含有实验所选取的8种酚酸标品。表1为3种土壤样品中酚酸的含量,其中与1#样品相比,2#样品中没食子酸、阿魏酸、肉桂酸的含量出现了积累,含量分别增加2 6.7 4%、1 1.0 5%、3 3.5 0%;3#样品中香豆酸和肉桂酸含量分别增加3 4 4.9 7%、5 8.6 2%。而香草酸、丁香酸、水杨酸、苯甲酸含量与预期相反,出现了不同水平的下降,且差异显著(P0.0 5)。1.g a l l i c a c i d,2.v a n i l l i c a c i d,3.s y r i n g i c a c i d,4.f e r u l i c a c i d,5.s a l i c y l i c a c i d,6.b e n z o i c a c i d,7.c o u m a r i c a c i d,8.c i n n a m i c a c i d.图1 8种酚酸混标及3种土壤样品中酚酸类物质的HP L C分离图F i g.1 H P L C s e p a r a t i o n d i a g r a m o f 8 p h e n o l i c a c i d s m i x t u r e a n d p h e n o l i c a c i d c o m p o n e n t s o f t h r e e s o i l s a m p l e s表1 3种土壤样品中酚酸的含量T a b l e 1 C o n t e n t s o f p h e n o l i c a c i d s i n t h e t h r e e s o i l s a m p l e s U n i t:m g/k g样品编号S a m p l e n u m b e r没食子酸G a l l i c a c i d香草酸V a n i l l i c a c i d丁香酸S y r i n g i c a c i d阿魏酸F e r u l i c a c i d水杨酸S a l i c y l i c a c i d苯甲酸B e n z o i c a c i d香豆酸C o u m a r i c a c i d肉桂酸C i n n a m i c a c i d1#2.5 0 60.0 0 0 b6.8 0 50.0 0 0 a3.1 2 70.0 0 0 a1.7 9 20.0 0 0 b8.1 1 40.0 0 0 a3.7 2 80.0 0 0 a0.1 6 90.0 0 0 b0.2 0 30.0 0 0 c2#3.1 7 60.0 0 0 a4.5 5 50.0 0 c2.2 5 10.0 0 0 c1.9 9 00.0 0 0 a2.8 4 00.0 0 0 c1.6 4 80.0 0 0 c0.1 4 80.0 0 0 c0.2 7 10.0 0 0 b3#2.3 4 40.0 0 0 c4.7 2 80.0 0 0 b3.0 7 30.0 0 0 b1.7 5 80.0 0 0 c4.7 0 90.0 0 0 b2.9 7 70.0 0 0 b0.7 5 20.0 0 0 a0.3 2 20.0 0 0 aN o t e:d i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s b e h i n d n u m e r i c v a l u e s i n t h e s a m e c o l u m n i n d i c a t e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P0.0 5).2.2 3种土壤中可培养微生物区系的探究 表2为1#样品、2#样品和3#样品可培养微生物数量测试结果。由表2可知,2#样品和3#样品可培养微生物总量与1#样品相比明显下降,差异显著(P0.0 5),细菌和放线菌数量也均低于1#样品,差异显著(P0.0 5)。2#样品的真菌数量高于1#174广西科学,2 0 2 3年,3 0卷,第3期 G u a n g x i S c i e n c e s,2 0 2 3,V o l.3 0 N o.3样品,但3#样品的真菌数量明显低于1#样品,且两者均差异显著(P0.0 5)。真菌群落在土壤总微生物群落中的占比随着人参的长期种植出现明显的上升,由0.0 6 7 6%上升为0.2 4 5 0%和0.0 9 9 3%。土壤可培养微生物区系发生了细菌型向真菌型的转化。表2 3种土壤样品中可培养微生物数量T a b l e 2 Q u a n t i t y o f c u l t u r a b l e m i c r o o r g a n i s m s i n t h e t h r e e s o i l s a m p l e s样品编号S a m p l e n u m b e r细菌数量/(1 07 C F U/g)B a c t e r i a n u m b e r/(1 07 C F U/g)真菌数量/(1 04 C F U/g)F u n g i n u m b e r/(1 04 C F U/g)放线菌数量/(1 05 C F U/g)A c t i n o m y c e t e s n u m b e r/(1 05 C F U/g)微生物总数量/(1 07 C F U/g)T o t a l m i c r o o r g a n i s m s n u m b e r/(1 07 C F U/g)1#8.80.1 2 a6.00.3 6 b7.40.4 8 a8.8 80.3 4 a2#3.40.1 2 b8.40.3 6 a2.00.4 8 b3.4 30.3 5 b3#2.80.1 2 b2.80.1 2 c1.80.3 6 b2.8 20.3 5 cN o t e:d i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s b e h i n d n u m e r i c v a l u e s i n t h e s a m e c o l u m n i n d i c a t e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P0.0 5).2.3 3种土壤中可培养细菌分离鉴定结果 通过多种培养基培养,从3种人参栽培土壤样品中共分离得到1 9 3株细菌(含放线菌)。对1 9 3株菌进行1 6 S r D NA序列测序,测序结果经E z B i o C l o u d数据库及N C B I网站进行比对,显示1 9 3株菌株分属于4门6纲1 3目1 9科3 9属9 6种。表3为1#样品、2#样品和3#样品的可培养细菌的纲水平相对分离频率。2#样品芽孢杆菌纲B a c i l l i和放线菌纲A c t i n o b a c t e r i a的相对分离频率明显上升,变形菌纲B e t a p r o t e o b a c t e r i a的相对分离频率下降,3#样品中芽孢杆菌纲的相对分离频率下降,放线菌纲的相对分离频率上升。表明土传病害导致土壤中芽孢杆菌纲和变形菌纲细菌含量显著下降,放线菌纲细菌含量明显上升。表3 3种土壤样品中可培养细菌的纲水平相对分离频率T a b l e 3 R e l a t i v e i s o l a t i o n f r e q u e n c y o f c u l t u r a b l e b a c t e r i a i n t h e t h r e e s o i l s a m p l e s a t c l a s s l e v e l样品编号S a m p l e n u m b e r纲C l a s s细菌株数N u m b e r o f b a c t e r i a相对分离频率/%R e l a t i v e i s o l a t i o n f r e q u e n c y/%1#B a c i l l i3 15 1.6 7A c t i n o b a c t e r i a1 52 5.0 0B e t a p r o t e o b a c t e r i a81 3.3 3G a mm a p r o t e o b a c t e r i a35.0 0A l p h a p r o t e o b a c t e r i a35.0 02#B a c i l l i4 86 4.0 0A c t i n o b a c t e r i a2 12 8.0 0G a mm a p r o t e o b a c t e r i a68.0 03#B a c i l l i2 84 8.2 8A c t i n o b a c t e r i a2 44 1.3 8A l p h a p r o t e o b a c t e r i a23.4 5G a mm a p r o t e o b a c t e r i a23.4 5B e t a p r o t e o b a c t e r i a11.7 2S p h i n g o b a c t e r i i a11.7 2 图2为1#样品、2#样品和3#样品属水平相对分离频率。1#样品和2#样品芽孢杆菌属B a c i l l u s相对分离频率最高,分别为1 5.0 0%和2 1.3 3%,3#样品链霉菌属S t r e p t o m y c e s相对分离频率最高,为2 4.1 4%。类芽孢杆菌属P a e n i b a c i l l u s相对分离频率出现明显降低,在3种土壤样品中分别为1 1.6 7%(1#样品)、1 0.6 7%(2#样品)、6.9 0%(3#样品)。274陈福慧,谢勇俊,贾清文,等.林下连作种植参根际土壤可培养微生物区系及细菌群落对酚酸类化感物质的响应图2 3种土壤样品可培养细菌属水平相对分离频率F i g.2 R e l a t i v e i s o l a t i o n f r e q u e n c y o f c u l t u r a b l e b a c t e r i a i n t h e t h r e e s o i l s a m p l e s a t g e n u s l e v e l 表4为3种土壤样品可培养细菌多样性指数。3#样品中土壤可培养细菌的辛普森多样性指数、香农威纳指数、香农威纳均匀度指数均最高,2#样品最低,3种样品的多样性差异并不明显。表4 3种土壤样品可培养细菌多样性指数T a b l e 4 D i v e r s i t y i n d e x o f c u l t u r a b l e b a c t e r i a i n t h e t h r e e s o i l s a m p l e s样品编号S a m p l e n u m b e r多样性指数D i v e r s i t y i n d e x辛普森多样性指数S i m p s o n(D)香农威纳指数S h a n n o n W i e n e r(H)香农威纳均匀度指数S h a n n o n W i e n e r e v e n n e s s i n d e x(E)1#0.9 5 1 73.3 3 9 90.9 3 2 02#0.9 5 0 43.3 1 9 20.9 1 9 23#0.9 5 7 23.3 7 4 20.9 4 9 02.4 3种土壤中可培养细菌及酚酸含量的相关性分析 相关热图 分别显示了 可培养细菌 纲水平 图3(a)和属水平 图3(b)相对丰度与酚酸成分含量之间的关系。香草酸的含量与 变形菌纲和 变形菌纲的相对丰度呈显著正相关,与芽孢杆菌纲的相对丰度呈显著负相关;水杨酸的含量与 变形菌纲的相对丰度呈显著正相关,与芽孢杆菌纲的相对丰度呈显著负相关;香豆酸的含量与放线菌纲和鞘脂杆菌纲的相对丰度呈显著正相关;肉桂酸的含量和变形菌纲的相对丰度呈显著负相关。香草酸的含量与副伯克霍尔德氏菌属P a r a-b u r k h o l d e r i a、贪 噬 菌 属V a r i o v o r a x、戴 氏 菌 属D y e l l a的相对丰度呈显著正相关,与普里斯特氏菌属P r i e s t i a的相对丰度呈显著负相关;没食子酸和阿魏酸的含量与罗河杆菌属R h o d a n o b a c t e r的相对丰度呈显著正相关;丁香酸的含量与芽孢杆菌属和罗河杆菌属的相对丰度呈显著负相关;水杨酸、苯甲酸的含量与红球菌属R h o d o c o c c u s的相对丰度呈显著正相关;苯甲酸的含量与芽孢杆菌属的相对丰度呈显著负相关;香豆酸的含量与链霉菌属呈显著正相关,与芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属呈负相关;肉桂酸的含量与赖氨酸芽孢杆菌属L y s i n i b a c i l l u s的相对丰度呈显著正相关。374广西科学,2 0 2 3年,3 0卷,第3期 G u a n g x i S c i e n c e s,2 0 2 3,V o l.3 0 N o.3图3 可培养细菌相对丰度与酚酸成分含量的相关性热图F i g.3 H e a t m a p o f c o r r e l a t i o n b e t w e e n r e l a t i v e a b u n d a n c e o f c u l t u r a b l e b a c t e r i a a n d t h e c o n t e n t o f p h e n o l i c a c i d s3 讨论3.1 连作和土传病害对人参根际土壤中微生物区系及可培养细菌群落多样性的影响 土壤微生物区系的数量及分布特征是评价土壤质量的生物学指标。通过对3种土壤样品的研究发现,连作导致土壤样品中的微生物数量总量呈现降低的趋势,这与杨珍等1 2的报道一致。人参的连作使根际土壤中真菌数量呈现上升趋势,土壤微生物区系发生了细菌型向真菌型的转变。推测是由于土壤酸化,而酸性的土壤环境更适合真菌生长1 3,1 4,进而导致真菌数量上升。扈进冬等1 5认为真菌数量的上升进一步导致土传真菌病的发生,严重影响了人参的生长。上述 的 土 壤 微 生 物 数 量 的 变 化 特 征,与Wu等1 6、刘晔等1 7的报道一致。通过对不同土壤样品中可培养细菌群落的研究发现,连作和严重的土传病害未导致人参根际可培养细菌多样性下降,但土传病害导致根际土壤中芽孢杆菌纲和变形菌纲细菌含量显著下降,放线菌纲细菌含量明显上升,土壤中优势菌属也由芽孢杆菌属转变为链霉菌属,类芽孢杆菌属的相对分离频率明显下降。其中链霉菌属相对分离频率的上升与T a n等1 8的研究不符,值得关注。芽孢杆菌属细菌在大多数研究中被证实具有广谱的生物防治性能1 9,2 0,是人参常见土传病害生物防治的主要菌属。张宁等2 1发现贝莱斯芽孢杆菌B a c i l l u s v e l e z e n s i s具有广谱抑菌作用,对人参黑斑病具有显著的防治效果。K i m等2 2分离获得1株解淀粉芽孢杆菌B.a m y l o l i q u e f a c i e n s AK 0,对人参锈腐病、人参根腐病、人参灰霉病的病原菌具有良好的体外抑制效果。类芽孢杆菌属细菌同样对人参灰霉病、人参根腐病、人参菌核病等土传病害表现出良好的抑菌潜力2 3。因此推断2#样品连作却未出现土传病害是由于样品中含有较高丰度的芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属。链霉菌属作为人参病害生防放线菌的主要菌属,可以产生次级代谢产物抑制病原菌的生长,诱导人参产生防御酶增强对病原菌的抗性。链霉菌属细菌有种类丰富的代谢产物,其中最主要的是抗生素类物质2 4,如大环内酯类抗生素、氨基糖苷类抗生素、四环素等。而抗生素可以通过抑制细胞壁的合成、干扰蛋白质的合成、抑制核酸的复制和转录来抑制微生物的生长2 5。虽然链霉菌属中大多数菌常被用来做广谱抗菌剂,用来控制通过土壤和种子传播的植物疾病2 6,但高玉婷等2 7发现分离自土壤的黄灰链霉菌S t r e p t o m y c e s f l a v o g r i s e u s对枯草芽孢杆菌B.s u b t i-l i s具有抑制作用。陶宗2 8发现链霉菌属潜在新种潭州链霉菌S.t a n z h o u e n s i s s p.n o v.对芽孢杆菌属细菌具有广谱的抑菌性。故推断3#样品中链霉菌属相对分离频率的上升并未缓解人参的连作障碍,是由于高丰度的链霉菌属抑制了芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属等细菌的增殖。3.2 连作和土传病害对人参根际土壤中酚酸类成分含量的影响 本研究采用的8种酚酸标准品在3种样品中均有检测到,其中含有没食子酸、水杨酸、苯甲酸、肉桂474陈福慧,谢勇俊,贾清文,等.林下连作种植参根际土壤可培养微生物区系及细菌群落对酚酸类化感物质的响应酸,与李自博等2 9对连作人参根系土壤中的酚酸类物质的研究结果一致。但本研究中酚酸含量与预期不符,香草酸、丁香酸、水杨酸和苯甲酸没有积累,相反出现了显著下降的现象。李崇玮等5也在研究中发现在收获西洋参后恢复一年的老参地中的苯甲酸含量显著低于未种植过西洋参的对照组。没食子酸和阿魏酸在2#样品中显著积累,在3#样品中出现下降。肉桂酸在人参连作后出现显著积累,香豆酸在发生土传病害的土样中显著积累。吴立洁等3 0研究发现,香豆酸会影响与人参同属药材三七的苗高、发芽率及根长等。3.3 酚酸类化感物质对连作人参根际土壤中微生物区系及可培养细菌群落多样性的影响 相关性分析表明,香草酸和水杨酸含量的下降以及肉桂酸含量的积累共同导致了变形菌门相对丰度的下降。变形菌门具有物质转化和分解植物残体的功能,能促进土壤养分循环、维持土壤的生态平衡,是土壤中物质循环的重要组成3 1。香草酸、水杨酸、丁香酸和苯甲酸含量的下降以及肉桂酸含量的上升变化对芽孢杆菌纲生防菌的富集有促进作用。芽孢杆菌纲细菌中的芽孢杆菌属3 2和类芽孢杆菌属3 3具有广谱的生物防治性能,对人参常见土传病害具有生物防治的功能。香豆酸含量的积累抑制了类芽孢杆菌属菌株的富集,同时促进了链霉菌属菌株的富集。查阅文献发现,酚酸类成分对部分病原真菌具有低促高抑的现象,如李自博等3 4曾报道酚酸类化合物在高浓度下可以抑制西洋参疫霉病病原菌的生长。故推测本研究中香草酸、水杨酸、丁香酸、苯甲酸和肉桂酸含量的变化有利于人参的健康生长,而香豆酸是人参连作障碍的主导化感物质。4 结论 本研究通过对连作4年的健康和土传病害人参根际土壤的研究,发现连作导致根际土壤中微生物总量下降,微生物区系由细菌型转变为真菌型。土传病害导致芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属细菌丰度下降,链霉菌属丰度上升。以上3种土壤微生物的变化以及香豆酸含量的积累可能是导致人参土传病害进而发生连作障碍的主要原因。香草酸、水杨酸、丁香酸和苯甲酸含量的下降和肉桂酸含量的积累促进生防菌和有益菌群的富集。关于酚酸类物质是否导致人参的连作障碍仍有待研究。参考文献1 黎阳,张铁军,刘素香,等.人参化学成分和药理研究进展J.中草药,2 0 0 9,