马源肺炎克雷伯菌与马腺疫链球菌混合感染的诊断.pdf

组稿VEmail：n m g x m y 2 0 0 8 s in a.c o m|科学研究马源肺炎克雷伯菌与马腺疫链球菌混合感染的诊断王娜1,党娟，戴伶俐1,云涛3,金学峰4,贺勇鹏5,郭宇3,李军燕1,李文杰,刘威1*（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特0 1310 0；2.鄂尔多斯市动物疫病预防控制中心，内蒙古鄂尔多斯0 17 0 0 0；3.内蒙古自治区动物疫病预防控制中心，内蒙古呼和浩特0 10 0 10；4.达拉特旗动物疫病预防控制中心，内蒙古鄂尔多斯0 1430 0；5.伊旗农畜产品质量安全中心，内蒙古鄂尔多斯0 17 2 0 0；6.克什克腾旗动物疫病预防控制中心，内蒙古赤峰0 2 5350)摘要：为确定2 0 2 1年7 月15日河北石家庄某马场4岁青年公马下颌淋巴结出现化脓性炎症的原因，本研究无菌采集发病的公马下颌化脓液进行细菌培养鉴定、致病性试验及体外药物敏感试验。化脓液体经培养后的菌落形态一致，经表型鉴定、生理生化鉴定及16 SrDNA鉴定，确定该菌为马腺疫链球菌和肺炎克雷伯菌。马腺疫链球菌对利奈唑胺、红霉素、克林霉素、左氧氟沙星、米诺环素、青霉素和万古霉素7 种抗生素均敏感；肺炎克雷伯菌对头孢曲松、头孢呋辛、产超广谱-内酰胺酶菌、头孢吡和复方新诺明5种药物表现为耐药；对阿莫西林和左旋氧氟沙星2 种药物表现为中度敏感；对阿米卡星、头孢他啶、厄他培南、头孢西丁、亚胺培南和哌拉西林6 种药物表现为敏感。该养殖场的4岁青年公马患病是由肺炎克雷伯菌和马腺疫链球菌所致，临床治疗过程中可交替使用阿米卡星、头孢他啶、厄他培南、头孢西丁和万古霉素等药物。关键词：马；肺炎克雷伯菌；马腺疫链球菌；混合感染中图分类号：S852.61文献标识码：A文章顺序编号：10 0 5-5959(2 0 2 3)0 3-0 0 6-0 4马腺疫俗称喷喉，属于三类动物疫病，是由马链球菌马亚种引起的一种马属动物急性、接触性传染病，以发热、上呼吸道黏膜发炎和下颌淋巴结肿胀为主要病症 1-2 1。各年龄马匹都可发病,4月龄 4岁最易感。患病和病死动物是主要传染源。无症状和病愈后的带菌动物也可排出病原成为感染源。该病呈世界性分布，具有很强的传染性，严重危害世界马产业的发展，并造成巨大的经济损失3。肺炎克雷伯菌俗称肺炎杆菌，属于肠杆菌科，克雷伯氏菌属。最早由Carl Friedlander发现。该菌是一种常见的人畜共患条件致病菌，广泛存在于自然界（水、土壤、农产品)中，常存在于人和动物的肠道及呼吸道，偶见感染部分野生和水生动物。当机体抵抗能力下降时，该菌便经呼吸道入侵机体，导致气管、肺部和尿道感染,严重者可引发脑膜炎、败血症及菌血症，若不及时治疗，可使大批动物死亡(4-5。2021年7 月，河北石家庄某规模化养马场进行引种，同时发现马场有2 匹马流出脓性鼻涕，眼角周围存在大量眼哆,未经药物治疗自愈,后期1匹4岁青基金项目：内蒙古农牧业创新基金项目（2 0 2 0 CXJM08)作者简介：王娜（198 9一），女，硕士，助理研究员，研究方向为动物传染病防控。通讯作者：刘威（198 6 一），男，硕士，副研究员，研究方向为动物传染病防控。66当代畜禽养殖业202303年马患病，出现精神萎靡、食欲不振、体温升高，下颌出现化脓性炎症。采集该马匹下颌化脓液，并对其进行致病性试验及体外药物敏感试验，为其他健康马匹的饲养提供基础数据。1材料与方法1.1试验材料1.1.1病料。从河北省石家庄某规模化马场采集4岁发病公马的下颌化脓液1份，低温保存。1.1.2主要试剂。血平板(广东环凯有限责任公司)；胰酪大豆陈液体培养基（TSB培养基）、胰酪大豆陈琼脂培养基（TSA培养基）（美国BD有限责任公司）；马血清（北京索莱宝科技有限责任公司）；药敏片（杭州滨和微生物有限责任公司）。1.1.3主要仪器。生化培养箱SPX-16B、恒温水浴锅SH-WB-6GDN3、恒温摇床TS-2112B、漩涡振荡器VM-10、PCR 仪ABI9902、电泳仪HE99X、全自动凝胶成像仪TypeT2A。1.2试验方法1.2.1细菌分离培养。在无菌条件下将下颌化脓液分别接种于TSA+5%的马血清平板、血平板,37 培养1624h，观察菌落形态、颜色及菌体形态。将单一菌落转接于TSB+5%的马血清液体培养基中,37 培养1624h,取1mL菌液提取基因组,剩余菌液保种。1.2.2菌株鉴定。（1)表型鉴定。马腺疫链球菌在血平板上呈典型的溶血,菌落圆形、透明、凸起、似针尖科学研究|组稿VEmail：n mg x my 2 0 0 8 s i n a.c o m大小,在TSB+5%的马血清培养基中呈颗粒或絮状沉淀生长；肺炎克雷伯菌在血平板上呈完全溶血,菌落为灰白色，表面圆形、凸起、光滑、湿润，直径为2 3mm,TSB+5%的马血清培养基中呈絮状沉淀生长。（2)生理生化鉴定。马腺疫链球菌生理生化鉴定参考王宁等回的方法操作，肺炎克雷伯菌生理生化鉴定参考布坎南 7 的方法操作。（3)16 SrDNA鉴定。使用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组DNA，-2 0 保存。引物27F和149 2 R由上海生工合成图,PCR以2 7 F和149 2 R为引物。PCR反应条件:94,5min;94,30 s55,30 s,7 2,9 0 s,30 次循环;7 2,7 min。PC R产物寄送到上海生工生物有限责任公司测序。使用NCBI进行序列比对,利用MegAlign软件构建菌株系统发育树。1.2.3药敏试验。马腺疫链球菌使用7 种药敏纸片进行体外抑菌试验，每种药敏片设置3个重复，参考美国临床实验室标准化协会（CLSI)进行结果判定，肺炎克雷伯菌使用13种药物进行体外药敏试验，M100(2020)标准进行结果判定。1.2.4小鼠致病性试验。挑取纯化菌落接种于3mLTSB+5%马血清液体培养基,37 培养18 h，12 0 0 0 r离心2 min弃上清，用0.8 5%的生理盐水洗菌3次，并将菌浓度调至1x10CFU/mL,腹腔注射2 0 0 L/min,每组6 只小鼠，雌雄各半，观察1周。2结果与分析2.1菌株培养特性本试验从1份马源下颌化脓液中分离到1株马腺疫链球菌和1株肺炎克雷伯菌，分别命名于HB-SJZ-1 和 HB-SJZ-2。H B-SJZ-1 在血平板上出现典型的溶血环（图1A),圆形白色菌落，表面半透明、光滑、湿润、凸起，直径为1 2 mm,革兰染色后显微镜下观察为阳性卵球形,可见数十个菌体呈链状排列;HB-SJZ-2在血平板呈圆形灰白色菌落,直径为2 4 mm,表面不透明、光滑整齐、湿润，革兰染色后显微镜下观察为阴性长杆菌，单个或对生排列。BA.菌株HB-SJZ-1在血平板上菌落形态;B.菌株HB-SJZ-1在血平板上菌落形态图1分离菌株菌落形态图2.2菌株鉴定2.2.1菌株生理生化鉴定。严格按照细菌新型生化鉴定管使用说明书进行操作。由表1可知,HB-SJZ-1菌能分解蔗糖,不能分解蕈糖、山梨醇和七叶灵精氨酸试验结果为阳性，V-P试验、吡咯烷基芳酰胺酶试验(PYR试验）、MAG试验、TMZ试验为阴性，与马腺疫链球菌的理化特性相符，初步判定为马腺疫链球菌。HB-SJZ-2菌能分解葡萄糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、棉子糖和木糖,V-P试验、脲酶试验呈阳性，氧化酶试验、甲基红试验、硫化氢试验呈阴性，符合肺炎克雷伯菌的理化特性，初步判定为肺炎克雷伯菌。2.2.2菌株16 S rDNA鉴定。以菌株HB-SJZ-1和HB-SJZ-2基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得1500bp的扩增产物(图2),经上海生工生物有限责任公司测序,通过NCBI比对构建系统发育树(图3)及进行同源性分析（图4）可知，分离株HB-SJZ-1与NR116010.1Streptococcus equi,NR043703.1 Streptococcus equi 的相似度为99.2%，与JQ975920.1Streptococcus equisubsp.的相似度为99.1%;HB-SJZ-2与MF767573.1Klebsiella pneumoniae的相似度为9 9.3%，与MF767582.1Klebsiella pneumoniae 的相似度达到99.2%，因此鉴定HB-SJZ-1为马腺疫链球菌,HB-SJZ-2肺炎克雷伯菌。202303当代畜禽养殖业7组稿VEmail:|科学研究表1菌株生理生化鉴定结果HB-SJZ-1 菌株HB-SJZ-2菌株鉴定项目结果PYR丙二酸盐V-P脲酶精氨酸+DPPPMG七叶灵MAGTMZ糖燕糖山梨醇溶血注：“+表示阳性；“二”表示阴性。702.415002001005020105210Nucleotide substitutions(x100)M:DNAmarkerDL2000；1:H B-SJZ-1的16 SrDNA扩增产物;2:HB-SJZ-2的16 SrDNA扩增产物;N：阴性对照Percentldentity12175.799.175.275.475.4 99.299.2229.530.929.1430.21.129.2530.00.729.30.6630.00.829.30.60.670.829.60.930.130.030.180.829.60.930.130.0 30.10.0122.3体外药敏试验如表2 和表3所示，马腺疫链球菌对利奈唑胺、红霉素、克林霉素、左氧氟沙星、米诺环素、青霉素和万古霉素7 种抗生素均敏感。肺炎克雷伯菌对头孢曲松、头孢呋辛、产超广谱-内酰胺酶菌、头孢吡和复方新诺明5种药物表现为耐药；对阿莫西林和左旋氧氟沙星2 种药物表现为中度敏感；对阿米卡星、头孢他啶、厄他培南、头孢西丁、亚胺培南和哌拉西林6种药物表现为敏感。2.4小鼠致病性试验试验组小鼠7 2 h内全部死亡，对照组小鼠情况8当代畜禽养殖业202303M鉴定项目结果+硫化氢赖氨酸脱羧酶阿拉伯糖燕糖棉子糖木糖乳糖+葡萄糖卫矛醇+甲基红氧化酶V-P13476.098.999.399.275.675.675.975.875.8 99.199.199.499.4 75.375.399.475.475.475.3 75.3100.078345图4菌株序列同源性分析正常，无死亡。解剖试验组小鼠病变主要集中于肺部，且重新分离到马腺疫链球菌、肺炎克雷伯菌。3讨 论本研究首次从4岁患病青年公马的下颌化脓液中分离到马链球菌马亚种、肺炎克雷伯菌。国内外至今没有报道过这两种菌的混合感染病例。本研究为马呼吸道疾病的诊断提供了基础数据，为其他健康马的饲养、日常管理和疾病防控提供指导。马腺疫是由马链球菌马亚种引起的一种马属动物急性、接触性传染病,该病常发生于春、秋季,通常当年的9月到次年3一4月多发，呈地方性流行，其他1+200obp+1ooobp+750bp50obp+250bp+100bp+T图3菌株PCR产物扩增电泳图5662M:DNA marker DL 2000;1:HB-SJZ-1的16 S rDNA扩增产物;2:HB-SJZ-2的16 SrDNA扩增产物;N：阴性对照图2 菌株PCR产物扩增电泳图KP262416.1Klebsiella pneumoniae strainMF767582.1Klebsilla pneumonicestrainMF767573.1Klebsiella pneumoniaestrainHB-SJZ-2.seqNR_043703.1StreptococcusequiANR_116010.1StreptococcusequiAHB-sJZ-1.seqJQ975920.1Streptococcus equisubsp.eq17878N1HB-SJZ-1.seq2HB-SJZ-2.seq3JQ975920.1Streptococcus equi subsp.eq4KP262416.1Klebsiellapneumoniaestrain5MF767573.1Klebsillapneumoniaestrain6MF767582.1Klebsillapneumoniae strainNR_043703.1Streptococcus equistrainANR_116010.1Streptococcus equistrainA科学研究|组稿 Email：n mg x my 2 0 0 8 s i n a.c o m表2 马腺疫链球菌体外药敏试验结果抗生素名称方法利奈唑胺K-B法红霉素K-B法克林霉素K-B法左氧氟沙星K-B法米诺环素K-B法青霉素K-B法万古霉素K-B法注：S代表敏感;I代表中度敏感;R代表耐药。下表同。表3肺炎克雷伯菌体外药敏试验结果药物名称方法阿莫西林MIC法阿米卡星MIC法头孢他啶MIC法MIC法头孢曲松头孢呋辛ESBL厄他培南头孢吡头孢西丁亚胺培南左旋氧氟沙星复方新诺明哌拉西林季节也偶有发生，呈散发传播18-。虽然死亡率不高，但易感季节的发病率高于8 0%，给养殖业带来巨大危害,我国将该病列为三类动物疫病。黑龙江、新疆和山东等地均有马腺疫的发生 6 10-12。本研究从河北石家庄某规模化马场腺疫病例的下颌化脓液中筛选出1株 S.equi,该菌对利奈唑胺、红霉素、克林霉素、左氧氟沙星、米诺环素、青霉素和万古霉素7 种抗生素均敏感,表明马场对于马腺疫的治疗未滥用抗生素，避免了耐药菌株的产生,临床治疗过程中可交替使用以上7 种药物。肺炎克雷伯菌(Kpn)属于肠杆科克雷伯菌属,该菌为G-人畜共患条件致病菌 13,常存在于人和动物的肠道及呼吸道，可引发肺炎、脑膜炎、尿路和伤口感染、全身败血症等,发病及死亡率极高 14,该菌对养殖场的危害仍不可忽视。近年，多重耐药Kpn普遍存在，给临床疾病治疗带来巨大的挑战 5。目前,国内未曾报道，但该试验从马下颌化脓液中分离到该菌，为马呼吸道疾病的诊断提供新的思路。本研究中Kpn对头孢曲松、头孢呋辛、产超广谱-内酰胺酶菌、头孢吡单位:mm直径结果31S33S23S27S37S50S27S单位:mm检测数值结果162464MIC法64MIC法POSMIC法0.12MIC法32MIC法4MIC法0.25MIC法1MIC法0.05MIC法4和复方新诺明5种药物表现为耐药；对阿莫西林和左旋氧氟沙星2 种药物表现为中度敏感；对阿米卡星、头孢他啶、厄他培南、头孢西丁、亚胺培南和哌拉西林6种药物表现为敏感。因分离株Kpn已产生耐药性,故药物治疗时应选择敏感药物,减少或降低耐药性的产生。4结论该养殖场的4岁青年公马患病是由肺炎克雷伯菌和马腺疫链球菌所致，临床治疗过程中可交替使用阿米卡星、头孢他啶、厄他培南、头孢西丁和万古霉素等药物。参考文献：1 ROBINSON C,FRYKBERG L,FLOCK M,et al.Strangvac:a recombinant fusion protein vaccine that protects againststrangles,caused by Streptococcus equilj.Vaccine,2018,36(11):1484-1490.2 LIDEN,VAN WIERINGEN T,LANNERGARD J,et al.Asecretedcollagen-and fibronectin-binding streptococcalSprotein modulates cell-mediated collagen gel contraction andSinterstitial fluid pressurej.The Journal of BiologicalChemistry,2008,283(3):1234-1242.R3 HULTING G,FLOCK M,FRYKBERG L,et al.Two novelRIgG endopeptidasesofStreptococcus+Microbiology Letters,2009,298(1):44-50.S KIM S H,WEI C I,TZOU Y 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