纳米银薇乔线在小鼠皮内连续缝合线道周围近期抗炎疗效的观察研究.pdf

发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4249纳米银薇乔线在小鼠皮内连续缝合线道周围近期抗炎疗效的观察研究刘雪来1何峰2宋岩彪3叶茂1许坚吉1魏延栋1杜娟4（1.首都儿科研究所附属儿童医院外科，北京100020；2.首都儿科研究所生化和免疫学研究室，北京100020；3.河北医科大学第二医院中心实验室，河北石家庄050061；4.吉林省人民医院糖尿病足诊断和治疗中心，吉林长春 130021）论著【摘要】目的 探索纳米银薇乔线用于小鼠背部皮内连续缝合线道周围炎性细胞和炎性蛋白的表达情况，分析其近期抗炎疗效。方法对 4-0 普通薇乔线采用化学涂层技术制备纳米银薇乔线。18 只1012 周 Balb/C 小鼠随机分为 3 组（每组各 6 只），剃除小鼠背部毛发，纵行切开 15 mm 皮肤全层切口。分别采用 4-0 带针普通薇乔线、抗生素薇乔线、纳米银薇乔线行皮内连续缝合。术后 5 d，以纵形切口为中心，取材全层皮肤组织。采用免疫组织化学染色方法比较线道周围中性粒细胞、巨噬细胞、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-，TNF-）的表达水平，并计算平均光密度（mean optical density，MOD）。原位末端转移酶标记（mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）染色了解线道周围细胞凋亡情况。Masson 染色了解线道周围胶原蛋白沉积情况。统计学方法采用单因素方差分析和 student s t 检验。结果免疫组织化学染色显示，普通薇乔线、抗生素薇乔线和纳米银薇乔线的中性粒细胞 MOD 值为 0.5230.137、0.4120.122、0.2290.079；巨噬细胞MOD 值为 1.1250.126、0.5850.142、0.2090.078；IL-6 的 MOD 值为 1.1370.168、0.6520.131、0.2270.086；TNF-的 MOD 值为 1.2190.124、0.5730.109、0.1790.045，纳米银薇乔线线道周围炎性细胞浸润、IL-6 和 TNF-的表达最轻微，普通薇乔线表达最明显，3 组间比较差异均有统计学意义（P 值均 0.001）。TUNEL 染色显示，普通薇乔线、抗生素薇乔线和纳米银薇乔线凋亡细胞的 MOD 值为 0.1670.035、0.4780.151、0.1250.035，纳米银薇乔线线道周围凋亡细胞最少，抗生素薇乔线凋亡细胞最多，3 组间比较差异均有统计学意义（P 值均 0.001）。Masson 染色显示，纳米银薇乔线线道周围胶原蛋白沉积显著，抗生素薇乔线线道周围未见胶原蛋白沉积。结论 在小鼠皮内连续缝合模型上，纳米银薇乔线的近期抗炎疗效优于抗生素薇乔线和普通薇乔线，纳米银薇乔线线道周围细胞毒性弱，但其临床应用价值仍需进一步评估。【关键词】纳米银；薇乔线；皮内连续缝合；抗炎；平均光密度Short term of anti-inflammatory efficacy observation induced by Vicryl suture coated with silver nanoparticles in mice dorsal intradermal running suture modelsLiu Xuelai1,He Feng2,Song Yanbiao3,Ye Mao1,Xu Jianji1,Wei Yandong1,Du Juan4(1.Department of Surgery,Capital Institute of Pediatrics Affiliated Children Hospital,Beijing 100020,China;2.Department of Biochemistry and Immunology,Capital Institute of Pediatrics,Beijing 100020,China;3.Central Laboratory,the Second Hospital of Hebei Medical University,Hebei,Shijiazhuang 050061,China;4.Diabetic Foot DOI：10.3969/j.issn.2095-5340.2023.04.002基金项目：北京市中医药科技发展资金项目一般规划项目（JJ-2020-50）通信作者：刘雪来（Email：liuxuelai_）250发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4Diagnosis and Treatment Center,Jilin Province Peoples Hospital,Jilin,Changchun 130021,China)Corresponding author:Liu Xuelai(Email:liuxuelai_)【Abstract】Objective To investigate the expression of inflammatory cells infiltration and inflammatory proteins around silver nanoparticles coated Vicryl suture in mice dorsal intradermal running suture models,and to analyze the anti-inflammatory effect.MethodThe 4-0 Vicryl suture were coated with silver nanoparticles by chemical coating technique.Eighteen Balb/C mice at 10-12 weeks were randomly divided into 3 groups(with 6 mice in each group).The back hair of the mice was shaved and a 15 mm longitudinal full-layer incision was made.Continuous intradermal suture was performed using 4-0 common Vicryl suture,antibiotic Vicryl suture,and silver nanoparticles coated Vicryl suture,respectively.The whole skin tissue was collected with longitudinal incision as the center at 5 days after surgery.Immunohistochemical staining was used to compare the expression levels of neutrophils,macrophages,interleukin-6(IL-6),and tumor necrosis factor-(TNF-)around the channels.The mean optical density(MOD)was calculated.Mediated dUTP-biotin nick end labeling(TUNEL)staining was used to investigate the apoptosis of cells around the channels.Masson staining was used to investigate the collagen deposition around the channels.One-way analysis of variance and studentt t-test were used for statistical analysis.ResultThe immunohistochemistry staining indicated neutrophil MOD in common Vicryl suture group,antibiotic Vicryl suture group and silver nanoparticles coated Vicryl suture groups was 0.5230.137,0.4120.122,0.2290.079,respectively;macrophage MOD in above three groups was 1.1250.126,0.5850.142,0.2090.078,respectively;IL-6 MOD in above three groups was 1.1370.168,0.6520.131,0.2270.086,respectively;TNF-MOD in above three groups was 1.2190.124,0.5730.109,0.1790.045,respectively;the infiltration of inflammatory cells,expression of IL-6 and TNF-was most obvious in common Vicryl suture group and least obvious in silver nanoparticles coated Vicryl suture group;the differences among the three groups were statistically significant(all P0.001).TUNEL staining showed that MOD of apoptosis cells in common Vicryl suture group,antibiotic Vicryles suture group and silver nanoparticles coated Vicryl suture groups was 0.1670.035,0.4780.151,0.1250.035,respectively;most apoptosis cells could be seen in antibiotic Vicryl suture group,and least apoptosis cells were found in silver nanoparticles coated Vicryl suture groups;the differences among the three groups were statistically significant(all P0.001).Masson staining showed that most collagen deposit could be seen in silver nanoparticles coated Vicryl suture groups,but no collagen deposit could be found in antibiotic Vicryl suture group.Conclusion Compared with either common Vicryl suture or antibiotic Vicryl suture,the silver nanoparticles coated Vicryl suture presents better short term of anti-inflammatory efficacy and weak cytotoxicity in mice dorsal intradermal running suture models.Although this,the potential clinical application value needs to be further evaluated.【Key words】Silver nanoparticles;Vicryl suture;Intradermal running suture;Anti-inflammation;Mean optical density本课题组前续研究曾采用化学涂层技术将纳米银颗粒涂层于普通薇乔线表面制备出纳米银薇乔线，用于小鼠肠切除肠吻合，结果显示，纳米银薇乔线吻合肠壁的创口组织内中性粒细胞和巨噬细胞浸润减少，抗炎效果优于抗生素薇乔线1-2。尽管如此，肠切除肠吻合切口属于二类切口，缝合过程中缝线线道本身炎性反应、肠切除处创口的炎性渗出或污染、肠壁各种类型的功能细胞和募集的炎性细胞以及坏死组织和补体因子等复杂因素均参与了创口组织修复，即缝线本身处于相对污染的环境，而纳米银薇乔线良好的抑制炎症效果，是缝线表面释放的纳米银颗粒与复杂因素相互作用的最终结果。由于多种因素共同参与和影响下的肠壁吻合口在修复时均会介导炎性蛋白的表达，因此纳米银薇乔线在一类切口中的抗炎疗效，即纳米银薇乔线对线道本身炎性反应的抑制作用，仍不清楚。皮内连续缝合的创口对合良好，术后切口外观美观，是外科一类切口术后常采用的缝合方式。在一类切口的皮内连续缝合过程中，缝线走发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4251行于皮肤真皮组织内，该类创口不存在污染，无复杂的功能细胞和炎性细胞募集，不存在坏死组织等复杂因素，能有效观察纳米银薇乔线对线道本身炎性反应的抑制作用。鉴于此，本研究在小鼠背部皮肤伤口行皮内连续缝合，采用免疫组织化学技术观察和评估线道周围炎性蛋白的表达情况，以进一步探索纳米银缝合线对线道本身导致的炎性反应的抗炎作用和效果。1 材料与方法1.1实验材料带针薇乔可吸收性外科缝线（4-0，Vicryl suture，Polyglactin 910，全长45 cm）和相同规格的三氯生抗菌涂层薇乔可吸收性外科缝线（4-0，Vicryl plus，缝针13 mm 1/2弧度，全长45 cm）购自美国强生公司。一抗见表1（英国Abcam公司），二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）检测试剂盒（中国北京中杉金桥生物技术有限公司）用于免疫组织化学染色。原位末端转移酶标记（mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）染色试剂盒购自瑞士Roche公司。磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）和枸橼酸盐溶液（北京索莱宝科技有限公司），1%戊巴比妥钠、二烯丙基二甲基氯化铵、聚甲基丙烯酸钠、硝酸银溶液、氯化钠溶液、乙酸钠溶液购自美国Sigma公司。无菌去离子水稀释硝酸银至1 mmol/L。使用冰冻切片机（Thermo Cryotome FSE，英国）和显微镜及影像系统（ZEISS，Imager.D2，AxloCam HRc，德国）进行组织切片和形态学观察。1.2纳米银薇乔线的制备纳米银涂层缝合线制备方法采用经典化学逐层涂层法1-5。配制固定液：1 mmol/L聚甲基丙烯酸钠和硝酸银溶液等体积混合，紫外线照射4 h。配制黏附液：无菌去离子水稀释二烯丙基二甲基氯化铵浓度至1 mmol/L。将无菌带针普通薇乔可吸收外科缝线缠绕于塑料模具，依次放于配置好的固定液和黏附液中，分别静置1 min，随后置于无菌去离子水中11 min，甩干后重新放置于2种固定溶液内和无菌去离子水中，如此反复3次。制备的纳米银薇乔线经无菌去离子水冲洗5 min，常温下过夜，备用。1.3动物分组与实验操作本研究经首都儿科研究所附属儿童医院实验动物伦理委员会批准（批号：DWLL2023003）。Balb/C小鼠购自河北医科大学实验动物中心（1012周，18只，雌雄各半，体质量1822 g）。小鼠背部皮肤伤口和皮内连续缝合操作方法同文献6-7：采用1%戊巴比妥钠腹膜腔注射麻醉小鼠后，将小鼠俯卧位置于操作板上，剃除背部毛发，常规碘伏消毒背部。每只小鼠的背部中央做长约15 mm的纵形皮肤全层切口。将小鼠按使用缝线随机分为3组，分别采用4-0带针普通薇乔线、抗生素薇乔线、纳米银薇乔线行皮内连续缝合，最后一针从皮缘出针后闭合伤口，体外牵拉进针和出针处缝线，对合创缘皮肤，直视下进针和出针处打结和固定。术后为防止小鼠对伤口舔舐或撕咬，采用粘度胶带包扎和固定伤口。于术后5 d处死小鼠，取材部位为以皮肤纵形伤口为中心的全层皮肤组织（大小为15 mm5 mm）。1.4免疫组织化学检测皮肤组织取材后采用石蜡包埋，常温下保存。与皮肤切口垂直方向行连续切片（切片厚度为5 m），观察皮肤组织内缝线线道及其周围组织炎性蛋白的表达情况。烤片机蒸发组织切片表面石蜡膜，并室温放置20 min。PBS清洗切片3次（每次5 min），3%过氧化氢溶液室温孵育10 min，PBS清洗，山羊血清封闭切片1 h，弃血清后直接加一抗（稀释倍数见表1），室温孵育2 h。PBS清洗3次后加二抗（生物素标记的山羊抗兔IgG）室温孵育1 h，PBS清洗3次后滴加辣根酶标记链霉素工作液室温孵育30 min，PBS清洗3次后滴加DAB液显色。苏木素复染用后0.1%盐酸化，2%氨水返蓝1-2。最后切片经梯度乙醇表 1本研究所用抗体表达靶点抗体名称稀释倍数宿主中性粒细胞细胞核7/41200大鼠巨噬细胞细胞膜F4/801300兔肿瘤坏死因子-TNF-1200大鼠白细胞介素-6IL-61100兔注：TNF-：肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-）；IL-6：白细胞介素-6（interleukin-6）。252发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4脱水干燥、二甲苯透明，随后中性树胶封固，光学显微镜下观察。1.5Masson染色小鼠新鲜皮肤组织取材后进行冰冻切片，采用常规Masson染色技术。Masson染色后胶原蛋白呈绿色或蓝色，肌细胞或组织细胞核呈红色，细胞核呈黑色2。1.6TUNEL检测石蜡切片按照常规方法脱蜡，PBS清洗3次，每次5 min；每个切片滴入蛋白酶K工作液至覆盖组织，37 孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min。将切片置于山羊血清封闭液中，室温封闭15 min，PBS清洗3次，每次5 min8；按照商品说明书对切片进行标记反应和显影。1.7定量表达分析免疫组织化学结果判断采用双盲法。采用200倍普通光学显微镜观察，出现棕黄色颗粒为阳性蛋白表达。各组分别随机选取4个视野（非肌肉区域），使用图像分析软件Image pro plus 6.0分析累积光密度值（integrated optical density，IOD）和面积（area），计算出平均光密度（mean optical density，MOD）（MOD=IOD/Area）8-10。1.8统计学分析采用SPSS 18.0软件对数据进行统计学分析，采用Prism 6.0软件作图。计量资料以xs表示，3组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用students t 检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果所有小鼠手术操作顺利，无伤口感染，无术中死亡。取材时伤口敷料清洁干燥，肉眼下观察，各标本伤口未见明显异物反应，未扪及线结所致的组织学硬块。2.1纳米银薇乔线线道周围炎性蛋白表达轻微小鼠背部皮肤表皮层菲薄，可见各组缝合线位于真皮层内。由于位于皮内的纳米银缝合线能够持续释放纳米银颗粒进入真皮组织间隙，对线道周围参与炎性反应和组织修复的细胞实施抗炎，因此，本课题组聚焦线道周围真皮间隙组织，观察和比较其内炎性细胞和炎性蛋白的表达情况。免疫组织化学结果显示，皮内连续缝合术后5 d，纳米银薇乔线周围中性粒细胞和巨噬细胞的浸润最少，普通薇乔线浸润最多（图1）；进一步比较线道周围白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-，TNF-）图1术后5 d小鼠背部皮肤皮内缝合线道周围免疫组织化学染色显示中性粒细胞和巨噬细胞浸润情况 注：普通薇乔线浸润明显；抗生素薇乔线表达适中；纳米银涂层薇乔线表达轻微。图2术后5 d小鼠背部皮肤皮内缝合线道周围免疫组织化学染色显示IL-6和TNF-表达情况 注：普通薇乔线表达明显，抗生素薇乔线表达适中，纳米银薇乔线表达轻微。TNF-：肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-）；IL-6：白细胞介素-6（interleukin-6）。IL-6200 100中性粒细胞200 100巨噬细胞200 100TNF-200 100发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4253表达情况，结果显示，普通薇乔线线道周围IL-6和TNF-表达最明显，纳米银薇乔线表达最轻微（图2）。两种炎性细胞浸润、IL-6和TNF-表达，3组间比较差异有统计学意义，普通薇乔线组和抗生素薇乔线组均高于纳米银薇乔线组，普通薇乔线组高于抗生素薇乔线组（P值均0.05），见表2。2.2纳米银薇乔线线道周围凋亡细胞最少比较3组缝线线道周围细胞凋亡情况，结果显示，抗生素薇乔线组凋亡细胞最多，纳米银薇乔线细胞凋亡最少（图3），3组间比较差异均有统计学意义（P值均0.05），见表2。2.3纳米银薇乔线线道周围胶原蛋白沉积更多纳米银薇乔线良好的抗炎特性和满意的细胞毒性提示，该组线道周围应该具备较好的胶原重塑性。进一步采用Masson染色观察和比较3组缝合线线道周围胶原蛋白的沉积情况，结果显示，纳米银薇乔线线道周围胶原蛋白沉积最多，其次是普通薇乔线，抗生素薇乔线线道周围胶原蛋白沉积最少（图4）。3讨论纳米生物材料（nano biomaterials，NBM）因其具备生物医学功效，已被广泛用于临床，涵盖创伤后再生与修复、伤口治疗、干细胞治疗和肿瘤靶向治疗等11-12。很多研究发现纳米银能够有效抑制各类革兰氏阴性和阳性细菌，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和绿脓杆菌等13-15，其杀菌机制是高浓度的银离子可重新聚集成零价银离子，这个过程需要不断消耗氧气，因此能够破坏菌体蛋白和阻断细菌呼吸链16-17。此外，纳米银颗粒也被证实具备良好的抗炎疗效，有学者用纳米银溶液处理正常小鼠和糖尿病小鼠皮肤烫伤的伤口，发现伤口周围炎性细胞浸润和炎性细胞因子表达水平均显著降低，这种抗菌和抗炎作用抑制伤口的感染，促进伤口的愈合14。也有学者图3术后5 d小鼠背部皮肤皮内缝合线道周围TUNEL染色显示凋亡细胞数 注：普通薇乔线表达适中，抗生素薇乔线表达明显，纳米银薇乔线表达轻微。TUNEL：原位末端转移酶标记（mediated dUTP-biotin nick end labeling）。图4术后5 d小鼠背部皮肤线道周围Masson染色显示胶原蛋白的沉积情况 注：普通薇乔线沉积适中，抗生素薇乔线未见沉积，纳米银薇乔线沉积显著。表 23 组皮内缝合线道周围免疫组织化学和 TUNEL 检测的 MOD 值比较（xs）组别鼠数（只）免疫组织化学检测TUNEL 检测中性粒细胞巨噬细胞IL-6TNF-普通薇乔线60.5230.1371.1250.1261.1370.1681.2190.1240.2670.035抗生素薇乔线6 0.4120.122a 0.5850.142a 0.6520.131a 0.5730.109a 0.4780.151a纳米银薇乔线6 0.2290.079bc 0.2090.078bc 0.2270.086bc 0.1790.045bc 0.1250.035bcF 值426.429309.805326.526468.561268.751P 值 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001注：a与普通薇乔线组比较，P0.01；b与普通薇乔线组比较，P0.01；c与抗生素薇乔线组比较，P0.01。MOD：平均光密度（mean optical density）；TUNEL：原位末端转移酶标记（mediated dUTP-biotin nick end labeling）；IL-6：白细胞介素-6（interleukin-6）；TNF-：肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-）。200 100200 100254发育医学电子杂志 2023 年 7 月 第 11 卷 第 4 期 J Dev Med(Electronic Version),Jul.2023,Vol.11,No.4在小鼠腹膜炎模型腹腔内注射纳米银溶液，研究发现受损腹膜的炎性细胞浸润减少，炎性因子表达降低，创伤腹膜与腹腔内容物黏连明显减轻15。许多临床随机对照研究也发现，纳米银具有抗菌抗炎作用；研究发现，纳米银能够有效抑制创伤后感染，促进炎症性伤口的组织修复18-20。在转化应用方面，纳米银已应用于感染性伤口的治疗以及骨科材料中3,13，以增强骨替代材料的抗炎特性。本课题组已采用化学涂层技术将纳米银颗粒涂层于普通薇乔线表面制备出纳米银薇乔线，并将该线用于小鼠肠切除肠吻合，组织学研究证实，与普通薇乔线和抗生素薇乔线相比，纳米银薇乔线吻合肠壁之后创口组织内中性粒细胞和巨噬细胞浸润减少，吻合口处胶原纤维排列良好13。尽管如此，肠切除肠吻合的吻合口处并非绝对清洁，研究所观察的是纳米银薇乔线对一定程度的感染性切口的抗炎疗效。在肠切除肠吻合模型中，复杂因素参与了肠壁组织修复过程：除外肠内容物对肠壁创口修复存在影响，早期浸润的中性粒细胞、由单核细胞分化而来的巨噬细胞以外，参与抗原呈递的树突状细胞、组织修复过程中的成纤维细胞、促进创口收缩的肌纤维母细胞、增殖期的肠壁平滑肌细胞和黏膜上皮细胞等，以及各种细胞外基质，均不同程度地参与了肠壁修复过程中的炎性反应。本课题组既往所观察到的纳米银薇乔线良好的抗炎疗效，是肠壁创口处纳米银颗粒的持续释放并发挥抗炎作用与创口处复杂炎症因素共同作用的结果。在清洁伤口上采用纳米银薇乔线缝合，线道周围释放的纳米银颗粒是否能够介导抗炎作用以及抗炎效果如何，为本研究的重点。为清晰观察和了解线道周围组织内的炎性反应情况，本研究在小鼠背部实施皮内连续缝合，一方面保证伤口清洁，另一方面满足切片镜下能够清晰呈现线道及其周围组织断面情况。本研究结果显示，纳米银薇乔线线道周围中性粒细胞、巨噬细胞浸润最少，炎性蛋白表达最轻微，而普通薇乔线炎性蛋白最明显，这与此前肠切除肠吻合模型上纳米银薇乔线介导的中性粒细胞和巨噬细胞浸润特征一致。证实纳米银薇乔线在无菌伤口上同样可以实施良好的抗炎疗效。本研究TUNEL染色证实，抗生素薇乔线的线道周围细胞凋亡最为显著，此前课题组在肠切除肠吻合模型上也观察到抗生素薇乔线线道周围细胞凋亡最为显著，一方面提示，纳米银颗粒所发挥的抗炎机制与传统的抗生素不同；另一方面也提示，纳米银颗粒并非通过介导细胞凋亡抑制炎性细胞浸润和炎性蛋白的表达，细胞毒性相对轻。尽管如此，本研究取材的是皮内连续缝合术后5 d的组织标本，因此所探索和比较的是短期抗炎疗效，而远期抗炎疗效仍需进一步探索和比较。此外，通过高通量测序技术进一步探索纳米银介导抗炎疗效的确切机制，也成为本课题组后续工作的靶点。综上所述，纳米银薇乔线的抗炎疗效优于抗生素薇乔线和普通薇乔线，在绝对清洁和非绝对清洁伤口上均有抗炎疗效；尽管尚不清楚纳米银颗粒介导抗炎作用的确切分子学机制，但其抗炎疗效优于抗生素，且局部细胞毒性小的特点使其具有应用可能，但其潜在的临床应用价值仍需进一步评估。参考文献1 ZHANG S,LIU X,WANG H,et al.Silver nanoparticle-coated suture effectively reduces inflammation and improves mechanical strength at intestinal anastomosis in miceJ.J Pediatr Surg,2014,49(4):606-613.2 LIU X,GAO P,DU J,et al.Long-term anti-inflammatory efficacy in intestinal anastomosis in mice using silver nanoparticle-coated sutureJ.J Pediatr Surg,2017,52(12):2083-2087.3 SHAHVERDI A R,FAKHIMI A,SHAHVERDI H R,et al.Synthesis and effect of silver nanoparticles on the antibacterial activity of different antibiotics against Staphylococcus aureus and Escherichia coliJ.Nanomedicine,2007,3(2):168-171.4 BIRLA S S,TIWARI V V,GADE A K,et al.Fabrication of silver nanoparticles by Phoma glomerata and its combined effect against Escherichia coli,Pseudomonas aeruginosa and 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