木犀草素对肝星状细胞活化和CCl_%284%29诱导小鼠肝纤维化的抑制作用及机制研究.pdf

第5 1卷 第5期2 0 2 3年9月河南师范大学学报(自然科学版)J o u r n a l o fH e n a nN o r m a lU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c eE d i t i o n)V o l.5 1 N o.5 S e p.2 0 2 3 文章编号:1 0 0 0-2 3 6 7(2 0 2 3)0 5-0 1 3 1-0 7D O I:1 0.1 6 3 6 6/j.c n k i.1 0 0 0-2 3 6 7.2 0 2 3.0 5.0 1 6木犀草素对肝星状细胞活化和C C l4诱导小鼠肝纤维化的抑制作用及机制研究刁莹,王仲娟,李敏(苏州大学 生物医学研究院,江苏 苏州2 1 5 1 2 3)摘 要:目的 该研究为探讨木犀草素对肝星状细胞活化和C C l4诱导小鼠肝纤维化的抑制作用及其可能的作用机制.方法(1)体外利用C C K-8及划痕实验检测木犀草素对人肝星状细胞L X-2的增殖及迁移的影响;(2)q R T-P C R及W e s t e r nb l o t检测木犀草素对C o l l a g e n、-S MA、S m a d 2和p-S m a d 2表达的影响;(3)体内利用C C l4诱导小鼠肝纤维化模型,天狼猩红染色观察小鼠肝组织纤维胶原表达的变化;(4)应用l a b e l-f r e e蛋白定量技术分析蛋白质的差异表达情况.结果(1)体外实验结果显示木犀草素对L X-2细胞增殖及迁移有显著抑制作用,并下调C o l l a g e n、-S MA、p-S m a d 2的蛋白表达;(2)体内实验结果证明木犀草素可显著缓解C C l4诱导的肝纤维化的发病进程;(3)GO分析结果显示木犀草素所调控的差异蛋白主要涉及线粒体电子传递、氧化磷酸化等调节过程,K E G G通路分析显示差异蛋白主要参与M e t a b o l i c、E CM-r e c e p t o r i n t e r a c t i o n、P I 3 K-A k t等信号通路.结论 木犀草素通过下调L X-2细胞中T G F-1/S m a d 2信号通路抑制纤维化进程,并可能还存在其他多种机制,未来深入研究此类调控机制将为木犀草素的临床应用提供支持.关键词:木犀草素;肝星状细胞;T G F-1/S m a d 2;质谱中图分类号:R 2 8 5文献标志码:A肝纤维化是肝脏组织周围过度沉积大量胶原蛋白和纤维粘连蛋白等细胞外基质(E x t r a c e l l u l a rm a-t r i x c,E CM)所致,多种细胞及分子均参与纤维化的进程1.其中,肝星状细胞(H e p a t i cS t e l l a t eC e l l,H S C)的激活是肝纤维化发展中的一个重要过程2.肝损伤会诱导H S C活化,导致其基因表达的改变,引起细胞增殖和迁移,同时H S C可转化为表达大量a-平滑肌肌动蛋白(S m o o t hM u s c l e-a l p h a,-S MA)的肌成纤维细胞,产生大量的胶原蛋白和其他E CM分子,并分泌促炎细胞因子等加重后续免疫细胞浸润进而促进纤维化发生3-4.转化生长因子-1(T r a n s f o r m i n gG r o w t hF a c t o r-1,T G F-1)是转化生长因子家族的一员,这个家族的细胞因子对于细胞分化、增殖、凋亡和迁移有着广泛的影响,也是一种重要的促纤维化信号因子,参与包括肝脏在内的多种器官的纤维化形成的启动和维持.T G F-1特异性细胞表面受体具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,S m a d家族的转录因子是T G F-1受体激酶的直接底物,T G F-1受体复合物被激活后,可诱导多个S m a d s蛋白的磷酸化5,因此寻找新的靶向T G F-1/S m a d通路天然化合物是当前开发抗纤维化药物的有效途径之一.木犀草素(L u t e o l i n),全称3,4,5,7-四羟基黄酮,是一种常见的黄酮类化合物,存在于多种植物中如药草、水果和蔬菜6.富含木犀草素的植物在中国传统医学记载中认为可用于治疗多种疾病,如炎症性疾病、癌症和高血压7.现有研究显示木犀草素除抗炎及抗癌活性外,也具有一定的抗氧化及自由基清除能力8-1 0.同时有临床应用研究也表明含有木犀草素和浓缩木犀草素提取液未发生显著不良反应1 1.目前有大量研究 收稿日期:2 0 2 2-0 6-1 1;修回日期:2 0 2 2-0 7-2 8.基金项目:国家自然科学基金(8 2 1 7 1 8 1 3).作者简介:刁莹(1 9 8 7-),女,江苏泰兴人,苏州大学助理研究员,研究方向为分子与免疫,E-m a i l:y d i a os u d a.e d u.c n;王仲娟(1 9 8 6-),女,山东日照人,苏州大学助理研究员,研究方向为肿瘤与免疫,E-m a i l:w a n g z h o n g j u a ns u-d a.e d u.c n.通信作者:李敏,E-m a i l:m i n l_z j u 1 2 6.c o m.表明木犀草素对多种纤维化疾病,如肾脏、肺脏及肝纤维化均有保护作用,但其深入的分子调控机制值得探讨.本实验体外采用L X-2细胞为研究对象,体内使用C C l4诱导的小鼠肝纤维化模型,进一步明确木犀草素对肝纤维化的保护作用,并探讨其对于L X-2中T G F-1/S m a d信号通路的影响并寻找其抗肝纤维化的其他可能调控机制,为木犀草素的临床应用提供部分科学依据.1 材料与方法1.1 材料L X-2人肝星状细胞系,由本实验室保存.木犀草素购自上海源叶生物科技有限公司,蛋白定量试剂盒、S D S凝胶试剂盒、细胞裂解液、购自弗德生物科技有限公司.蛋白酶抑制剂购自罗氏试剂生物有限公司,T G F-购自P e p r o t e c h.体积分数4%多聚甲醛、DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶消化液和青链霉素购自美国H y C l o n e,C o l l a g e nI、-S MA、S m a d 2、p-S m a d 2、-A c t i n和GA D P H相关抗体均购自美国C e l lS i g n a-l i n gT e c h n o l o g y公司.1.2 方法1.2.1 C C K-8增殖与细胞划痕实验将L X-2细胞以每孔21 04个接种于9 6孔板中,或以每孔41 05个接种于6孔板中,同时将细胞分为4组,分别为对照组、T G F-1(1 0g/L)刺激组,T G F-1(1 0g/L)与木犀草素处理组(1 2.5、2 5m o l/L),待细胞密度达8 0%左右,加入这些药物处理4 8h后以每孔2 0LC C K-8试剂加入9 6孔板,检测O D 4 5 0值;或用2 0 0L无菌枪头在药物处理之前于6孔板中均匀画横线,4 8h后,对划痕进行显微镜拍照.1.2.2 逆转录、荧光定量P C R与W e s t e r nb l o t检测将L X-2细胞以每孔41 05个接种于6孔板中,同时将细胞分为4组,分别为对照组、T G F-1(1 0g/L)刺激组,T G F-1(1 0g/L)与木犀草素处理组(1 2.5、2 5m o l/L),待细胞密度达8 0%左右,加入这些药物处理2 4h.T r i z o l法提取总R NA,按照逆转录试剂盒对总R NA进行逆转录处理.逆转录程序为:1)3 7,1 5m i n;2)8 5,5s.按荧光定量P C R试剂盒进行操作.荧光定量P C R反应条件为:1)9 5,2m i n;2)9 5,5 s;3)6 0,3 4 s;4 0个循环.引物序列如下,C o l l a g e n:F o r w a r d5 -AT T T T T C T G D C GA C A C C C GAT-3,R e v e r s e5 -T C C C AG G T G T AGA C C AA-3;-S MA:F o r w a r d5 -AT T T T T G C C C GAT A C C C GAT-3,R e-v e r s e5 -T GA C C G T C AT AGA C C AA-3;-A c t i n:F o r w a r d5 -AT T T T T G T A C A C A C AAT G C-3,R e v e r s e5 -T GA C C G G T G T C C C T GA C GAT-3 .将L X-2细胞以每孔41 05个接种于6孔板中,分组同前,药物处理2 4h后加入R I P A裂解液(含有体积分数1%蛋白酶抑制剂)冰上裂解3 0m i n,高速离心机4,1 20 0 0r/m i n离心1 5m i n后吸取上层蛋白.蛋白定量完成后加上样缓冲液,沸水煮1 0m i n.电泳结束后进行转膜,随后用脱脂牛奶进行封闭,P B S T清洗,均为110 0 0体积稀释一抗(c o l l g e n I、-S MA、S m a d 2、P-S m a d 2、-A c t i n、GA P DH),4 过夜.第2天用冷P B S清洗条带3次,二抗孵育1h,化学发光仪发光拍照.1.2.3 C C l4小鼠肝纤维化模型与天狼猩红染色C 5 7小鼠分组,分为P B S组和木犀草素治疗组,每组6只.C C l4和橄榄油(23)按比例混匀,每周2次腹腔注射,每只小鼠注射1 0 0L,注射剂量3m L/k g,连续注射6周.C C l4注射4周后,木犀草素组灌胃给药1 0 0m g/k g,每周3次给药,连续给药2周.2周后处死所有小鼠,取小鼠肝脏并固定在体积分数4%多聚甲醛中.中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水.天狼猩红染色5 0m i n.蒸馏水洗3次.梯度乙醇脱水.二甲苯透明,中性树胶封固.染色的结果胶原呈红色.1.2.4 质谱样本处理与检测将L X-2细胞以每孔41 05个接种于6孔板中,分为T G F-1(1 0g/L)刺激组,T G F-1(1 0g/L)与木犀草素(2 5m o l/L)处理组,给药处理2 4h,将处理好的L X-2细胞进行收集,用预冷的P B S洗涤2遍.细胞中加入含8m o l/L尿素、1%蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液进行超声裂解,离心取上清.向蛋白质溶液中加入终231河南师范大学学报(自然科学版)2 0 2 3年浓度为5mm o l/L的D T T,6 0条件下孵育3 0m i n进行还原.加入1 5mm o l/L的I AA烷基化.然后向上述体系中加入2 5mm o l/L的NH4HC O3溶液置换出尿素.将胰蛋白酶和蛋白按15 0的质量比加入胰酶,3 7酶切过夜.将1 0%T F A加入消化后的样本中终止消化,B C A测蛋白浓度.将该样品溶液过C 1 8除盐小柱后收集滤液,在离心浓缩仪中常温旋干.除盐纯化后的多肽样品通过O r b i t r a pF u s i o nL u m o s三合一质谱仪进行检测.设置质谱检测分析条件:阳离子采集模式;一级质谱扫描分辨率为6 00 0 0;高能碰撞解离(HC D)设置为1 5;二级质谱碰撞能量为3 0%.自动采集各多肽信息,获得其二级谱图.1.2.5 数据分析将U n i P r o t人源蛋白质数据库导入P r o t e o m eD i s c o v e r e r2.2(T h e r m oF i s h e r)软件中,将M S/M S图谱数据输入数据库进行检索,检索方法参考文献1 3,基于L a b e lF r e e定量(L F Q)在软件中表示为肽量化蛋白质丰度,将木犀草素组与对照组均值之比0.5且P0.0 5定义为蛋白表达量下调.所有数据均经G r a p h-P a dP r i s m9软件统计分析,组间比较用t检验.2 结 果2.1 木犀草素显著抑制L X-2细胞的增殖为了验证木犀草素是否能影响肝星形细胞的增殖,选择人肝星形细胞系L X-2作为研究对象,其具有肝星状细胞的典型特点.C C K 8实验结果显示(图1):与未处理的对照组相比,1 0g/LT G F-1处理可促进L X-2细胞增殖(P0.0 5);而木犀草素可显著抑制L X-2的增殖(P0.0 5),且这种抑制作用具有剂量依赖性.2.2 木犀草素可明显抑制L X-2细胞迁移图2所示,木犀草素处理可显著抑制L X-2的迁移,这提示木犀草素可通过影响L X-2迁移修复能力从而抑制纤维化进程.2.3 木犀草素可明显抑制-S MA、C o l l a-g e nI的mR NA水平表达L X-2细胞活化后会明显增加-S MA及胶原的生成量,从而促进纤维化.为研究木犀草素对L X-2的活化有无影响,在T G F-1刺激的条件下给予木犀草素处理L X-2细胞,提取细胞R NA,逆转录及荧光定量P C R检测相关基因的表达.结果如图3所示,木犀草素处理可在mR NA水平下调L X-2细胞C o l l a g e nI和a-S MA表达.331第5期 刁莹,等:木犀草素对肝星状细胞活化和C C l4诱导小鼠肝纤维化的抑制作用及机制研究2.4 木犀草素可抑制L X-2细胞N-c a d h e r i n、C o l l a g e nI、-S MA蛋白表达及S m a d 2磷酸化接下来为了进一步明确木犀草素对L X-2细胞转分化以及释放E CM等的影响,在蛋白水平上验证了其对相关指标的影响.如图4(a,b)所示,与mR NA结果变化一致,木犀草素可明显抑制C o l l a g e nI和a-S MA的蛋白表达,且具有剂量依赖性.考虑到S m a d s的磷酸化是T G F-下游激活的重要标志,我们检测了木犀草素对S m a d s磷酸化的影响.结果如图4(c,d)所示,木犀草素显著抑制了S m a d 2S e r-4 6 5/4 6 7位点的磷酸化水平,这表明木犀草素很有可能是通过抑制T G F-1/S m a d s信号通路来抑制L X-2的活化.此外,验证了木犀草素对上皮转分化的重要标志物N-c a d h e r i n的表达影响,结果如图5所示,木犀草素可明显抑制N-c a d h e r i n的表达,这提示木犀草素也可通过抑制上皮转分化来抑制细胞侵袭等来影响纤维化.2.5 木犀草素可明显延缓C C l4诱导的小鼠肝纤维肝组织的进程使用C C l4诱导小鼠肝纤维化模型,进一步在体内明确木犀草素对肝纤维化的保护作用.如图6所示,天狼猩红染色显示正常组小鼠的肝小叶结构正常,仅在汇管区和中央静脉有少量胶原纤维;C C l4建模组小鼠的肝组织中胶原纤维沉积,形成一个连续的网状结构,浸润肝实质,失去正常的小叶结构,可见明显染色成红色的纤维间隔;在C C l4建模4周后,给予木犀草素处理2周,明显减少了小鼠肝组织的胶原纤维沉积,维持肝小叶结构完整,提示木犀草素显著延缓了C C l4诱导的小鼠肝纤维化进程.431河南师范大学学报(自然科学版)2 0 2 3年2.6 木犀草素对下调差异表达蛋白的GO注释分析及K E G G通路分析用O r b i t r a pF u s i o nL u m o s三合一超高分辨质谱仪分析了木犀草素处理组与P B S处理组L X-2细胞所表达的蛋白差异,结果显示两组细胞中共鉴定出35 1 1个蛋白,其中有8 1个蛋白表达下调.GO分析结果显示,下调差异蛋白主要参与线粒体电子传递、氧化磷酸化、受体介导的内吞作用的调节、血管生成和形态发生、AT P代谢过程、细胞骨架组织的调节等生物学过程;差异蛋白主要定位在基膜、线粒体膜间隙、高尔基体、胞质囊腔和细胞外基质等细胞器上;在分子功能方面,差异蛋白主要涉及氧化还原驱动活性跨膜转运蛋白活性、电子转移激活、细胞外基质结构成分、激活结构分子等活性(附图).通过K E G G数据库对下调差异表达蛋白进行通路富集分析,发现木犀草素处理组的差异蛋白主要涉及其中6 6条 信 号 通 路,包 含M e t a b o l i c、E CM-r e c e p t o ri n t e r a c t i o n、P I 3 K-A k t、O x i d a t i v ep h o s p h o r y l a t i o n、AG E-R AG E、mTO R等信号通路(附图).3 讨 论肝纤维化是由病毒、酒精、自身免疫等多种原因引起肝细胞发生炎症坏死,从而导致肝星状细胞激活转化、细胞外基质的合成增加与降解减少而大量沉积在细胞间质中形成的.有研究证明肝纤维化及肝硬化早期是可逆转的,但后期进展为肝硬化终末期则不可逆转,甚至可能发展为肝癌1 4.肝纤维化是慢性肝病的重要环节,严重威胁人类的健康,因而不断寻找有效阻断甚至逆转肝纤维化的治疗方法迫在眉睫.肝纤维化发病机制的相关研究显示肝星状细胞的激活与转化在肝脏纤维化中起着关键作用.而转化生长因子T G F-1,在肝脏纤维化形成的过程中起着非常重要的作用,其中T G F-1/S m a d信号通路则被认为是刺激H S C活化、增殖的关键信号通路1 5.因此,抑制T G F-1信号通路是一种很有前景的抗纤维化方法.木犀草素具有较强的抗氧化能力,自由基清除能力,抗炎作用和抗癌活性,但其抗纤维化作用及机制还531第5期 刁莹,等:木犀草素对肝星状细胞活化和C C l4诱导小鼠肝纤维化的抑制作用及机制研究未明确阐明1 2,1 6,但本研究认为木犀草素作为一个天然化合物,很可能还存在影响其他通路的分子机制.本研究表明木犀草素可以有效抑制T G F-1诱导的L X-2细胞的活化及C C l4诱导的小鼠肝纤维化.实验结果显示木犀草素可以抑制T G F-1诱导后L X-2细胞的增殖,并抑制T G F-1诱导后EMC成分C o l l a g e n I及-S MA的mR NA和蛋白水平的表达,通过w e s t e r nb l o t显示木犀草素抑制S m a d 2的s e r 4 6 5/4 6 7磷酸化位点的表达.天狼猩红染色结果显示木犀草素可以显著改善C C l4诱导的肝组织学变化.说明木犀草素可以抑制T G F-1诱导的L X-2的T G F-1/S m a d信号通路,从而抑制其纤维化水平.为进一步探讨木犀草素参与肝纤维化的机制,本研究采用O r b i t r a pF u s i o nL u m o s三合一超高分辨质谱仪对两组细胞蛋白进行了分析,共鉴定出35 1 1个蛋白,其中有8 1个蛋白表达下调.差异表达的蛋白对抑制细胞纤维化无疑起到重要的作用.GO注释和K E G G信号富集分析在生物信息学应用中有重要的作用1 7.GO注释表明下调差异蛋白主要参与线粒体电子传递、氧化磷酸化、受体介导的内吞作用的调节、血管生成和形态发生、AT P代谢过程、细胞骨架组织的调节等生物学过程.K E G G通路分析下调差异蛋白主要参与了代谢途径、多种神经疾病、E CM与细胞的相互作用、氧化磷酸化、内吞作用、P I 3 K-A k t、mTO R等信号通路.综上所述,本研究进一步明确了木犀草素对小鼠肝纤维化的保护作用,验证了其可能通过木犀草素T G F-1/s m a d 2信号通路从而影响肝星形细胞活化释放E CM以及抑制迁移、转分化等几个方面来肝纤维化.此外,通过质谱组学分析提示木犀草素很可能还通过影响代谢等多种通路调节肝纤维化,而阐明其中可能的机制对木犀草素的临床应用具有重要的指导意义.作者贡献:刁莹和王仲娟为共同第一作者.附 录附图、见电子版(D O I:1 0.1 6 3 6 6/j.c n k i.1 0 0 0-2 3 6 7.2 0 2 3.0 5.0 1 6).参 考 文 献1 HE R NAN D E Z-G E AV,F R I E DMANSL.P a t h o g e n e s i so f l i v e r f i b r o s i sJ.A n n u a lR e v i e wo fP a t h o l o g y,2 0 1 1,6:4 2 5-4 5 6.2李天阳,涂正坤,苏立山.自然杀伤细胞对肝星状细胞的调控及其在肝纤维化中的作用J.临床肝胆病杂志,2 0 1 7,3 3(3):5 5 8-5 6 2.L ITY,TUZK,S ULS.R e g u l a t o r ye f f e c t o f n a t u r a l k i l l e r c e l l s o nh e p a t i c s t e l l a t e c e l l s a n d t h e i r r o l e i n l i v e r f i b r o s i sJ.J o u r n a l o fC l i n i-c a lH e p a t o l o g y,2 0 1 7,3 3(3):5 5 8-5 6 2.3L E EUE,F R I E DMANSL.M e c h a n i s m so fh e p a t i cf i b 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9,9(1):3 1-5 9.7HA R B O R N EJB,W I L L I AM SCA.A d v a n c e s i nf l a v o n o i dr e s e a r c hs i n c e1 9 9 2J.P h y t o c h e m i s t r y,2 0 0 0,5 5(6):4 8 1-5 0 4.8S E E L I N G E RG,ME R F O R TI,S C HEMP PCM.A n t i-o x i d a n t,a n t i-i n f l a mm a t o r ya n da n t i-a l l e r g i c a c t i v i t i e so f l u t e o l i nJ.P l a n t aM e d i c a,2 0 0 8,7 4(1 4):1 6 6 7-1 6 7 7.9L IZY,Z HOUY M,Z HAN GN,e t a l.E v a l u a t i o no f t h ea n t i-i n f l a mm a t o r ya c t i v i t yo f l u t e o l i ni ne x p e r i m e n t a l a n i m a lm o d e l sJ.P l a n t aM e d i c a,2 0 0 7,7 3(3):2 2 1-2 2 6.1 0U E D A H,YAMA Z AK IC,YAMA Z AK IM.L u t e o l i na s a na n t i-i n f l a mm a t o r ya n da n t i-a l l e r g i c c o n s t i t u e n t o f P e r i l l a f r u t e s c e n sJ.B i o l o g i-c a l&P h a r m a c e u t i c a lB u l l e t i n,2 0 0 2,2 5(9):1 1 9 7-1 2 0 2.1 1T A L I OU A,Z I N T Z A R A SE,L Y KOUR A SL,e t a l.A no p e n-l a b e l p i l o t s t u d yo f a f o r m u l a t i o nc o n t a i n i n g t h e a n t i-i n f l a mm a t o r y f l a v o n o i dl u t e o l i na n d i t se f f e c t so nb e h a v i o r i nc h i l d r e nw i t ha u t i s ms p e c t r u md i s o r d e r sJ.C l i n i c a lT h e r a p e u t i c s,2 0 1 3,3 5(5):5 9 2-6 0 2.1 2L I J,L IXX,XU W H,e t a l.A n t i f i b r o t i ce f f e c t so f l u t e o l i no nh e p a t i cs t e l l a t ec e l l sa n d l i v e r f i b r o s i sb yt a r g e t i n gAK T/mT O R/p 7 0 S 6 Ka n dT G F/S m a ds i g n a l l i n gp a t h w a y sJ.L i v e r I n t e r n a t i o n a l,2 0 1 5,3 5(4):1 2 2 2-1 2 3 3.1 3 吴昱杰,王智博,李瑛,等.慢性心力衰竭气虚血瘀证及复方人参补气颗粒干预机制的蛋白质组学研究J.中国中药杂志,2 0 2 1,4 6(1 9):5 0 5 2-5 0 6 3.631河南师范大学学报(自然科学版)2 0 2 3年WUYJ,WANGZB,L IY,e ta l.C h r o n i ch e a r t f a i l u r ed u et oQ id e f i c i e n c ya n db l o o ds t a s i sa n di n t e r v e n t i o nm e c h a n i s mo fC o m p o u n dR e n s h e nB u q iG r a n u l e s:ap r o t e o m i c s-b a s e ds t u d yJ.C h i n aJ o u r n a l o fC h i n e s eM a t e r i aM e d i c a,2 0 2 1,4 6(1 9):5 0 5 2-5 0 6 3.1 4S OHR A B P OURAA,MOHAMA D N E J A D M,MA L E K Z A D EHR.R e v i e wa r t i c l e:t h er e v e r s i b i l i t yo fc i r r h o s i sJ.A l i m e n t a r yP h a r m a-c o l o g y&T h e r a p e u t i c s,2 0 1 2,3 6(9):8 2 4-8 3 2.1 5I NA GAK IY,OKA Z AK I I.E m e r g i n gi n s i g h t s i n t oT r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rb e t aS m a ds i g n a l i nh e p a t i cf i b r o g e n e s i sJ.G u t,2 0 0 7,5 6(2):2 8 4-2 9 2.1 6 李星霞,李婕,王绍展,等.木犀草素对肝纤维化进程中肝细胞上皮间质转化的抑制作用J.中国药房,2 0 1 4,2 5(1 9):1 7 2 9-1 7 3 2.L IXX,L I J,WAN GSZ,e t a l.I n h i b i t o r ye f f e c t o f l u t e o l i no ne p i t h e l i a l-m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o no fh e p a t o c y t e s i nh e p a t i c f i b r o s i sp r o c e s sJ.C h i n aP h a r m a c y,2 0 1 4,2 5(1 9):1 7 2 9-1 7 3 2.1 7C HE NL,Z HAN GYH,L UGH,e t a l.A n a l y s i s o f c a n c e r-r e l a t e d l n c R NA s u s i n gg e n e o n t o l o g ya n dK E G Gp a t h w a y sJ.A r t i f i c i a l I n t e l l i-g e n c e i nM e d i c i n e,2 0 1 7,7 6:2 7-3 6.S t u d yo nt h em e c h a n i s mo f l u t e o l i ne f f e c t o nt h e i n h i b i t i o no fh e p a t i cs t e l l a t ec e l l a c t i v a t i o na n dC C l4-i n d u c e d l i v e r f i b r o s i s i nm i c eD i a oY i n g,W a n gZ h o n g j u a n,L iM i n(I n s t i t u t e so fB i o l o g ya n dM e d i c a lS c i e n c e s,S o o c h o wU n i v e r s i t y,S u z h o u2 1 5 1 2 3,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v eI no r d e r t o i n v e s t i g a t e t h ee f f e c ta n dm e c h a n i s mo f l u t e o l i no nl i v e rf i b r o s i s i nv i t r oa n di nv i v o.M e t h o d s(1)C C K-8a n ds c r a t c he x p e r i m e n tw a su s e dt od e t e c t t h ea c t v i t yo fL X-2c e l l su n d e rn o r m a l c o n d i t i o n sa n dT G F-1a c t i v a t i o n;(2)q R T-P C Ra n dw e s t e r nb l o td e t e c t e dt h ee f f e c t so f l u t e o l i no nC o l l a g e n,-S MA,S m a d 2a n dp-S m a d 2e x p r e s-s i o n;(3)C C l4-i n d u c e d l i v e r f i b r o s i s i nm i c e.M a s s o ns t a i n i n gw a su s e dt oo b s e r v e t h ec h a n g e so f f i b r o u sc o l l a g e ne x p r e s s i o ni nm i c eb e f o r ea n da f t e r a d m i n i s t r a t i o n.(4)L a b e l-f r e ep r o t e i nq u a n t i f i c a t i o nw a su s e d t oa n a l y z ed i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o no f p r o t e i n s.R e s u l t s(1)T h ev i t r oe x p e r i m e n t ss h o w e dt h a t l u t e o l i n i n h i b i t e dL X-2p r o l i f e r a t i o n,a n ds i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e dt h ee x p r e s s i o no fC o l l a g e n,-S MA,S m a d 2,p-S m a d 2.(2)A n i m a l e x p e r i m e n t s s h o w e dt h a t l u t e o l i nc o u l de f f e c t i v e l y i m p r o v eC C l4-i n d u c e dl i v e r i n j u r ya n d l i v e r f u n c t i o nd a m a g e.(3)GOa n a l y s i s i n d i c a t e dd o w n-r e g u l a t e dd i f f e r e n t i a lp r o t e i n sm a i n l yi n v o l v e di nm i t o-c h o n d r i a l e l e c t r o nt r a n s f e r,o x i d a t i v ep h o s p h o r y l a t i o nr e g u l a t i o n,K E G Gp a t h w a ya