生物传感器平台在肿瘤细胞中miRNA检测的研究进展_廖诗晴.pdf

0引言MicroRNA（miRNA）是一类内源性表达的非编码 RNA，长度约为 19-25 个核苷酸，广泛存在于动物、植物和病毒中。miRNA 在基因的表达与调控上发挥着重要作用，可通过诱导mRNA 降解或阻碍蛋白质翻译来调控基因的表达，在细胞和生命活动中发挥重要作用，被认为是潜在的癌症诊断的生物标志物1-3。许多研究表明，miRNA 的表达与人类疾病密切相关，包括传染病4-5、糖尿病6-7、神经退行性疾病8-9和癌症10-11等。例如 Deli 等12考察了 miRNA与普遍受损的空腹血糖和 2 型糖尿病（T2D）之间的关联，发现在 774 种 miRNA 中有 6 种第 42 卷第 3 期2 0 2 2 年 9 月Vol.42，No.3Sept.2022化学传感器CHEMICAL SENSORS生物传感器平台在肿瘤细胞中 miRNA 检测的研究进展廖诗晴1，张慢乐2，郭美彤1，李炳1，何婧琳1*，曹忠1*（1.长沙理工大学化学化工学院，电力与交通材料保护湖南省重点实验室，细胞化学湖南省重点实验室，湖南长沙410114）（2.重庆市计量质量检测研究院，重庆401123）摘 要：多种 MicroRNA（miRNA）作为癌症标志物在肿瘤发展过程中其表达水平明显变化。因此针对miRNA 开发高通量、快速检测平台可以用于癌症的诊断和治疗。该综述首先介绍电化学生物传感平台、光学生物传感平台等的优势与特点，进一步概述了双信号输出的生物传感平台的研究进展，重点阐述了双输出的优势及其在疾病的诊断和预后中的应用。关键词：传感平台；肿瘤标志物；miRNA 检测；双信号输出Research progress in biosensingplatforms for the miRNA detectionin tumor cellsLiao Shi-qing1,Zhang Man-le2,Guo Mei-tong1,Li Bing1,He Jing-lin1*,Cao Zhong1*(1.Hunan Provincial Key Laboratory of Materials Protection for Electric Power and Transportation&Hunan Provincial Key Laboratory of Cytochemistry,School of Chemistry and Chemical Engineering,Changsha University of Science and Technology,Changsha 410114,China）（2.Chongqing Academy of Metrology and Quality Inspection,Chongqing 401123,China)Abstract:Multi-microRNAs(miRNAs)are cancer markers whose levels of expression change significantly during tumor development.The development of high-throughput and rapid assay platforms for miRNAs is of critical for disease diagnosis and therapeutic interventions.This review discusses the benefits and differences between electrochemical biosensors and optical biosensors.It further describes the research progress of dual signal-output biosensing platforms,emphasizing the superiority of signal dual-output biosensors and their applications in cancer diagnosis and prognosis.Key words:biosensing platform;tumor markers;miRNA assay;dual-signal output基金项目：湖南省自然科学基金(2018JJ2419、2020JJ40559)、湖南省教育厅科学研究项目(21A0182,21C0195)、国家自然科学基金(21545010)资助*通信联系人,何婧琳,E-mail:jinglin_;曹忠,E-mail:.42 卷10化 学 传 感 器miRNA（miR-22-3p、miR-33a-5p、miR-181c-5p、miR-92b-3p、miR-222-3p 和 miR-944）与流行的 T2D 相关。越来越多的研究表明，癌症的发生可能同时受到多个 miRNA 异常调控，而一种 miRNA 也可能是多种疾病的生物标志物。因此仅通过一种特异性 miRNA 来诊断特定疾病还不足以满足目前临床诊断的需求14-18。因此，构建同时检测多种 miRNAs 的平台对疾病的诊断和预防具有重要意义。1 单输出生物传感器检测平台单输出生物传感器是一种将化学信号转化为电信号的设备19。生物传感器通常由两个基本部件构成：生物敏感部件和信号转换器。生物敏感部件主要负责将分析物浓度转化为具有高灵敏度的化学或物理信号。信号转换器的作用是将从生物敏感部件得到的信号通过光学、电化学等方式转换成易于测量的信号。依据信号转换原理不同分为：光学生物传感器、电化学生物传感器等20。1.1 电化学生物传感平台电化学传感器是基于待测物质的电化学特性并将电极表面的化学反应信号转换为电信号的一种传感器，从而实现实时传感检测。具有高灵敏性、低成本和易于小型化的电化学生物传感平台在电分析领域展现出强大的应用潜力，如疾病相关生物标志物的多路同时检测和非侵入性体液监测等21。常见的用于多种 miRNA 检测的电化学传感平台主要有电流型电化学传感平台、电化学发光（ECL）传感平台等。1.1.1 电流型电化学传感平台电流型电化学传感器是利用电极将待测物质发生氧化还原反应所形成的化学信号变换成电流信号以实现对待测物质的测定。输出的电流信号与待测物的浓度呈现线性关系，且具有灵敏、快速、简单、高效等优点。Wang 等22通过金纳米颗粒包覆的磁性微珠和双嵌段寡核苷酸修饰的金纳米粒子（AuNPs）偶联物用于测定胶质瘤患者血清中 miRNA-182和 miRNA-381 的含量（图 1）。通过检测位于双嵌段寡核苷酸上的亚甲基蓝（MB）和二茂铁（Fc）的氧化峰值电流，可同时对 miRNA-182和 miRNA-381 进行定量检测，miRNA-182 和miRNA-381 的检出限分别为 0.20 fmol/L 和 0.12 fmol/L。然而，由于传统一维捕获探针在电极上的具有较高的表面扰动并且修饰在电极表面上的密度具有不可控性，抑制了多目标检测的效率和灵敏度。Xu 等23设计了具有多个目标识别域的新型 DNA 环捕获探针，并将其锚定在 DNA四面体的顶部。在辅助链的协助下，靶标识别域可超灵敏地检测 miRNA-21 和 miRNA-155，检出限分别为 18.9 amol/L 和 39.6 amol/L。与传统的多目标检测中的捕获探针相比，该捕获探针局部反应浓度增加，杂交效率提高。此外，TDN 作为支架固定 DNA 环捕获探针，进一步提高了捕获探针在电极上分布的均匀性，大大提高了检测灵敏度。图 1 通过 AuNP-MMBs 和双嵌段 ODN 修饰的 AuNPs 偶联物电化学同时检测 miRNA-182 和 miRNA-381 的示意图Fig.1 Schematic showing the simultaneous electrochemical detection of miRNA-182 and miRNA-381 via the conjugates of AuNP-MMBs and diblock ODN-modified AuNPs廖诗晴等：生物传感器平台在肿瘤细胞中 miRNA 检测的研究进展113 期1.1.2 电化学发光（ECL）传感平台除传统的电化学生物传感器外，ECL 传感器作为一种新型的电化学分析方法取得了实质性的进展。电化学发光又称电致化学发光，指发生电化学反应时，在电极表面发生电子转移反应促使形成物质的激发态，激发态再向基态跃迁发光24。ECL 成为一种非常强大的分析技术，广泛应用于免疫分析、食品和水的检测以及生物试剂检测等领域。与传统的电化学传感不同的是，ECL 传感平台不需要使用外部光源，因此具有高纯度发光和低背景噪音等优点。Wang 等25以 CdTe QDs-H2 和 Aug-C3N4 NSs-DNA1 作为双电化学发光信号探针，羧基化 Fe3O4磁性纳米颗粒作为载体，开发了一种新型 BPE-ECL 生物传感器用于多种 miRNA 检测（图 2）。CdTe QDs-H2/S2O82-和 Aug-C3N4 NSs-DNA1/S2O82-在驱动电压分别为 9 V 和12 V 的情况下，出现两种强而稳定的 ECL发射峰，可作为有效的电位分辨信号标签。所制备的 ECL 生物传感器对 miRNA-155 和miRNA-126 具有良好的线性响应，检出限分别为 5.7 fmol/L 和 4.2 fmol/L。该方法具有良好的灵敏度，且双极电极系统与电位分辨多目标电化学发光方法的结合可以大大减少物质之间的空间干扰，为临床应用特别是痕量多靶点的检测提供一种有效的方法。另一种ECL 生物传感器仅使用单一的 ECL 发光体作为报告分子，可有效避免多重检测中普遍存在的信号重叠以及多重检测中可用的标签数量有限等问题。Wang 等26开发了基于碳点（CDs）标记的 DNA walker 用于双 miRNA 检测的“开-关”信号可切换 ECL 生物传感器。该传感器使用单一的 ECL 发光体作为报告分子，并采用 DNA walker 来放大信号。如图3 所示，在存在 miRNA-21 的情况下，CDs-DNA walker 通过核酸杂交被固定在电极上，产生与 miRNA-21 对应的强 ECL 信号（信号开启）。当存在 miRNA-155 时，生物传感器与 CDs-DNA walker 和辅助 DNA（DNA-21）预孵育。靶标 miRNA-155 可以触发具有金属离子依赖性的 DNAzyme 裂解。加入 Mn2+后，底物链被切割，CDs 与电极分离，导致ECL 信号降低（信号关闭）。由于没有添加更多的 CDs-DNA walker，miRNA-21 的干扰被消除。通过 DNA walker 信号放大和 ECL检测技术相结合提高了传感平台的灵敏度，miRNA-21 和 miRNA-155 的检测限分别达到了 33 fmol/L 和 33 amol/L。图 2 用于 miRNA-155 和 miRNA-126a 检测的电位纸基 BPE-ECL 生物传感器的制备Fig.2 Preparation of the paper-based potential-resolved BPE-ECL biosensor for the detection of miRNA-155 and miRNA-12642 卷12化 学 传 感 器图 3（A）CDs-DNA walker 的制备，（B）基于 DNA walker 的开关 ECL 生物传感器的原理，用于 miRNA-21 和 miRNA-155 的定量，（C）miRNA-155 启动 DNA walker 的操作Fig.3(A)Schematic illustrations of the preparation of CDs-DNA walker,(B)the principle of DNA walker-based on-off ECL biosensor for quantitation of miRNA-21 and miRNA-155,(C)the operation of DNA walker initiated by miRNA-155电化学传感平台可以通过在电极上修饰不同的识别元件构建特异性高、可控性好的生物传感器。其中 ECL 传感平台结合电化学和化学发光的优点，无需外界的光源激发，消除了背景光和散射光的干扰。此外电化学传感平台结合新型纳米材料、天然有机和生物有机聚合物等，可用于提高电化学传感平台灵敏度和对靶标的识别能力。电化学传感平台已经发展成为一个热门的研究领域。1.2 光学生物传感平台光学生物传感器由特定的生物识别元件，如蛋白质、抗体、核酸、细胞受体、酶、病原体等，以及能将分析物相互作用产生的信号转换为可观察且可量化的光信号的换能器元件组成27。随着纳米技术的发展，研究人员开发了许多具有高灵敏度和复用能力的光学生物传感检测方法，其中包括荧光、表面增强拉曼散射（SERS）等。1.2.1 荧光生物传感平台荧光生物传感平台是根据识别探针与待测底物反应产生荧光共振能量转移（FRET）实现对待测物质的间接分析检测。荧光传感器具有灵敏度高、操作简单、适用于原位成像等优点，在生物分子检测领域引起了广泛的关注。纳米材料由于其具有独特的物理和化学性质，可控的尺寸、大的比表面、优良的催化性能和理想的信号转导机制，使其成为制备新型光学纳米探针的理想材料，例如量子点、上转换纳米粒子和结合荧光纳米探针或荧光团的微球 28。纳米团簇具有良好的生物相容性和抗光漂白特性，并且其发射光谱可以根据寡核苷酸的长度以及纳米团簇的大小发生红移或蓝移。这些特性使得纳米团簇成为构建荧光生物传感平台常用的纳米材料。Xu 等29开发了一种基于聚多巴胺纳米球/金纳米簇（PANSs/Au NCs）的 FRET 纳米平台，该平台使用 PANSs 作为能量受体，两种双色的 Au NCs 作为能量供体。通过单波长激发可以实现对 miRNA-21 和 let-7a 的同时检测。Li 等30开发了一种新型的熵驱动放大系统-银纳米簇（Ag NCs）传感平台，用于 miRNAs 的多重分析。如图 4 所示，在目标 miRNA 存在的情况下，在燃料链 F141 的辅助下引发三链杂交复合物（SY-Ag NCs）的分支迁移和链置换，导致 SY-Ag NCs 的释放和靶标的再生。SY-Ag NCs 稳定的 Ag NCs 荧光强度会急剧下降。这项研究分别提出了黄色发光的 Ag NCs 和红色发光的 Ag NCs 生物传感器同时分析miRNA-141 和 miRNA-155，检测极限分别为 6.1 pmol/L 和 8.7 pmol/L。廖诗晴等：生物传感器平台在肿瘤细胞中 miRNA 检测的研究进展133 期图 4（A）目标触发循环放大传感平台示意图；（B）详细的熵驱动催化路径示意图Fig.4(A)ustration of target-triggered recycling amplification sensing platform;(B)detailed entropy-driven catalytic pathway条码颗粒具有灵敏度高、重复性好、检测成本低等优点，也是构建荧光生物传感平台常用的纳米材料，其用途包括材料化学、疾病诊断和医疗器械工程等31。Bian 等32开发了一种二进制光学编码的二硫化钼封装的光子晶体条形码（MPCBs），用于不同 miRNA 检测的荧光生物传感平台。如图 5 所示，当存在 miR-155、miR-18 和 miR-133a 时，可以打开对应发夹结构并恢复被 MoS2层淬灭的荧光，实现对不同肿瘤标志物的定性和定量检测。Zhang 等33开发了一种聚多巴胺（PDA）封装的 PhC 条形码。通过靶向触发循环扩增和 HCR 实现 miRNA的多重定量检测。PDA 装饰的 PhC 条形码不仅对不同编码的 miRNA（miRNA-21、miRNA-210和miRNA-155）表现出独特的结构颜色（蓝、绿、红），还可以固定发夹探针（H1）进行后续反应。因此，通过调整 PDA 集成的 PhC 的结构颜色，可以实现复用的miRNA定量，检测限低至8.0 fmol/L。图 5 用于核酸定量的二进光学编码策略 MPCBs 示意图Fig.5 Schematic illustration of MPCBs with binary optical encoded strategy for nucleic acid quantification42 卷14化 学 传 感 器1.2.2 表面增强拉曼散射（SERS）生物传感平台随着拉曼光谱的快速发展和疾病诊断的迫切需要，SERS 已被广泛地应用于疾病特异性miRNA 检测。SERS 生物传感平台具有高灵敏度、快速检测的能力，并且 SERS 独特的指纹峰可以实现同时检测多种 miRNA。因此 SERS已被广泛用于分析疾病相关的 miRNAs 多重检测35。Si 等34开发了一种新型的基于 CHA 的SERS 传感器（图 6），同时测量样品中与癌症相关的多种 miRNAs。通过将四个不同发夹结构的 DNA 探针（hp1）中分别固定对应四个金/银合金纳米粒子（AuAgNP）涂层的检测孔上，构建了四个具有不同感应单元的传感器阵列。当目标 miRNA 出现时，相关的 hp1 和目标 miRNA之间的杂交并使得修饰有4-巯基苯腈（MPBN）的拉曼报告分子的 SERS 标签被识别。目标miRNAs 从 hp1 中置换出来并诱导了下一个循环，最终产生了强烈的 SERS 信号，检测限为0.15 pmol/L。Song 等17使用 AgNRs 基底制备了基于发夹形分子信标（MB）的 SERS 传感器，用于检测多种与肺癌相关的miRNA生物标志物。通过在靶标 miRNA 生物标记物存在的情况下监测 MB 的 SERS 信号淬灭，可同时检测三种与肺癌 相 关 的 miRNA（miRNA-21，miRNA-486，miRNA-375），检出限分别为 393 amol/L，176 amol/L 和 144 amol/L。图 6 基于 CHA 的 SERS 传感器阵列的制备与应用示意图Fig.6 Schematic illustration of the preparation and application of a CHA-based SERS sensor array光学生物传感器中荧光生物传感平台具有响应速度快、操作简便等特点。SERS 生物传感平台具有无损快速、灵敏度高、重现性好、测量范围广及易于操作等优势，在临床诊断、药物分析、食品安全和环境监测等方面均有应用前景。1.3 温度和压力生物传感平台近来传感器趋向于往小型化、家用化、便携式的方向发展，因此开发了一些基于压力、温度等信号输出方式来构建多重检测 miRNA 的生物传感平台。例如 Chen 等36开发了一种基于“棉线型”的便携式多通道光热生物检测方法，可用于同时检测 3 种与乳腺癌有关的 miRNAs。基于 HCR 制备了 3 条 Cu2-xS 纳米线，并将其预先固定在检测区域上作为光热传感和信号放大的标记。如图 7 在目标 miRNA 存在的情况下，捕获探针、靶 miRNA 和 Cu2-xS 纳米线形成三明治结构，Cu2-xS 不断累计并在 808 nm 激光照射下将 miRNA 的浓度转化为温度信号。通过便携式红外热成像相机即可对温度变化进行量化。该生物传感器具有成本低，便携性好，灵敏度高等优点。Shi 等37通过将多通道纸芯片与便携式气体压力计相结合，开发了一种基于多通道纸芯片的气体压力生物传感器，实现了对多种生物标记物的同步检测。设计了四个 DNA 四面体探针（DTPs）用作捕获探针，并固定在纸芯片的不同检测区，当存在 miRNA 时，会形成miRNA、捕获探针和铂金纳米颗粒修饰的互补DNA（PtNPs-cDNA）的三明治结构，并将对生物分子识别转化为气体压力的定量检测。廖诗晴等：生物传感器平台在肿瘤细胞中 miRNA 检测的研究进展153 期图 7 基于棉线的多通道光热生物传感器的设计与工作原理示意图Fig.7 Schematic illustration of the design and working mechanism of the cotton thread-based multi-channel photothermal biosensor2 信号双输出生物传感器检测平台虽然上述方法对 miRNA 的检测具有较高的敏感性，但单一的信号输出模式容易受到背景环境的干扰。为了解决单信号输出存在的干扰问题，提出了精度更高、抗干扰能力更强的双信号输出方法38。双模式方法显示了其巨大的应用潜力，在恶性肿瘤和其他重大疾病的早期筛查和诊断中，假阴性/阳性检测概率大大降低。2.1 比色-电流生物传感平台Sun 等39设计了基于靶标与适配体结合诱导 DNA 结构转换的双模光电化学（PEC）传感平台，用于同时检测粘蛋白 1（MUC1）和miRNA-21。如图 8 所示，将信号探针 1（sP1）和信号探针 2（sP2）组成的集成信号探针（ISP）引入用AuNPs修饰的多功能的纸基工作单元时，形成了两个目标的识别位点。当存在 MUC1 蛋白的情况时，由于 DNA 的特异性识别，工作单元上的 sP1 和目标都被释放到相应的比色单元中。游离的 sP1 所携带的辣根过氧化物酶-链霉亲和素（HRP-SA）在过氧化氢（H2O2）的存在下可以将 TMB 氧化为蓝色 oxTMB，产生更高的光电流信号。此外，miRNA-21 通过与修饰在另一个工作单元上 sP2 结合，产生电流信号的变化，在数字万用表下实现了对分析物的实时检测。PEC 感应器提供了一个宽的动态范围，MUC1 为 10 fg/mL 100 ng/mL，miRNA-21 的检测范围为 0.1 pmol/L 10 nmol/L，检测限分别为 3.4 fg/mL 和 36 fmol/L。它为多种分析物的同步检测奠定了基础，并为现代下一代疾病诊断的提升开辟了新途径。图 8 用于双分析物检测的纸基 aptassensor 的示意图Fig.8 Schematic representation of the paper based aptasensor for dual-analyte detection42 卷16化 学 传 感 器2.2 荧光-SERS 生物传感平台Ye 等40设计一种荧光-SERS 双信号可切换(DSS)纳米探针。纳米探针的荧光信号可为监测细胞内摄取和动态行为提供可视化成像，并且通过 SERS 比率信号可以实时定量检测多种 miRNA。如 图 9 所 示，在 没 有 miR-21 和miR-203 的情况下，探针处于荧光信号开启和SERS 信号关闭的状态。因此仅可以通过荧光信号观察探针在细胞内的摄取和分布情况。在目标 miRNA 分子存在的情况下，探针切换到荧光信号关闭状态和 SERS 信号激活状态。当存在 miR-21 时，H-C 链通过与 miR-21 杂交形成dsDNA 并脱离 DSS-1 纳米探针。因此 DSS-1 纳米探针的单链 H1 通过分子内杂交形成发夹结构，Cy3 与 AuNPs 的距离减小，Cy3 的荧光信号降低、SERS 信号增加。当同时存在 miR-21和 miR-203 时，miR-203 可与 DSS-1 纳米探针的 H2 杂交。因为 H2/DSS-2 双链比 miR-203/H2 双链更稳定，miR-203 被置换并不断触发后续的循环。此时 DSS-2 的荧光降低，SERS 信号增加。该探针可同时在 MCF-7 细胞中检测到 miR-21 和 miR-203，并与体外实验结果一致。这种新方法为同时成像和检测活细胞中的其他生物分子提供了一种可能性。图 9 检测 miR-21 和 miR-203 的 DSS 探针不对称信号放大的机制Fig.9 Mechanism for sensing the asymmetric signal amplification of the DSS probes for miR-21 and miR-203相较于单输出生物传感平台容易受到外界环境因素的干扰，信号双输出可以提高检测平台的准确性和灵敏度。不同的信号具有完全独立的传输方式，可以有效地纠正实验人员操作误差和外部条件因素造成的误差。因此，信号双输出生物传感平台为 miRNA 检测提供了一种更精确且高效的检测方法。3 结论肿瘤标志物的多重检测可以有效提高诊断准确性，因此构建一个高灵敏度的多 miRNAs 检测平台在临床诊断中具有重要意义。该文介绍了单信号输出的电化学生物传感平台、光学生物传感平台和双信号输出的生物传感平台的研究进展，成功实现对肿瘤细胞中多种 miRNA 的同时检测，已被广泛应用于生物医学、药物分析、环境监测和食品安全等领域。但是传感平台的构建仍然存在许多挑战。其一是商品化癌症生物传感器仍处于起步阶段，还无法有效的转化应用于临床方面。另一个主要挑战是生物传感平台要朝着智能化、微型化、集成化与多功能一体化的方向发展。将其转化为廉价高效、便携实用的产品，并逐步实现商品化和产业化。廖诗晴等：生物传感器平台在肿瘤细胞中 miRNA 检测的研究进展173 期参考文献 1 Chen X,Ba Y,Ma L J,et al.Characterization of mi-croRNAs in serum:a novel class of biomarkers for di-agnosis of cancer and other diseases J.Cell Research,2008,18(10):997-1006.2 Kilic T,Erdem A,Ozsoz M,et al.MicroRNA biosen-sors:opportunities and challenges among conventional and commercially available techniques 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