红树林内生拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora次级代谢产物及其抗肿瘤活性.pdf

广东海洋大学学报Journal of Guangdong Ocean University第 43 卷第 4 期2023 年 7 月Vol.43 No.4Jul.2023周婧，徐静.红树林内生拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora次级代谢产物及其抗肿瘤活性J.广东海洋大学学报,2023,43(4):34-40.收稿日期：2023-04-04基金项目：2022年度海南大学协同创新中心项目（XTCX2022STB01）；海南省自然科学基金资助（822RC650/221RC453）；国家自然科学基金（81973229/82160675）；海南省重点研发项目（ZDYF2021108）；海南省重大科技项目（ZDKJ202018）第一作者：周婧，女，博士，研究方向为天然药物生物合成化学。E-mail:Z通信作者：徐静，女，教授，博士生导师，研究方向为天然药物化学。E-mail:红树林内生拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora次级代谢产物及其抗肿瘤活性周婧1,2,3，徐静1（海南大学：1.生态文明协同创新中心，化学工程与技术学院/2.生命科学学院/3.海德书院，海南 海口 570228）摘要：【目的】以红树林内生拟盘多毛孢（Pestalotiopsis microspora）为对象挖掘结构特殊的甾体类化合物，分析其化学结构和抗肿瘤活性，为生物活性先导化合物提供模式结构。【方法】对课题组前期发现的活性显著的拟盘多毛孢（KX631718）添加海盐培养发酵，获得粗提物。采用柱层析结合高效液相，分离得到代谢产物；利用核磁共振波谱（NMR）、质谱（MS）等波谱解析方法以及与文献数据对照，鉴定化合物结构；对化合物进行抗肿瘤活性评价。【结果与结论】分离得到8个已知甾体类化合物，经鉴定化合物 分别为3-乙酰基-谷甾醇（3-O-acetyl-sitosterol）、7-hydroxysitosterol、3-hydroxy-5-stigmastan-6-one、citreoanthrasteroid B、stigmast-4-en-6-ol-3-one、5，8-epidioxy-5，8-ergosta-6，22E-dien-3-ol、-谷甾醇（-sitosterol）、7-ketositosterol，其中 为首次分离自拟盘多毛孢属真菌。生物合成途径推测拟盘多毛孢以常见的甾醇为前体，通过氧化、还原和重排反应，可代谢产生抗肿瘤先导物Sdy-1和结构特殊的甾醇化合物。生物活性评价发现，化合物、和具有微弱的抗肿瘤活性。生物合成途径推测拟盘多毛孢菌可利用传统甾体类为前体代谢产生抗肿瘤先导化合物Sdy-1。关键词：拟盘多毛孢；次级代谢产物；生物合成途径；抗肿瘤中图分类号：O629.29文献标志码：A文章编号：1673-9159（2023）04-0034-07doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2023.04.005Secondary Metabolites and Their in vitro Biological Activity ofMangrove Endophytic Pestalotiopsis microsporaZHOU Jing1,2,3,XUJing1(1.Collaborative Innovation Center of Ecological Civilization,School of Chemical Engineering andTechnology/2.School of Life Sciences/3.School of Hai De,Hainan University,Haikou 570228,China)Abstract:【Objective】Pestalotiopsis microspora from the mangrove was used to create steroidalcompounds with special structures,to analyze their anti-tumor activity for providing model structuresfor biologically active pre-compounds.【Method】Based on the previous study of our group,the seasalt was added to cultural condition to obtain the crude extract of Pestalotiopsis microspora(KX631718)withsignificantfermentationactivity.Columnchromatographyandhighperformance liquid phase were used to separate metabolites.【Result and Conclusion】8 knownsteroidal compounds(3-O-acetyl-sitosterol,7-hydroxysitosterol,3-hydroxy-5-stigmastan-6-第4期周婧等：红树林内生拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora次级代谢产物及其抗肿瘤活性one,citreoanthrasteroid B,stigmast-4-en-6-ol-3-one,5,8-epidioxy-5,8-ergosta-6,22E-dien-3-ol,-sitosterol,7-ketositosterol)were found;compounds to were isolated for the first time from P.microspora(KX631718);we used traditional sterols as precursors to produce sterol compound withspecial structures and antitumor leading compound Sdy-1 through oxidation,reduction and rearrangement.Biological activity evaluation of the isolated steroids showed that compounds,and weaklydisplayed antitumor activity.The biosynthetic pathway speculates that P.microspora can be metabolizedusing traditional steroids as precursors to produce the antitumor leading compound Sdy-1.Key words:Pestalotiopsis microspore;secondary metabolites;biosynthetic pathways;antitumor拟盘多毛孢Pestalotiopsis是一个物种丰富的真菌属，能分泌结构新颖多样的次级代谢产物1，截止2021 年已从该菌中发现 400 余种天然产物2，其40%的次级代谢产物具有特殊的药用活性基团，成为抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗肿瘤等方面的潜在药物3。Che课题组从无花果拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsisfici）发酵提取物中发现80多个具有独特结构特征的次级代谢产物，如具有氯取代三环支架和氯取代双环烯酮新骨架倍半萜 Chloropupukeananin，Chloropupukeanolides 和 Chloropestolides，生物活性评价发现这类化合物具有抗 HIV 和抗肿瘤能力410。红树林生态系统不仅指红树林植物，还包括丰富的生物群落所形成的多种微生物群落11。特殊环境诱导红树林内生真菌产生相应的氧化应激反应，迫使微生物细胞膜主要成分麦角甾醇高度氧化降解，形成结构特殊的海洋甾醇12。1990年Ciminiello等13首次从海绵Dictyonella incisa中获得这类结构罕见的降甾醇。随后，Togashi等14发现降甾醇类化合物能够体外抑制癌细胞生长，Mansoor等15从海洋来源生物中发现一系列降甾醇的衍生物均具有显著的抗肿瘤活性。Chianese等16发现降甾醇能够激活孕烷X受体的反式结构，从而上调肿瘤程序性细胞死亡因子（PDCDs），功效堪比抗肿瘤药物利福昔明。本课题组发现红树林拟盘多毛孢海洋降甾醇 Sdy-1 具有显著的抗肿瘤活性，对肺癌细胞A549、宫颈癌细胞 Hela 和肝癌细胞 HepG2 表现出很好的细胞毒活性17；Sdy-1是通过调控Wnt通路蛋白（-catenin）和其下游靶基因（CyclinD1、CDK4和c-myc）的表达程度来抑制肿瘤细胞18,19。可见，拟盘多毛孢不仅能产生结构新颖的次级代谢产物，而且具有产生药物先导化合物的能力，尤其是多手型的海洋甾醇类更具生物活性潜力。课题组前期研究发现红树林植物红海榄Rhizophora stylosa内生真菌中一株拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora对人肿瘤细胞显示强细胞毒活性18，但尚不明确其化学结构和抗肿瘤活性。笔者以该菌为研究对象，采用硅胶柱和葡聚糖凝胶柱结合高效液相手段，对分离获得的8个已知甾体类化合物进行化学结构鉴定和抗肿瘤活性评价，推测海洋降甾醇类化合物的生物合成途径，以期打破Sdy-1类海洋降甾醇化合物抗肿瘤活性显著但产量低的瓶颈问题，为生物活性先导化合物提供模式结构及其生物合成的理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1内生真菌的来源 拟盘多毛孢 Pestalotiopsismicrospore(KX631718)分离自红树林植物红海榄Rhizophora stylosa，菌种存放于海南大学化学工程与技术学院徐静教授课题组的红树林微生物资源库。1.1.2 培养基 内生真菌活化培养基：马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15 20 g，盐度 20 的人工海水1 000 mL，自然pH 7.0。内生真菌发酵培养基：大米100 g，人工海水（盐度20）1 000 mL。1.2 方法1.2.1 次级代谢产物分离及纯化参考Feng等20方法发酵菌株HHL82 P.microspora（KX631718），获得次级代谢产物。发酵产物以石油醚-二氯甲烷、二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇为洗脱系统进行硅胶层析梯度洗脱，得到7个组分。第4组分通过石油醚与乙酸乙酯梯度洗脱 体积比（10 1）（0 1）获得2个亚组分，其中4.2组分通过硅胶柱、反相和葡聚糖凝胶柱（型号Sephadex LH-20，孔径18 110 m，上海默克化工有限公司）层析获得化合物。4.1组分采用硅胶和葡聚糖凝胶柱（Sephadex LH-20），层析系统剂分别是石油醚-丙酮（体积比5 1）和氯仿-甲醇体积比（1 1），35第43卷广东海洋大学学报等体积洗脱，通过重结晶手段和高效液相色谱（安捷伦 1100 HPLC，柱子型号 VDSpher PUR100 C18-M-SE，250 mm 10 mm，5 m）纯化获得化合物、和。第3组分用石油醚、二氯甲烷、甲醇（体积比5.0 5.0 0.1）洗脱后，获得两个亚组分，其中组分3.1采用半制备TLC硅胶板（GF254，青岛海洋投资集团有限公司）层析，获得化合物和，同时组分3.2先后用硅胶和葡聚糖凝胶柱（Sephadex LH-20）进行层析分离纯化，获得化合物。以上8个甾体类化合物，采用波谱技术（1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS和HR-ESI-MS）和文献查阅数据库检索等手段，确定其化学结构及立体构型表征。1.2.2 MTT法抗肿瘤活性评价 肿瘤细胞于对数生长期，生长至培养皿底部面积70%时，加入2 mL体积分数0.25%胰蛋白酶消化液，放置于37 含体积分数5%CO2的饱和湿度培养箱中2.5 min，弃胰蛋白酶液，立刻加入血清培养液终止消化。用培养基调整细胞悬液2 105mL-1，在37 含体积分数5%CO2的饱和湿度培养箱中12 h，加入100 L含待测液培养液，粗提物质量浓度设置为 100、200、400、600 g/mL，待测试化合物的质量浓度为 2、5、10、20 g/mL 的梯度浓度，处理 24 h，加入 20 L MTT5 mg/mL，用无菌 PBS（北京启研生物科技有限公司）配制，4 h后形成紫色结晶。在570 nm处测得光密度值，以doxirubicin作为阳性对照21。2 结果与讨论2.1 次级代谢产物结构鉴定扩大培养从该菌种分离获得8个已知甾体类化合物，采用波谱技术（1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS和HR-ESI-MS）和文献查阅数据库检索等手段，确定以上化合物为：（）3-乙酰基-谷甾醇（3-O-acetyl-sitosterol）、（）7-hydroxysitosterol、（）3-hydroxy-5-stigmastan-6-one、（）citreoanthrasteroidB、（）stigmast-4-en-6-ol-3-one、（）5,8-epidioxy-5,8-ergosta-6,22E-dien-3-ol、（）-谷甾醇（-sitosterol）、（）7-ketositosterol，其中，为首次分离自拟盘多毛孢，如图1。化合物：3-乙酰基-谷甾醇（3-O-acetyl-sitosterol），白色无定型粉末（甲醇 CH3OH），阳离子ESI-MS 质荷比m/z 478.5M+Na+，因此该化合物分子式为C31H52O2，UV(CH3OH)lmax210 nm,254 nm。1H NMR(500 MHz,CDCl3)dH5.37(1H,br s,H-6),4.63-4.56(1H,m,H-3),2.31(2H,m,H-4),2.02(3H,s,CH3COO-2),2.00-1.09(30H,m,其中化学位移dH1.01 10-6的s峰是 H-19的3H),0.91(3H,d,J=7.9Hz,H-21),0.84(3H,t,J=9.1 Hz,H-29),0.83(3H,d,J=9.6 Hz,H-26),0.80(3H,d,J=10.0 Hz,H-27),0.67(3H,s,H-18)；13C-NMR(125 MHz,CDCl3)dC170.1(C-1),139.3(C-5),122.3(C-6),73.6(C-3),56.3(C-14),55.7(C-17),49.7(C-9),45.5(C-24),41.9(C-13),39.4(C-4),37.8(C-12),36.7(C-1),36.2(C-10),35.8(C-20),33.6(C-22),31.5(C-7),31.5(C-8),28.8(C-25),27.9(C-2),27.4(C-16),25.7(C-23),23.9(C-15),23.9(C-15),22.7(C-28),21.1(C-2),20.7(C-11),19.5(C-26),18.9(C-27),18.7(C-21),18.4(C-19),11.6(C-18),11.5(C-29)，根据 1D NMR信号，提示该结构式有乙酰基和一个烯烃基，以及经典的甾醇A、B、C和D母核环。经与文献报道的数据22比较，鉴定化合物为3-乙酰基-谷甾醇。化合物：7-hydroxysitosterol，白色无定型粉末（甲醇），阳离子ESI-MS 质荷比m/z 431.5M+H+，因此该化合物分子式为 C29H50O2，UV(CH3OH)lmax210 nm,254 nm。1H NMR(500 MHz,CDCl3)dH5.21(1H,br s,H-6),3.55(1H,m,H-3),2.30(2H,m,H-4),2.02-1.00(30H,m,其中化学位移dH1.07 10-6的s峰是 H-19的3H),0.92(3H,d,J=7.2 Hz,H-21),0.86(3H,t,J=7.7 Hz,H-29),0.83(3H,d,J=9.7Hz,H-26),0.82(3H,d,J=9.7 Hz,H-27),0.69(3H,s,H-18)；13C-NMR(125 MHz,CDCl3)dC145.3(C-5),121.5(C-6),75.8(C-7),71.3(C-3),55.6(C-17),55.3(C-14),48.2(C-9),45.8(C-24),42.8(C-13),41.6(C-4),39.4(C-8,C-12),36.5(C-1),36.4(C-10),36.0(C-20),33.9(C-22),31.4(C-2),29.1(C-25),28.4(C-16),26.0(C-23),25.9(C-15),23.0(C-28),21.1(C-11),19.8(C-26),19.0(C-27),19.0(C-21),18.8(C-19),12.0(C-29),11.8(C-18)，根据1D NMR信号，提示该结构式含有两个连氧吸电子基团的碳和一个烯烃基，以及经典的甾醇A、B、C和D母核环经与文献报道的数据22比较，鉴定化合物为7-hydroxysitosterol。化合物：3-hydroxy-5-stigmastan-6-one，白色无定型粉末（甲醇），阳离子 ESI-MS 质荷比 m/z431.4 M+H+，因此该化合物分子式为C29H50O2。1H36第4期周婧等：红树林内生拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora次级代谢产物及其抗肿瘤活性NMR(500 MHz,CDCl3)dH5.69(1H,br s,H-6),3.66(1H,m,H-3),2.31(2H,m,H-4),2.04-1.01(30H,m,其中化学位移dH1.19 10-6的 s 峰是 H-19 的 3H),0.92(3H,d,J=7.6 Hz,H-21),0.84(3H,t,J=9.6Hz,H-29),0.83(3H,d,J=9.6 Hz,H-26),0.80(3H,d,J=9.6 Hz,H-27),0.67(3H,s,H-18)；13C-NMR(125 MHz,CDCl3)dC202.4(C-6),70.5(C-3),56.1(C-5),54.7(C-17),49.9(C-14),49.9(C-9),46.1(C-7),45.8(C-24),45.4(C-8),43.1(C-13),41.8(C-4),38.7(C-12),36.3(C-1),38.3(C-10),36.1(C-20),33.9(C-22),31.2(C-2),29.1(C-25),28.6(C-16),26.3(C-23),26.1(C-15),23.0(C-28),21.2(C-11),19.0(C-21,C-26),18.9(C-27),17.1(C-19),12.0(C-18,C-29)。根据1D NMR信息，提示该结构有10个Sp3杂化的亚甲基和低场区的酮基。经与文献报道的数据23比较，鉴定化合物化合物为3-hydroxy-5-stigmastan-6-one。化合物：citreoanthrasteroid B，白色无定型粉末（甲醇），阳离子 ESI-MS 质荷比 m/z 393.3 M+H+，因此该化合物分子式为 C28H40O，UV(CH3OH)lmax210 nm,254 nm。1H NMR(500 MHz,CDCl3)dH6.65(1H,s,H-7),6.58(1H,d,J=12.4 Hz,H-12),6.49(1H,d,J=12.4 Hz,H-11),4.16(1H,m,H-4),5.26(1H,dd,J=19.1 Hz,J=10.9 Hz,H-23),5.22(1H,dd,J=19.1 Hz,J=7.6 Hz,H-22),2.20(3H,s,H-19),1.13(3H,d,J=6.8 Hz,H-21),0.92(3H,d,J=7.0 Hz,H-28),0.82(3H,d,J=6.2 Hz,H-26),0.84(3H,d,J=6.6 Hz,H-27),0.59(3H,s,H-18)；13C-NMR(125 MHz,CDCl3)dC130.2(C-1),135.2(C-6),123.6(C-7),137.2(C-8),131.9(C-9),130.8(C-10),123.1(C-11),140.0(C-12),27.9(C-5),31.2(C-2),68.1(C-3),36.5(C-4),68.0(C-13),50.2(C-14),29.7(C-15),21.9(C-16),51.7(C-17),11.5(C-18),14.4(C-19),41.0(C-20),20.9(C-21),132.3(C-22),135.1(C-23),43.6(C-24),33.2(C-25),19.8(C-26),20.1(C-27),17.7(C-28)。根据 1D NMR 信息，提示该结构式含有一个芳香苯环和两个烯烃基团，小耦合常数的3J11,12=12.41判断该烯烃为顺式结构，而大耦合常数的3J22,23=19.1判断该烯烃为反式结构。经与文献报道的数据23比较，鉴定化合物为citreoanthrasteroid B。化合物：stigmast-4-en-6-ol-3-one，白色无定型粉末（甲醇），阳离子 ESI-MS 质荷比 m/z 450.5M+Na+，因此该化合物分子式为 C29H48O2，UV(CH3OH)lmax210 nm,354 nm。1H NMR(500 MHz,CDCl3)dH5.81(1H,br s,4-H),4.35(1H,m,6-H),2.03(1H,7-H),1.37(3H,br s,H-19),0.92(3H,d,J=7.65 Hz,H-21),0.87(d,J=9.55 Hz,3H,H-27),0.84(3H,d,J=7.65 Hz,H-29),0.81(3H,d,J=13.45 Hz,H-26),0.77(3H,s,H-18)；13C-NMR(125 MHz,CDCl3)dC200.5(C-3),168.5(C-5),126.3(C-4),73.3(C-6),56.1(C-17),55.9(C-14),53.6(C-9),45.8(C-24),42.5(C-13),39.6(C-12),38.6(C-7),38.0(C-10),37.1(C-l),36.1(C-20),34.3(C-2).33.9(C-22),29.7(C-8),29.2(C-25),28.2(C-16),26.1(C-23),24.2(C-l5),23.1(C-28),21.0(C-11),19.8(C-26),19.5(C-19),19.0(C-21),18.7(C-27),12.0(C-29),12.0(C-18)。根据1D NMR信息，该结构还有一个酮基和一个烯烃双键结构。经与文献报道的数据25比较，鉴定化合物为stigmast-4-en-6-ol-3-one。化合物：5,8-epidioxy-5,8-ergosta-6,22E-dien-3-ol，白色无定型粉末（甲醇），阳离子ESI-MS 质荷比 m/z 450.4M+Na+，因 此 该 化 合 物 分 子 式 为C28H44O3，UV(CH3OH)lmax207 nm,240 nm。1HNMR(500 MHz,CDCl3)dH6.50(1H,d,J=8.5 Hz,H-7),6.23(1H,d,J=8.5 Hz,H-6),5.22(1H,dd,J=15.3 Hz,J=8.1 Hz,H-23),5.14(1H,dd,J=15.3 Hz,J=7.4 Hz,H-22),3.96(1H,m,3-OH),0.99(3H,d,J=6.5 Hz,H-21),0.90(3H,d,J=7.0 Hz,H-28),0.88(3H,s,H-19),0.83(3H,d,J=8.4 Hz,H-26),0.81(3H,H-27),0.80(3H,s,H-18)；13C-NMR(125MHz,CDCl3)dC135.4(C-6),135.2(C-22),132.3(C-23),130.7(C-7),82.1(C-5),79.4(C-8),66.4(C-3),56.2(C-17),51.7(C-14),51.1(C-9),44.5(C-13),42.8(C-24),39.7(C-20),39.3(C-12),36.9(C-4,C-10),34.7(C-1),34.7(C-19),33.0(C-25),30.1(C-2),28.6(C-l6),23.4(C-15),20.9(C-21),20.6(C-11),19.9(C-27),19.6(C-26),17.5(C-28),12.9(C-18)。根据 1D NMR 信息，两个烯烃基团，且大耦合常数的3J22,23=15.3 判断该烯烃基为反式结构。经与文献报道的数据23比较，鉴定化合物为5,8-epidioxy-5,8-ergosta-6,22E-dien-3-ol。化合物：-谷甾醇（-sitosterol），白色无定型粉末（甲醇），阳离子 ESI-MS 质荷比 m/z 436.5M+Na+，因此该化合物分子式为C29H50O，UV(CH3OH)lmax210 nm,254 nm。1H NMR(500 MHz,CDCl3)dH37第43卷广东海洋大学学报5.38(1H,br s,H-6),3.55(1H,m,H-3),2.30(2H,m,H-4),2.00-1.09 30H,m,含有 1 s(3H,H-19)在dH1.0310-6,0.95(3H,d,J=8.0 Hz,H-21),0.84(3H,t,J=7.2 Hz,H-29),0.86(3H,d,J=9.3 Hz,H-26),0.84(3H,d,J=10.5 Hz,H-27),0.71(3H,s,H-18)；13C-NMR(125 MHz,CDCl3)dC140.7(C-5),121.7(C-6),71.7(C-3),56.7(C-14),56.0(C-17),50.1(C-9),45.8(C-24),42.3(C-13),42.2(C-4),39.7(C-12),37.2(C-1),36.5(C-10),36.1(C-20),33.9(C-22),31.9(C-7),31.9(C-8),31.6(C-2),29.1(C-25),28.2(C-16),26.0(C-23),24.3(C-15),23.0(C-28),21.1(C-11),19.4(C-26),19.8(C-27),19.0(C-21),18.7(C-19),11.9(C-29),11.8(C-18)。根据 1D NMR 信号，提示该结构式含有1个连氧吸电子基团的亚甲基碳和一个烯烃基双键，以及经典的甾醇A、B、C和D母核环。经与文献报道的数据26比较，鉴定化合物为-谷甾醇(-sitosterol)。化合物：7-ketositosterol，白色无定型粉末（甲醇），阳离子ESI-MS 质荷比m/z 45M+Na+，因此该化合物分子式为C29H48O2，UV(CH3OH)lmax234 nm,354 nm。1H NMR(500 MHz,CDCl3)dH5.69(1H,brs,H-6),3.66(1H,m,H-3),2.31(2H,m,H-4),2.04-1.01(30H,m),其中1s(3H,H-19)dH1.19 10-6,0.92(3H,d,J=7.6 Hz,H-21),0.84(3H,t,J=9.6 Hz,H-29),0.83(3H,d,J=9.6 Hz,H-26),0.80(3H,d,J=9.6 Hz,H-27),0.67(3H,s,H-18)；13C-NMR(125MHz,CDCl3)dC202.4(C-7),165.1(C-5),126.1(C-6),70.5(C-3),49.9(C-14),54.7(C-17),49.9(C-9),45.8(C-24),45.4(C-8),43.1(C-13),41.8(C-4),38.7(C-12),36.3(C-1),38.3(C-10),36.1(C-20),33.9(C-22),31.2(C-2),29.1(C-25),28.6(C-16),26.3(C-23),26.1(C-15),23.0(C-28),21.2(C-11),19.0(C-21,C-26),18.9(C-27),17.1(C-19),12.0(C-18,C-29)。根据1D NMR信息，该结构还有一个酮基和一个烯烃结构。经与文献报道的数据27比较，鉴定化合物为7-ketositosterol。2.2 次级代谢产物抗肿瘤活性拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora发酵粗提物抗肿瘤活性为：Hela 致死半浓度 IC50（14.38 1.38）g/mL；A549 IC50（126.73 1.21）g/mL 和HepG2 IC50（237.47 1.75）g/mL。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光吸收值，可反映活细胞数量18,19。抗肿瘤结果显示，阳性对照doxirubicin的抑制肿瘤细胞的能力分别为：Hela IC50为（8.6 0.1）nmol/L；A549 IC50为（0.17 0.01）nmol/L 和HepG2 IC50为（137 30.90）nmol/L。化合物 中、和具有微弱的抗肿瘤活性，与阳性对照组相比有显著差异（P 0.05）。其中，化合物抑制 Hela 的 IC50为（19.06 9.55）mol/L，抑制 A549的 IC50为（27.70 71.25)mol/L；化 合 物 抑 制A549的IC50为(35.77 52.04)mol/L；化合物抑制Hela的IC50为（36.73 61.07）mol/L，抑制HepG2的IC50为（25.56 51.12）mol/L；化合物抑制Hela的IC50为（25.99 5.29）mol/L。由于化合物、和存在A环或B环具有双键的共同属性，推测抗肿瘤活性的能力可能与甾醇母核A和B环的双键有关系。图1拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspore次级代谢产物Fig.1Secondary metabolites isolated from Pestalotiopsis microsporeAcOOOHHOOHHOHOOHOOHHOOOHO7-hydroxysitosterol()3-hydroxy-5-stigmastan-6-one()135781011 131416181920222726282129-sitosterol()Citreoanthrasteroid B()stigmast-4-en-6-ol-3-one()7-ketositosterol()3-O-acetyl-sitosterol()5,8-epidioxy-5,8-ergosta-6,22E-dien-3-ol()38第4期周婧等：红树林内生拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora次级代谢产物及其抗肿瘤活性2.3 拟盘多毛孢代谢抗肿瘤先导化合物Sdy-1生物合成途径推测本研究发现拟盘多毛孢在特殊环境下（盐度20的人工海水）能够利用含有A、B、C和D环母核甾醇类化合物，获得结构特殊的化合物。推测拟盘多毛孢代谢抗肿瘤先导化合物Sdy-1生物合成途如图2，两个法呢基二磷酸（FPP）在缩合酶的作用下形成2,3-环氧角鲨烯，后者在环化酶的催化下脱去一分子氢后，形成经典的含有 A、B、C 和 D 环母核甾体Ergosta-5,7,22-trien-3-ol，并通过A环在氧化裂解酶作用旋转成环形成化合物。Mykhaylo以传统的甾醇为底通过18步物仿生物合成化合物28。图2拟盘多毛孢代谢抗肿瘤先导化合物Sdy-1可能生物合成途径Fig.2Proposed Biosynthetic Pathway for antitumor leading compounds Sdy-1 from Pestalotiopsis microsporaOOOOHHOOHHOHOOHOOHAcOHOOOHOHOOOHOHOOPP2XFPPO2,3-oxidosqualeneHOOHHOOHHOoxidative cleavageH2OHOOHOHreductionoxidative cleavage rotate 180 OreductionacetylationoxidationOhydroxlationcondensationcyclizationhydroxlationreductioncyclizationoxidation7-hydroxysitosterol()hydroxlationDemethylincisterol A3(Sdy-1)3-hydroxy-5-stigmastan-6-one()135781011 131416181920222726282129-sitosterol()citreoanthrasteroid B()stigmast-4-en-6-ol-3-one()7-ketositosterol()3-O-acetyl-sitosterol()5,8-epidioxy-5,8-ergosta-6,22E-dien-3-ol()ergosta-5,7,22-trien-3-olstigmastan-3-onestigmast-4-en-3-oneOH5-Ergosta-7,9(11),22-trien-3-6-diol oxidative cleavage-H2O HO HO OH(22E,24R)-Ergosta-7,9(11),22-triene-3-5,6-triol-H2O3 结论本研究从红树林内生拟盘多毛孢Pestalotiopsismicrospora（KX631718）中分离出8个已知甾体类化合物，经鉴定鉴定化合物 分别为3-乙酰基-谷甾醇（3-O-acetyl-sitosterol）、7-hydroxysitosterol、3-hydroxy-5-stigmastan-6-one、citreoanthrasteroidB、stigmast-4-en-6-ol-3-one、5,8-epidioxy-5,8-ergosta-6,22E-dien-3-ol、-谷甾醇（-sitosterol）、7-ketositosterol，其中化合物 为首次分离自内拟盘多毛孢。抗肿瘤活性评价发现化合物、和具有微弱的抗肿瘤活性，推测抗肿瘤活性能力可能与甾醇母核A和B环的双键有关系。根据化合物的结构特性推测，拟盘多毛孢利用传统的甾体类母核代谢产物产生结构特殊的化合物。并推测拟盘多毛孢能作用常见的甾醇为前体，通过氧化、还原和重排反应产生抗肿瘤先导物Sdy-1，其是抗肿瘤活性药物开发重要的资源，这为抗肿瘤活性机制研究以及药物开发提供了先导化合物和理论基础。参考文献1 HWANG I H,SWENSON D C,GLOER J B,et al.Dissemininsand spiciferone analogues:polyketide-derived metabolitesfrom a fungicolous isolate of Pestalotiopsis disseminataJ.Journal of Natural Products,2016,79(3):523-530.2 VAN SANTEN J A,POYNTON E F,ISKAKOVA