合作猪StAR基因克隆、组织表达及生物信息学分析.pdf
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1、华北农学报():收稿日期:基金项目:甘肃省教育科技创新项目()鲁甘科技协作项目()年现代丝路寒旱农业科技支撑项目()作者简介:闫尊强()男甘肃天水人讲师博士主要从事猪育种理论与技术研究通信作者:滚双宝()男甘肃张掖人教授博士博士生导师主要从事猪育种理论与技术研究合作猪 基因克隆、组织表达及生物信息学分析闫尊强计亚楠王鹏飞张 博石海霞滚双宝(.甘肃农业大学 动物科学技术学院甘肃 兰州.甘肃省现代养猪工程技术研究中心甘肃 兰州)摘要:旨在对合作猪 基因 区进行克隆及生物信息学分析采用 方法检测 基因在不同组织中的表达量以揭示其功能 结果发现合作猪 基因 区长 编码 个氨基酸与猪参考序列相比第 位点
2、处的 突变为 导致第 位的赖氨酸突变成精氨酸为错义突变第 位点处插入 个碱基 后续的 个氨基酸发生改变导致移码突变蛋白分子量.理论等电点.消光系数 不稳定系数.含 个 糖基化位点二级结构主要由 螺旋和无规则卷曲构成二级结构与三级结构基本一致合作猪与猪、绵羊和黄牛 基因核苷酸序列相似性分别为.进化树结果显示合作猪与猪亲缘关系最近表明 基因编码序列具有种属特异性 蛋白是不稳定的亲水性蛋白无信号肽和跨膜区 基因在脾、肾、肺等组织中均有表达睾丸表达量较高表明可能与合作猪睾丸发育有关关键词:合作猪 基因生物信息学组织表达中图分类号:文献标识码:文章编号:():./.(.):.()().:类固醇激素合成急
3、性调节基因()在睾丸、卵巢、肝脏等组织中表达编码的 蛋白是类固醇激素急性调节蛋白相关的脂质转移域家族的重要成员之一在类固 期闫尊强等:合作猪 基因克隆、组织表达及生物信息学分析 醇激素合成过程中起重要作用 蛋白主要由 螺旋和 折叠组成属于转运蛋白前体蛋白有 个氨基酸逐步加工为成熟蛋白活性部位为羧基端称为 相关脂质转运结构域()蛋白是类固醇激素合成过程中重要的限速酶能结合线粒体外膜中的胆固醇转运至内膜(羧基端协助胆固醇从含量多的线粒体外膜转运至含量低的线粒体内膜上氨基端引导其定位到线粒体上)进入内膜中的胆固醇被细胞色素 支链裂解酶催化生成孕烯醇酮孕烯醇酮离开线粒体后在机体不同组织中合成孕酮、睾酮
4、、雌激素、醛固酮等类固醇激素 有研究表明 基因突变后胆固醇很难转化成孕烯醇酮导致先天性肾上腺增生 睾丸间质细胞 基因表达量降低引起间质细胞线粒体内膜的胆固醇供应减少睾酮生成不足造成不育 /小鼠卵巢中的脂质大量积累雌激素水平降低乳房发育不良说明 基因在动物生殖活动中有重要功能合作猪(又称山猪、蕨麻猪)适应极端恶劣气候环境主要分布于甘肃省甘南藏族自治州的合作、夏河、迭部等县(市)的高海拔牧区是我国独有的小型高原型猪种 基因与畜禽繁殖性能密切相关但未见合作猪 基因研究的报道 因此本试验通过克隆合作猪 基因并进行生物信息学分析利用实时荧光定量 技术检测不同组织中 基因表达量为深入研究该基因在合作公猪性
5、成熟过程中的作用提供参考 材料和方法.样品采集选择甘肃省甘南藏族自治州农户放牧饲养的 月龄合作公猪屠宰后采集睾丸、心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、空肠和回肠组织液氮速冻带回实验室 保存.主要试剂 试剂购自北京全式金公司 反转录试剂盒、荧光定量试剂盒、载体购自 公司琼脂糖凝胶 回收试剂盒、感受态细胞和质粒提取试剂盒均购自天根公司其他试剂购自 公司.总 提取及反转录用 提取睾丸、心等组织总 用反转录试剂盒合成 反转录体系 :(./)反应 上一步骤的 反应液加 反应 反应 反应结束后 保存备用.引物设计及合成根据 收录的猪 基因序列(.)及内参 基因序列(.)引物使用.软件设计引物由苏州金唯智生物科技
6、有限公司合成(表)表 引物信息.基因名 转录本号.引物序列()()长度/用途.:扩增:定量:.:定量:.表达量检测以 为模板用 检测 基因在睾丸、心等组织中的表达量 反应体系 其中 上、下游引物各.(./).反应条件为 个循环 基因为内参用 法计算相对表达量用平均值 标准差()表示用 .软件中单因素方差 程序进行显著性检验.克隆及测序睾丸 基因 产物经 的琼脂糖凝胶电泳纯化目的片段与 载体连接并转入 细胞在不含 的液体培养基中振荡培养 取少许液体均匀涂抹于含有、和 的 固体培养基上 培养过夜 华 北 农 学 报 卷采集单个的白色菌落置入含有 的 液体培养基中摇菌 吸菌液做 提取大小与目的条带一
7、致的菌液质粒进行 测序.生物信息学分析合作猪 基因生物信息学分析工具参见表 表 生物信息学分析工具.软件网址 功能用途 :/./.序列比对:/./蛋白质理化性质分析:/./蛋白质疏水性分析:/./.?./跨膜区分析.:/./信号肽分析:/./结构域分析:/./.亚细胞定位分析:/./.?.二级结构预测:/./三级结构预测.:/./糖基化位点预测:/./蛋白相互作用分析 结果与分析.基因克隆及测序 产物经 的琼脂糖凝胶电泳检测获得特异性条带与预期片段大小一致(图)测序后发现 区长 编码 个氨基酸其中第 位点处的 突变为 导致第 位点的赖氨酸突变成精氨酸为错义突变第 位点处插入 个碱基 导致随后
8、个氨基酸发生突变为移码突变(图)图 合作猪 基因 扩增.图 合作猪 基因测序结果分析.图 合作猪 蛋白氨基酸序列比对.期闫尊强等:合作猪 基因克隆、组织表达及生物信息学分析.基因同源性分析及系统进化树构建下载人(.)、绵羊(.)、狗(.)、黑猩猩(.)、家鼠(.)、马(.)、猕猴(.)、黄 牛(.)、猪(.)和鸡(.)的核苷酸序列使用 软件分析合作猪 基因的同源性(表)用 .软件构建 基因的进化树(图)结果发现合作猪与猪的亲缘关系最近其次为黄牛和绵羊与家鼠的亲缘关系最远表 合作猪 基因与其他物种序列比对.物种核苷酸序列相似性 氨基酸序列相似性 人 .绵羊 .狗 .黑猩猩 .家鼠 .马 .猕猴
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