鼠源pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒的构建及其部分功能研究.pdf

794安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)网络出版时间：2023-04-21 10：56：55 网络出版地址:h t t ps:/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1340.015.h t ml鼠源pcDNA3.1-3 x Flag-c-NUP85真核表达质粒的 构建及其部分功能研究姚 燕蔦王淑贤蔦吴银袈，胡 爽蔦胡 颖蔦潘林鑫駕徐 W*摘要 目的 构建鼠源pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85真核表 达质粒，并观察其对脂多糖(LP S)诱导的RAW264.7细胞中 炎症相关因子分泌的影响及对RAW264.7细胞增殖和凋亡 的影响。方法 通过P CR扩增NUP 85基因，构建pc D-NA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85 真核表达质粒。将 pc DNA3.1-3 X Fl a g-c载体进行酶切。纯化的P CR产物与载体连接,将连接 产物转化细菌感受态细胞。酶切鉴定后，再进行测序和比对 分析。然后将其转染至RAW264.7细胞中，通过CCK-8实 验和流式细胞术检测其对LP S诱导的RAW264.7细胞增殖 和凋亡的影响，并通过West er n bl o t技术和ELISA法检测 RAW264.7细胞中肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、白细胞介素-6(IL-6)的表达情况。结果 酶切鉴定和West er n bl o t结果显 示pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85真核表达质粒成功构建和表 达。CCK-8实验结果显示：24 h后过表达NUP 85组细胞的 存活率显著低于对照组(0.55 0.03)(0.67 0.05),F=30.98,P 0.05。流式细胞术结果显示:过表达NUP 85组 细胞的凋亡率高于对照组(15.78 1.05)%vs(13.40 0.47)%=75.38,P 0.05。West er n bl o t 和 ELISA 结果 显示:转染 pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85 质粒后,RAW264.7 细胞中的TNF-a JL-6表达较对照组升高，差异均有统计学 意义(P 0.05)。结论 NUP 85能够抑制LP S刺激的 RAW264.7细胞的增殖并促进其凋亡，并且NUP 85促进LP S 刺激的RAW264.7细胞中炎症因子IL-6和TNF-a的表达。关键词NUP 85；RAW264.7细胞;增殖;凋亡;肿瘤坏死因 子-a;白细胞介素4中图分类号R 364.5文献标志码A 文章编号1000-1492(2023)05-0794-06 d o i:10.19405/j.c n k i.issn io o o-1492.2023.05.015核孑L蛋白85(Nu c l eo po r in 85,NUP 85)是核孔复 合体(Nu c l ea r po r e c o mpl ex,NP C)中 NUP 107 1602022-11-23 接收基金项目：安徽省自然科学基金(编号:1808085MH235.2208085MH 203)作者单位:安徽医科大学1药学院、2生命科学学院，合肥230032 作者简介:姚燕，女,硕士研究生；潘林鑫，男，助理实验员，责任作者,E-ma il:pa n l in x in 126.c o m；徐 涛，男,副教授，硕士生导师，责任作者,E-ma il：x u t a o a h mu.ed u.c n亚复合体(同义Y复合体)的9个成员之一 NP C是指镶嵌在核孔上的一种复杂结构,主要调节 大分子跨核膜的运输。单个核孔蛋白具有基因表达 调控、DNA修复、调控细胞凋亡等作用。研究 表明,NUP 85可与巨噬细胞上表达的C-C-趋化因子 受体(C-C-c h emo k in e r ec ept o r 2,CCR)2 和 CCR5 相 互作用，促进趋化信号传导。此外,NUP 85还可以 通过调节肿瘤相关巨噬细胞调节肿瘤进展,并对炎 症具有一定作用，但具体调控作用及机制尚不清 楚。而炎症是肿瘤进展的关键因素,对调节免疫细 胞进出肿瘤微环境具有重要作用。肿瘤细胞产生各 种细胞因子和趋化因子，吸引白细胞，包括肿瘤坏死 因子-a(t u mo r n ec r o sis f a c t o r-a,TNF-a)、白细胞介 素-6(in t er l eu k in-6,IL-6)等。为进一步研究 NUP 85的功能，该研究通过构建NUP 85的真核质 粒,首次探讨NUP 85在脂多糖(l ipo po l y sa c c h a r id e,LP S)诱导的RAW264.7细胞中对炎症因子(TNF-a,IL-6)的表达及其对细胞增殖和凋亡的影响。1材料与方法1.1实验材料RAW264.7细胞株(安徽医科大学 药学院保存);DMEM培养基(美国Th er mo Sc ien t if ic 公司)；NUP 85抗体(美国Sa n t a c r u z公司)；IL-6抗 体(沈阳万类生物科技有限公司);TNF-a抗体(南 京巴傲得生物科技有限公司)；ECL化学发光试剂 盒(苏州新赛美生物科技有限公司)；Lipo f ec t a min e 2000和Tr izo l(美国In v it r o g en公司)；胎牛血清(美 国Gibc o公司)；P VDF膜(北京索莱宝科技有限公 司)；An n ex in V-FITC/P I双染细胞凋亡检测试剂盒(上海贝博生物有限公司)；质粒抽提试剂盒、Ba mH I、Xh o I内切酶(美国Ax y g en公司)；脱脂奶粉(内蒙 古伊利实业集团股份有限公司)；细胞培养瓶、细胞 培养板(无锡耐思生命科技股份有限公司)；山羊抗 鼠Ig G/辣根酶标记、山羊抗兔Ig G/辣根酶标记(北 京中杉金桥生物技术有限公司)；ELISA(IL-6、TNF-a)试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司)o1.2方法安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)795 1.2.1 pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85 质粒的构建 通过P CR扩增NUP 85基因，构建pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85真核表达质粒。酶切鉴定无误后，由 上海吉玛制药技术有限公司进行测序鉴定。1.2.2 pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85 质粒的转染与 实验分组 将细胞按1 x 106个/孔的密度均匀种入 6孔板内继续培养。将A液(250 pu l的Opt i-MEM 及 2 jig pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85 质粒)与 B 液(250 pl 的 Opt i-MEM 及 5|jl1 Lipo f ec t a min e 2000 脂 质体)分别置于1-5 ml无酶EP管中静置5 min后，将A液和B液混匀，静置20 min后，将其置于6孔 板中再补齐Opt i-MEM培养基至2 ml0 6 h后换液,培养24 h后以进行后续实验。实验分为正常组:未进行任何处理;LP S组:加 100 n g/ml LP S 刺激;对照组(LP S+pc DNA3.1-3 x Ra g-c组)：转染空载体质粒并加100 n g/ml LP S刺 激；NUP 85 过表达组(LP S+pc DNA3.1-3 x Ha g-c-NUP 85 组)：转染 pc DNA3.1-3 x Ha g-c-NUP 85 质粒 并加100 n g/ml LP S刺激。1.2.3 West er n b l o t实验 弃去6孔板中的培养 基,P BS洗3遍，在蛋白裂解液(RIP A裂解液：P MSF=100:1)中裂解细胞,提出总蛋白。用BCA 蛋白质检测试剂盒检测蛋白质浓度。取等量的蛋白 加入上样孔，进行SDS-P AG凝胶电泳。在恒流200 mA条件下湿转60 min,使蛋白转至P VDF膜上,在 脱脂奶粉(50 g/L)中封闭2 h后,用TBST缓冲液清 洗,并在相应的一级抗体中孵育12 h,抗稀释度分 别为 NUP 85(1:500),TNF-a(1:1 000),IL-6(1:1 000)。TBST洗3遍后，室温孵育二抗1 h,TBST 清洗后用ECL化学发光试剂盒进行显影并拍照。1.2.4 CCK-8 实验 将 RAW264.7 细胞按 5 000 个/孔的密度接种到96孔板中，每组设6个复孔，再 向每孔转染约 70 n g pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85 质 粒,6 h后更换为含100 n g/ml LP S的培养基，再培 养24 h后每孔加入10|jl1 CCK-8溶液，正常培养2 h,在避光条件下检测每孔在450 n m处的吸光度，计 算细胞存活率。1.2.5 流式细胞术 将RAW264.7细胞按1 x 106 个/孔的密度均匀种入6孔板内，转染pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85质粒,6 h后更换为含有100 n g/ml LP S的培养基，继续培养24 ho然后用P BS清洗3 遍，收集所有细胞于15 ml离心管中，用400以Ann ex in V结合液重悬细胞,再加入5|x l FITC避光孵 育10-15 min,再加入10(jl1 P I,避光孵育5 min后，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率，并记录。1.2.6 EUSA 检测炎症因子的分泌 将 RAW264.7细胞按1 x 106个/孔的密度均匀种入6 孔板内，转染对照组空载体质粒和pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85质粒,6 h后更换为含有100 n g/ml LP S的培养基，继续培养24 ho 24 h后收集细胞上 清液，使用EUSA方法检测细胞上清液中TNF-a,IL-6的分泌情况,步骤完全按照EUSA(TNF-a、IL-6)检测试剂盒说明书进行。1.3统计学处理 采用SP SS 19.0统计软件进行 数据分析,实验数据均以 s表示,两独立样本均 数比较采用t检验，采用On e-w a y ANOVA检验进行 多组比较,P 0.05示差异有统计学意义。2 结果2.1 pcDNA3.1-3 x Flag-c-NUP85 真核表达质粒 的构建 通过P CR方法扩增目的基因，利用Ba m H I、Xh o I双酶切扩增产物和Pc DNA3.1-3 x Fl a g-c载 体，并用T4 DNA连接酶连接两产物,将连接产物转 化细菌感受态细胞，用抽提试剂盒提取质粒。酶切 鉴定结果显示:pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85质粒成 功构建，即阳性克隆显示在目的条带大小对应的区 域有酶切得到的条带对应的克隆，如图1所示。将 阳性克隆送至上海吉玛制药技术有限公司进行测序1 000750500250100bp n g/5 pl5 000 503 000 302 000 100-1 500 755075505050图1 重组质粒pcDNA313 x Flag-c-NUP85的酶切鉴定1:pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85 的酶切鉴定;M：DNA Ma r k er 796 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)鉴定。2.2 pcDNA3.1-3 x Flag-c-NUP85 真核表达质粒 的表达 用West er n bl o t技术检测将pc DNA3.1-3 X Fl a g-c-NUP 85质粒转染至RAW264.7细胞后的 NUP 85蛋白表达情况。结果显示:LP S组的NUP 85 的蛋白表达量高于正常组(t=7.650,P 0.01)；过 表达组的NUP 85的蛋白表达量高于转染空载体的 对照组(t=10.28,P 0.01),表明 Pc DNA3.1-3 x n a g-c-NUP 85质粒成功表达，见图2OA a bNUP 85dp-a c t inB2.0*系旳來-m嘲S 8 d n x1.51.0b图2 重组质粒pcDNA3 1-3 xFlag-c-NUP85的蛋白表达A：West er n bl o t 检测质粒 pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85 的蛋白表 达；B:NUP 85蛋白表达柱状图；a：正常组；b：LP S组；c：LP S+pc D-NA3.1-3 x Fl a g-c 组；d：LP S+pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85 组；与正常 组比较:*P 0.01；与 LP S+pc DNA3.1-3 X Fl a g-c 组比较:*#P 0.012.3 NUP85对RAW264.7细胞增殖的影响 将 pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85 质粒转染至 RAW264.7 细胞中，用CCK-8法检测细胞的增殖情况。结果显 示：24 h后LP S组和转染空载体对照组的细胞存活 率分别为(0.74 0.08)和(0.67 0.05),过表达 NUP 85组的细胞存活率为(0.55 0.03)，低于LP S 组和转染空载体对照组的细胞存活率(F=30.98,P 0.05),表明在LP S刺激的RAW264.7细胞中，过 表达NUP 85能够抑制细胞的增殖，见图3。2.4 NUP85对RAW264.7细胞凋亡的影响 用 细胞凋亡检测试剂盒和流式仪检测将pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85过表达质粒转染至RAW264.7细 胞24h后的细胞凋亡率。结果显示：24h后正常组 的细胞凋亡率为(6.74 0.46)%,LP S组及转染空 载体对照组的细胞凋亡率分别为(13.13 0.21)%.5.51 1*工V V.5.51.1.0 0#oab e d图3 CCK-8检测细胞增殖a：正常组;b：LP S 组；c：LP S+p(iDNA3 1-3 x Fl a g-c 组；d：IP S+pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85 组;与正常组比较:*P 0.01；与 LP S+pc DNA3.1-3 X Fl a g-c 组比较：#P 0.05和(13.40 0.47)%，而NUP 85过表达组的细胞凋 亡率为(15.781.05)%,高于对照组(F=75.38,P 0.05)，表明在LP S刺激的RAW264.7细胞中，过 表达NUP 85能够促进细胞的凋亡，见图4O2.5 NUP85在RAW264.7细胞中对炎症因子表 达的影响 用West er n bl o t技术检测将pc DNA3.1-3 x Ha g-c-NUP 85质粒转染至RAW264.7细胞后的 IL-6和TNF-a蛋白表达情况。结果显示:过表达组 中的TNF-a表达较转染空载体对照组升高(F=174.4,P 0.01)；IL-6的表达较转染空载体对照组 升高(F=105.3,P 0.01),表明在 RAW264.7 细胞 中,过表达NUP 85促进炎症因子TNF-a和IL-6的 表达，见图5。2.6 NUP85在RAW264.7细胞中对炎症因子分 泌的影响 使用ELISA方法检测将pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85质粒转染至RAW264.7细胞后的IL-6 和TNF-a蛋白分泌情况。结果显示:过表达NUP 85 组中的TNF-a表达较转染空载体对照组升高(F=479.8,P 0.001)；IL-6的表达较转染空载体对照 组升高(F=216.5,P FITC-A2020()*口粵嘿wosswoss0 200 400（x 10）FSC-A k FITCo oo o o oo o2 12 10 200 4OO（x i0）FSC-A i）QI ULQMrfMio3 io4 io5 io6FITC-Ao o oo o o o o oo o o1 3 2 11 3 2 1(x(x3 S S3 S SFITC-A5 o5 o11 1111 11#图 4 重组质粒 pcDNA3 13 x Flag-c-NUP85 对 RAW264.7细胞凋亡的影响A：各组流式细胞术检测结果;B：细胞凋亡率;a：正常组;b：LP S 组;c：LP S+pc DNA3.1-3 x Fl a g-c 组；d：LP S+pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85 组；与正常组比较:*P 0.01；与 LP S+pc D-NA3.1-3 x Fl a g-c 组比较：#P 0.05A a b cIL-6TNF-adP-a c t ino 000o 0002(2(I w/S富聲606040a w dB B0口曇2.01.51.00.50IL-6ZU ab r n c#TNF-a图5 重组质粒pcDNA3.13 x Flag-c-NUP85转染后 Western blot检测炎症因子IL-6和TNF o t的表达A:West er n bl o t 检测 IL-6 和 TNF-a 的蛋白表达；B：IL-6 和 TNF-ot 蛋白表达柱状图;a：正常组;b：LP S 组;c：LP S+pc DNA3.1-3 x Fl a g-c 组;d：LP S+Pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85 组；与正常组比较：*P 0.01；与 LP S+pc DNA3.1-3 x Fl a g-c 组比较严P0.01TNF-a图6 重组质粒pcDNAJ 13 x Flag-c-NUP85转染后ELISA 检测炎症因子IL-6和TNF-a的分泌a：正常组;b：LP S 组；c：LP S+pc DNA3.1-3 x Ha g-c 组；d：LP S+pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85 组；与正常组比较:*P 0.001；LP S+pc DNA3.1-3 x Ha g-c 组比较 2 c m的癌旁组织，制作为组织芯片，进行West er n bl o t和免 疫组化实验，使用Ima g e J分析组织芯片染色的阳性细胞比 例及West er n bl o t结果的灰度值，通过R4.0.5软件对纳入患 者的临床数据和随访数据进行统计学分析。结果免疫组 化结果提示相对于癌旁组织中的表达,eIF2Bl在肿瘤组织 中的表达效果更强。West er n bl o t结果显示，与HepG2细胞 比较,eIF2Bl在HepG2.2.15细胞中表达更强.HCC组织中 eIF2Bl的表达与肿瘤数目相关(P 0.05)。Co x多因素回归分析结果显示,eIF2Bl的表达是HBV-DNA阳性患者总体临 床预后的独立危险因素(HR=4.28,P=0.018)o结论 在 HBV相关的HCC组织中,eIF2Bl的表达显著增强且与HBV DNA阳性的患者的整体生存显著相关。关键词 肝细胞癌;乙型肝炎病毒；eIF2Bl；eIF2a；蛋白质翻 译;预后中图分类号R735.7 文献标志码A 文章编号1000-1492(2023)05-0799-07 d o i：10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.016原发性肝癌是全球第六大癌症,居全世界癌症 相关病死率的第三位。在我国，肝细胞癌(h epa-t o c el l u l a r c a r c in o ma,HCC)是最常见的肝癌类型，占 总病例的85%-90%20肝癌由于其起病隐匿，早 期易漏诊，大多数患者确诊时已处于疾病的中晚阶 段，预后不佳，发现并研究新的分子靶点，是当前 HCC的研究热点内容之一。近年来的研究发现,蛋白质翻译的调控在肿瘤的发生发展过程中发挥着 重要的作用,但是在HCC中，目前还缺少足够的研2023-01-04 接收基金项目：安徽省自然科学基金(编号：1608085MH162)作者单位:安徽医科大学第二附属医院1肝病科、2肝胆外科，合肥230601作者简介:齐文月，女,硕士研究生；邹桂舟，男，教授，硕士生导师，责任作者,E-ma il:a y zo u-g u izh o u sin a.c o m it s ef f ec t o n ex pr essio n o f in f l a mma t io n f a c t o r s in LP S-in d u c ed RAW264.7 c el l s,a s w el l a s o n t h e pr o l if er a t io n a n d a po pt o sis o f RAW264.7 c el l s.Me t hods Th e NUP 85 g en e w a s a mpl if ied by P CR t o c o n st r u c t pc DNA3.1-3 x Fl a g-C-NUP 85 eu k a r y o t ic ex pr essio n pl a smid.Th e pc DNA3.1-3 X Fl a g-c v ec t o r w a s d iv id ed w it h en zy mes.Th e pu r if ied P CR pr o d u c t w a s l ig a t ed w it h t h e v ec t o r,a n d t h e l ig a t ed pr o d u c t w a s t r a n sf o r med in t o ba c t er ia l c o mpet en t c el l s Aft er id en t if ic a t io n by en zy me d ig est io n,seq u en c in g a n d a n a l y sis w er e per f o r med.Th en,it w a s t r a n sf ec t ed in t o RAW264.7 c el l s,a n d t h e bl a n k pl a smid w it h o u t NUP 85 g en e w a s set a s t h e c o n t r o l g r o u p.Th e ef f ec t o n c el l pr o l ifer a t io n a n d a po pt o sis w er e d et ec t ed by CCK-8 a ssa y a n d f l o w c y t o met r y,a n d t h e ex pr essio n o f in f l a mma t o r y c y t ok in es su c h a s t u mo r n ec r o sis f a c t o r-a(TNF-a)a n d in t er l eu k in-6(IL-6)in LP S-in d u c ed RAW264.7 c el l s w a s d et ec t ed by West er n bl o t a n d ELISA.Re sult s En zy me d ig est io n id en t if ic a t io n a n d West er n bl o t r esu l t s sh o w ed t h a t pc DNA3.1-3 x Fl a g-c-NUP 85 eu k a r y o t ic ex pr essio n pl a smid w a s su c c essf u l l y c o n st r u c t ed a n d ex pr essed.Th e r esu l t s o f CCK-8 a ssa y sh o w ed t h a t t h e c el l su r v iv a l r a t e o f NUP 85 o v er ex pr essio n g r o u p w a s sig n if ic a n t l y l o w er t h a n t h a t o f c o n t r o l g r o u p a f t er 24 h (0.55 0.03)vs(0.67 0.05),F=30.98,P 0.05.Th e r esu l t s o f f l o w c y t o met r y sh o w ed t h a t t h e c el l a po pt o sis r a t e o f NUP 85 o v er ex pr essio n g r o u p w a s h ig h er t h a n t h a t o f c o n t r o l g r o u p (15.78 1.05)%vs(13.40 0.47)%,F=75.38,P 0.05.Th e r esu l t s o f West er n bl o t a n d ELISA sh o w ed t h a t a f t er t r a n sf ec t io n o f pc DNA3.1-3 X Fl a g-c-NUP 85,t h e ex pr essio n o f TNF-a a n d IL-6 in RAW264.7 c el l s w er e h ig h er t h a n t h o se in t h e c o n t r o l g r o u p,w it h st a t ist ic a l sig n if ic a n c e(P 0.05).Conc lusion NUP 85 c a n in h ibit t h e pr o l ifer a t io n a n d pr o mo t e a po pt o sis in LP S-st imu l a t ed RAW264.7 c el l s,a n d NUP 85 c a n pr o mo t e t h e ex pr essio n o f inf l a mma t o r y c y t o k in es IL-6 a n d TNF-a in LP S-st imu l a t ed RAW264.7 c el l s.Key words NUP 85；RAW264.7 c el l s；pr o l if er a t io n；a po pt o sis；TNF-a；IL-6