还原响应性聚合物纳米胶束的制备及体外评价.pdf
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1、化学试剂 第 卷第 期还原响应性聚合物纳米胶束的制备及体外评价李世玺冯佳敏刘雪梁旭华王学军(商洛学院 生物医药与食品工程学院陕西 商洛)摘要:以还原响应性两亲性嵌段共聚物 为载体阿霉素()为模型药物通过透析法制备载药聚合物胶束并选择 细胞进行体外抗肿瘤研究 所制备的类球形聚合物胶束具有适宜的粒径尺寸和较好的载药性能(载药量 包封率)在模拟的还原性条件下纳米载体的双硫键发生断裂实现药物的快速释放 体外细胞毒性结果显示聚合物胶束对 细胞具有良好的杀伤作用 采用激光共聚焦显微镜()和流式细胞仪()观察和测定 细胞对胶束的摄取和细胞内的药物释放与分布情况结果显示载药胶束能够有效地被肿瘤细胞摄取在细胞质
2、内快速释药并进入细胞核 因此还原响应性聚合物 在抗肿瘤药物的靶向递送及可控释放方面具有良好的应用前景关键词:还原响应性聚合物胶束阿霉素纳米载体中图分类号:.文献标识码:文章编号:():./.():().(:).()().:收稿日期:网络首发日期:基金项目:陕西省自然科学基础研究计划资助项目()陕 西 省 教 育 厅 专 项 科 研 计 划 项 目()商洛学院自然科学研究项目()商洛市科技计划项目()陕西省科技创新团队项目()陕西省大学生创新创业训练计划项目()作者简介:李世玺()男河南平顶山人博士讲师研究方向为中药纳米制剂及药物合成工艺通讯作者:王学军:.引用本文:李世玺冯佳敏刘雪等.还原响应
3、性聚合物纳米胶束的制备及体外评价.化学试剂():当今社会癌症已经成为威胁人类健康的一大杀手每年都有数以百万计的患者死于癌症目前在癌症的临床治疗中化疗是一种常用的治疗方法大量的化疗药物(如阿霉素、紫杉醇和喜树碱等)用于癌症的临床治疗显示出良好的抗肿瘤活性 受制于较差的水溶性、不稳定性以及对正常组织的毒副作用传统的化疗药物制剂在临床应用中遇到了极大的挑战 纳米药物载体的问世为这一问题的解决提供了一种新的思路 纳米药物载体能够有效地提高化疗药物的溶解度、增强稳定性、延长循环时间、降低对正常细胞的毒副作用和增强抗肿瘤效果 然而传统的纳米药物载体也存在一些弊端因其不可控和不完全的药物释放致使药物无法有效
4、地在病灶部位富集不仅降低了药物的生物利用度而且也容易引起病变细胞的耐药性第 卷第 期李世玺等:还原响应性聚合物纳米胶束的制备及体外评价近年来研究人员通过研发具有特定刺激响应性的药物运载体系来调控化疗药物的递送和释放 目前已经有一系列不同刺激响应性信号(如酶、氧化还原、葡萄糖、和温度)被应用到纳米载体的设计当中极大促进了纳米药物递送体系的发展 正常体液中谷胱甘肽浓度(/)远低于癌细胞中(/)谷胱甘肽的浓度差异经常被用于刺激响应性纳米载体的设计当中 作为能够被谷胱甘肽诱导断裂的化学键双硫键已经被广泛地应用于各种还原响应性纳米载体的制备中本文以聚合物 为载体通过自组装方式负载抗肿瘤药物 形成具有规则
5、形状的均一性聚合物载药纳米胶束 聚合物胶束进入肿瘤细胞后细胞内还原性试剂引发聚合物的双硫键断裂纳米胶束的结构遭到破坏从而释放出所负载的药物并杀伤肿瘤细胞 还原响应性两亲性嵌段共聚物 载药胶束的形成过程、体内的递送、细胞的摄取和细胞内的还原响应性药物释放如图 所示图 负载 的 胶束的形成、递送和细胞内药物释放示意图.实验部分 主要仪器与试剂 型纳米粒度电位仪(英国 公司)型透射电子显微镜(日本电子公司)型荧光光谱仪(日本日立公司)型酶标仪(美国伯乐公司)型激光扫描共聚焦荧光显微镜(日本尼康公司)型流式细胞仪(美国贝克曼公司)两亲性嵌段共聚物、(本课题组自制)(德国默克公司).(上海英轩公司)(美
6、国 公司)、培养基、胰蛋白酶、双抗(美国 公司)胎牛血清(美国 公司)细胞(中国典型培养物保藏中心)载药胶束的制备及应用 胶束对阿霉素的包载聚合物载药胶束通过透析法制备:将 .和 三乙胺溶于 避光搅拌 加入 或室温继续避光搅拌 将 去离子水缓慢滴加到此混合液中继续搅拌 随后将其分别转移至透析袋()中定时更换透析缸内的二次水室温透析 即得 或 的载药胶束 将聚合物载药胶束用 的水系滤膜过滤即得粒径均一的载药胶束 分别取 载药胶束冻干将其用一定量的 溶解利用荧光光谱仪测定 处的发射光强度 依据所制的/的标准曲线来计算胶束中 含量 载药胶束的表征聚合物胶束粒径和粒径分布通过动态光散射仪()进行测定每
7、个样品测定 次后取平均值 聚 合 物 胶 束 的 形 态 由 透 射 电 子 显 微 镜()检测观察样品制备过程具体为:将聚合化学试剂 第 卷第 期物胶束溶液稀释至合适浓度(/)后滴加到镀有 膜的铜网上烘干后使用 (/)的磷钨酸溶液进行染色晾干后即可通过透射电子显微镜观察颗粒的形貌 载药胶束的体外释放以聚合物 的载药胶束()为实验组 的载药胶束()和游离()为对照组模拟还原性环境(含 /的 /)和非还原性环境(不含 的 /)进行体外药物释放实验 具体的操作步骤如下:分别将 的上述 种溶液移至透析袋()中密封好之后浸入 相应的缓冲溶液中于 恒温振荡(/)在设定的时间点从各体系中分别取出 缓冲液并
8、补加相同体积相应的新鲜缓冲液使体系中缓冲液的总体积不变 通过荧光光谱仪测定样品中 含量 载药胶束的细胞毒性采用 法来考察聚合物载药胶束对 细胞的杀伤效果:使用完全 培养基将游离 以及 或 的载药胶束逐级稀释到不同浓度 浓度范围为 /将其分别取 加入到预先种有 细胞的 孔板中(对照组只加入 完全 培养基)于 下继续培养 每孔中加入 于 培养 后移除孔中的 及培养基每孔加入 室温下轻柔振荡使蓝紫色的晶体甲瓒彻底溶解利用酶标仪()测定各孔中溶液在 处的吸光值 每个浓度的胶束溶液和对照组做 个平行样细胞的相对存活率()()/()式中:为背景值(该孔未加胶束及)为对照值(该孔未加胶束而只加)而 则是含不
9、同浓度胶束的各孔的实验值 共聚焦荧光显微镜观察细胞对载药胶束的摄取及细胞内药物分布采用激光共聚焦荧光显微镜()研究聚合物载药胶束被肿瘤细胞摄取情况和细胞内的 分布情况 将 培养基稀释过的 或 载药胶束加入到预先种有 细胞的激光共聚焦皿中 的最终浓度为 /将其分别培养 或 后取出用 缓冲液(/)洗涤()然后用 多聚甲醛溶液避光固定 用 缓冲液清洗()然后于 用 /对细胞核染色 用 缓冲液清洗()在肿瘤细胞内的分布状况可通过 进行观察 流式细胞术研究细胞对胶束的内吞采用流式细胞分析仪()对 细胞内 进行定量测试:将用 培养基稀释过的 或 载药胶束加入到预先种有 细胞的六孔板中 的最终浓度为 /分别
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