海洋来源真菌Eutypella sp. F0219细胞松弛素类代谢产物及其抗肿瘤活性.pdf
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1、Jun.20232023年6 月Journalof HainanlormaaraScienceVol.36 No.2第36 卷第2 期海南师范大学学报(自然科学版)Doi:10.12051/j.issn.1674-4942.2023.02.006海洋来源真菌Eutypella sp.F0219细胞松弛素类代谢产物及其抗肿瘤活性苏为政12,徐欣艺12,欧婷婷1.2,左青乐12,马俊源12,黎婉珊1,2*(1.海南师范大学化学与化工学院/热带药用资源化学教育部重点实验室,海南海口571158;2.海南省热带药用植物化学重点实验室,海南海口571158)摘要:综合运用正、反相硅胶柱层析、薄层层析以及
2、半制备HPLC等多种色谱方法对海洋真菌Eutypellasp.F0219的乙酸乙酯提取物进行系统分离纯化,获得8 个细胞松弛素类化合物(1 8)。经一维核磁共振波谱数据、质谱以及X-射线单晶衍射方法等确定这些化合物分别为phenochalasin A(1),scoparasin D(2),phenochalasin B(3),cytochalasin Z26(4),cytochalasin Z24(5),12-c y t o c h a l a s i n(6),c y t o c h a l a s i n Z2 s(7)和cytochalasinZz,(8)。通过CCK-8实验评价上述化合
3、物在非小细胞肺癌NCI-H1299细胞的增殖影响,筛选结果表明化合物2 表现出中等的抗肿瘤活性,ICso值为(5.10.2 5)mol/L。本研究首次报道了化合物phenochalasinA(1)的X-射线单晶结构。关键词:海洋真菌;弯孢聚壳属;细胞松弛素;结构鉴定;抗肿瘤活性中图分类号:R281.4文献标志码:A文章编号:16 7 4-49 42(2 0 2 3)0 2-0 143-0 7Cytochalasins Isolated from the Marine-derived Fungus Eutypella sp.F0219 and Their Anti-tumor Activitie
4、sSU Weizhengi2,XU Xinyi12,OU Tingting2,ZUO Qingle1?2,MA Junyuan?2,LI Wanshan12*(1.Key Laboratory of Tropical Medicinal Resource Chemistry of Ministry of Education/College of Chemistry andChemical Engineering,Hainan Normal University,Haikou 571158,China;2.Key Laboratory of Tropical Medicinal Plant Ch
5、emistry of Hainan Province,Haikou 571158,China)Abstract:Eight cytochalasins were isolated from the ethyl acetate extract of the marine-derived fungus Eutypella sp.F0219 by applying silica gel and C18 revised-phase column chromatography,TLC,and semi-preparative HPLC methods.On the basis of 1D-NMR,ESI
6、-MS,and single-crystal X-ray diffraction crystallography,the structures of these compoundswere elucidated as phenochalasin A(1),scoparasin D(2),phenochalasin B(3),cytochalasin Z26(4),cytochalasin Z24(5),12-cytochalasin(6),cytochalasin Z2s(7)cytochalasin Z2,(8),respectively.These compounds were evalu
7、ated for cytotoxic activi-ties against NCI-H1299 cell line by the assay of CCK-8.Compound 2 exhibited moderate cytotoxicity with ICso value of(5.1+0.25)mol/L.In addition,this is the first report of the X-ray structure of phenochalasin A(1).Keywords:marine-derived fungus;Eutypella sp.;cytochalasins;s
8、tructure identification;anti-tumor activity收稿日期:2 0 2 2-12-19基金项目:海南省自然科学基金项目(2 2 1QN229);海南省重大科技计划项目(ZDKJ202008);大学生创新创业训练项目(2 0 2 1116 58 0 0 7,2 0 2 2 116 58 0 19);海南省院士创新平台科研专项资金项目(YSPTZX202030)第一作者:苏为政(2 0 0 0),海南万宁人,本科生,研究方向为应用化学。E-mail:*通信作者:黎婉珊(19 8 9),广东佛山人,副教授,研究方向为天然有机化学。E-mail:2023年144海南
9、师范大学学报(自然科学版)海洋约占地球表面积的7 1%,孕育着丰富的生物资源,尤其是海洋微生物资源。与陆地生存环境不同,海洋微生物面临着高盐、高压、低温、低营养、无光照、缺氧等独特的生存环境,因此造就了海洋微生物具有一些独特的基因组成、生理结构和生态功能,从而代谢出系列结构新颖,具有多种生物活性(抗肿瘤、抗炎、抗病毒等)的小分子化合物2。这些小分子化合物具有发展成为药物先导化合物的巨大潜力,是药物研发过程中的重要源泉。弯孢聚壳属(Eutypella)真菌主要分布在中国南海、南极和北极洲的土壤以及澳大利亚和泰国的热带雨林里。据文献报道从该属真菌中发现有倍半、二、细胞松弛素、香豆素、二酮哌嗪、cy
10、tosporin杂等多种类型的次级代谢产物3-8。其中,细胞松弛素类化合物是一类结构复杂多变的化合物。在结构上,典型的细胞松弛素具有三环体系,由高度取代的过氢异吲哚酮核心和9 15个碳的大环组成。根据参与生物合成的氨基酸不同,细胞松弛素可大致分为5类,包括含有苯丙氨酸残基类、含有酪氨酸残基类、含有色氨类、含有丙氨酸残基类以及含有亮氨酸残基类9。该类化合物具有多种生物活性,如杀虫、抗炎、抗肿瘤等,由此受到了天然药物和合成化学研究者的广泛关注。本文研究了一株来源于南海北部海底沉积物的真菌Eutypellasp.F0219的大米发酵产物中细胞松弛素类化合物,从中分离鉴定了8 个该类化合物,均为含有酪
11、氨酸残基类型,分别为 phenochalasin A(1)、s c o p a r a s i n D(2)、p h e n o c h a l a s i n B(3)、c y t o c h a l a s i n Z2 6(4)、c y t o c h a l a s i n Z2 4(5)12 -c y t o c h a l a s i n(6)、c y t o c h a l a s i n Zz s(7)、c y t o c h a l a s i n Zz,(8)(图1)。同时还测定了化合物1单晶结构。采用CCK-8实验筛选了上述细胞松弛素对非小细胞肺癌NCI-H1299细胞的
12、抗肿瘤活性。其中,化合物2 表现出中等的细胞毒活性,ICso值为(5.1+0.2 5)mol/L。22H一13HNHNHNOHHNOHIOHHO23HO234HHNHN-HN-HN-OHHCHHO5678图1化合物1 8 的化学结构Figure1Chemicalstructuresofcompounds181材料与方法1.1试剂和仪器BrukeramaZonSL低分辩质谱仪,瑞士Bruker公司;BrukerAV-400MHz超导核磁共振仪,瑞士Bruker公司;BrukerAPEXDUO单晶衍射仪(铜靶),瑞士Bruker公司;半制备型高效液相色谱仪Waters2545泵和2 9 9 8二极
13、管阵列检测器,美国Waters公司;EYELAN-1001旋转蒸发仪和EYELAA-10000S真空泵,日本东京理化有限公司;YMCC18色谱柱(2 50 10 mmi.d.,5m),日本YMC公司;硅胶(10 0 2 0 0 目)青岛海洋化工厂;C18反相硅胶(ODS-A-HC12nm,50 m),日本YMC公司;其他分析纯溶剂,广州西陇化工股份有限公司;色谱纯甲醇和乙,美国Fisher公司。1.2菌菌株材料与鉴定菌株(Eutypellasp.F0219)从采自南海北部(114.6 6 0 9 E,2 1.59 42 N)水深7 5m的海底沉积物中分离获得。通过形态和ITS区域测序、基因序列
14、与GenBank比对确定该菌株为Eutypella sp.(G e n Ba n k 登录号为NO.145第2 期苏为政,等:海洋来源真菌Eutypella sp.F0219细胞松弛素类代谢产物及其抗肿瘤活性OL825643)。菌种现存放于海南师范大学热带药用资源化学教育部重点实验室(-8 0 低温保存)。1.3菌株发酵、浸膏提取与分离1.3.1菌株的发酵在无菌操作台上将菌种(将2 块约5mm5mm大小的葡萄糖琼脂菌块)接种到灭过菌的装有40 0 mLPDB培养基的锥形瓶中,放置于恒温振荡培养箱(2 8,转速18 0 r/min)中培养约3d获取种子液。然后进行规模培养:在超净工作台上,将种子
15、液接种于大米固体培养基(每1L锥形瓶中8 0 g大米和12 0 mL3%盐水,于12 0 中高压灭菌2 1min),共接种50 瓶,置于室温(2 7)静置发酵2 8 d。1.3.2提取与分离将发酵产物在室温下用乙酸乙酯浸泡5次,浸提液减压浓缩得到乙酸乙酯总浸膏2 9.8 g。乙酸乙酯总浸膏用正相硅胶柱色谱进行分离(2 56 cm,i.d.)。首先,取35g硅胶(7 5 12 0 m)进行拌样,用氯仿-甲醇体系为洗脱液(10 0:1)(5:1)进行梯度洗脱,点板合并流份得到8 个部分Fr.AH。Fr.D(5.1g)经过C18反相硅胶柱层析(甲醇/水:30%10 0%)后获得57 个反相流份。经T
16、LC分析,合并流份2 1 2 3(2 36 mg)后,经高效液相色谱(HPLC)半制备得到化合物1(10.2 mg)。Fr.E(8.2 g)经过C18反相硅胶柱层析(甲醇/水:50%100%)后得到6 3个反相流份。其中流份2 7 通过HPLC半制备得到化合物2(6.8 mg);流份30 通过凝胶柱层析(氯仿:甲醇=1:1)后纯化得到化合物3(2 0.5mg);合并流份2 8 2 9(54.5mg)经过HPLC半制备得到化合物6(3.1mg);流份41经HPLC纯化得到化合物5(12.3mg);流份43与流份44合并(6 3.5mg)后通过HPLC半制备得到化合物4(7.3mg)和化合物7(4
17、.3mg)。1.4抗肿瘤活性测试采用CCK-8实验评价系列化合物在NCI-H1299细胞上的细胞毒活性10)。非小细胞肺癌细胞NCI-H1299细胞接种在96 孔板(每孔510 3个)中,置于37、5%CO,培养箱中过夜培养,观察细胞贴壁良好,吸出各孔培养基,实验组加入含不同浓度的化合物和阳性对照药(顺铂)的培养基,空白组加人不含药物的培养基,再培养48 h之后加人10 LCCK-8试剂。继续孵育2 h后,用微孔板阅读器(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)在450 nm处检测吸光度。用GraphpadPrism处理并分析结果,绘制细胞增殖曲线,计算出50%抑制率时的药物浓度,即I
18、C,值,实验重复进行3次,2结果与讨论2.1化合物结构鉴定化合物1:无色透明晶体,LR-ESIMSm/z496.1M+H)*,lB-45.8(c 0.1,a c e t o n e),U V入max(CH,O H):197.6,224.6,274.3 nm,H NMR(acetone-de,400 MHz):8 8.31(1H,s,4-0H),7.19(1H,br s,2-NH)7.03(2H,d,J=8.4 Hz,H-2,H-6),6.75(2H,d,J=8.4 Hz,H-3,H-5),6.51(1H,d,J=12.0 Hz,H-20),5.75(1H,d,J=12.0 Hz,H-19),5
19、.71(1H,ddd,J=14.8,10.4,2.0 Hz,H-13),5.28(1H,ddd,J=14.8,10.8,3.6 Hz,H-14),5.24(1H,br s,H-7),3.26(1H,m,H-3),3.16(1H,m,H-16),3.00(1H,m,H-8),2.97(1H,t,J=4.0 Hz,H-4),2.92(1H,m,H-5),2.87(1H,dd,J=13.6,4.8 Hz,H-10b),2.68(1H,dd,J=13.6,2.8 Hz,H-10a),2.49(1H,m,H-15b),2.13(1H,m,H-15a),1.76(3H,br s,H,-12),1.47(3
20、H,s,H,-23),1.13(3H,d,J=6.8 Hz,H,-11),1.12(3H,d,J=7.2 Hz,H,-22);13C NMR(acetone-de,100 MHz):8 213.3(C,C-17),170.4(C,C-1),157.2(C,C-4),150.6(C,C-21),142.6(C,C-6),142.5(CH,C-20),131.8(CH,C-2,C-6),131.7(CH,C-14),130.5(CH,C-13),128.8(C,C-1),123.7(CH,C-7),121.1(CH,C-19),116.1(CH,C-3,C-5),90.6(C,C-9),77.7(
21、C,C-18),56.1(CH,C-3),49.7(CH,C-4),46.3(CH,C-8),43.6(CH2,C-10),41.6(C,C-16),39.3(CH,C-15),35.2(CH,C-5),24.9(CH,C-23),20.4(CH,C-22),20.0(CH,C-12),14.3(CH,C-11).上述氢碳核磁波谱数据与文献报道数据 比对,确定化合物1为phenochalasin A。此外,我们还通过铜靶单晶X-射线衍射的方法确定了该化合物的绝对立体构型为3S,4S,5S,8.S,9R16S,18R,单晶衍射图如图2 所示。化合物2:白色粉末,LR-ESIMSm/z524.7M
22、-H-,$+8 6(c0.1,CH,OH),UV(CH,0 H):195.2,225.8,275.5 nm,H NMR(CDCl,400 MHz):8 7.04(2H,d,J=8.4 Hz,H-2,H-6),6.83(2H,d,J=8.4 Hz,1462023年海南师范大学学报(自然科学版)H-3,H-5),6.17(1H,br s,2-NH),6.55 d(1H,d,J=11.6,H-20),5.68(1H,dd,J=15.2,10.0 Hz,H-13),5.62(1H,d,J=11.6 Hz,H-19),5.37(1H,s,H-12a),5.34(1H,m,H-14),5.14(1H,s,
23、H-12b),3.79(1H,d,J=10.6 Hz,H-7),3.76(3H,s,29-0Me),3.31(1H,m,H-5),3.26(1H,m,H-3),2.94(2H,m,H-16,H-8),2.93(1H,m,H-4),2.84(H,dd,J=13.6,3.2 Hz,H-10a),2.65(1H,m,H-15a),2.58(1H,dd,J=13.6,8.8 Hz,H-10b),2.14(1H,m,H-15b),1.49(3H,s,H,-23),1.14(3H,d,J=6.8 Hz,H,-22),1.10(3H,d,J=6.8 Hz,H,-11);13C NMR(CDCl3,100 M
24、Hz):8 211.8(C,C-17),169.3(C,C-1),158.8(C,C-4),149.5(C,C-21),148.6(C,C-6),142.1(CH,C-20),133.6(CH,C-14),130.4(CH,C-2,C-6),128.5(C,C-4),128.3(CH,C-13),120.4(CH,C-19),114.3(CH,C-3,C-5,C-12),86.3(C,C-9),76.9(C,C-18),69.3(CH,C-7),55.3(CH,4-0Me),53.6(CH,C-3),48.7(CH,C-4),47.7(CH,C-8),43.4(CH2,C-10),40.9(C
25、H,C-16),38.8(CH 2,C-15),32.6(CH,C-5),2 4.1(CH,C-2 3),2 0.1(CH,C-2 2),14.6(CH 3,C-11)。上述氢碳核磁波谱数据与文献报道数据12 1比对,确定该化合物为scoparasinD。C12C6C7C5(S)C8(S)(S)(R)C13C3C9(S)Cc15C10C21C19C22C17C1C3C20C18(R)C23C5图2化合物1的单晶衍射结构Figure2The x-ray structure of compound 1化合物3:白色粉末,LR-ESIMSm/z548.3M+Nal*,a-53.2(c 0.1,CH,
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