海南红树林内生真菌Endomelanconiopsis endophytica次级代谢产物及其体外生物活性.pdf

广东海洋大学学报Journal of Guangdong Ocean University第 43 卷第 4 期2023 年 7 月Vol.43 No.4Jul.2023吴杰，陈丹丹，邓小林，等.海南红树林内生真菌Endomelanconiopsis endophytica次级代谢产物及其体外生物活性J.广东海洋大学学报,2023,43(4):27-33.收稿日期：2023-04-02基金项目：2022年度海南大学协同创新中心项目（XTCX2022STB01）；海南省重点研发项目（ZDYF2021108）；国家自然科学基金（81973229/82160675）；广东省海洋药物重点实验室开放课题（LMM2021-4）第一作者：吴杰（1997），硕士研究生，研究方向为红树林微生物天然产物化学。E-mail:通信作者：徐静（1981），教授，研究方向为海南特有药用植物和红树林微生物天然产物化学以及药物先导化合物的开发。E-mail:海南红树林内生真菌Endomelanconiopsis endophytica次级代谢产物及其体外生物活性吴杰，陈丹丹，邓小林，徐志勇，徐静(海南大学生态文明协同创新中心/海南大学化学工程与技术学院 海南省精细化工工程技术研究中心，海南 海口 570228)摘要：【目的】研究源自海南红树林植物角果木（Ceriops tagal）内生真菌Endomelanconiopsis endophytica的次级代谢产物及其体外生物活性。【方法】利用正相硅胶柱层析、反相ODS柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、半制备高效液相色谱等色谱分离方法，对该菌发酵产物的乙酸乙酯浸膏的次级代谢产物进行分离纯化；综合利用核磁共振波谱（NMR）、质谱（MS）等波谱学技术以及与文献数据比对，鉴定化合物的结构；并对化合物进行体外细胞毒活性和免疫抑制活性评价。【结果】从内生真菌Endomelanconiopsis endophytica中分离得到9个化合物，其结构分别鉴定为（4E，8E）-2-N-（2-hydroxypalmitoyl）-1-O-（-D-glucopyranosyl）-9-methyl-4，8-sphingadienine（）、2-（1-hydroxyethyl）quinazolin-4（3H）-one（）、uridine（）、citreoisocoumarinol（）、5-hydroxymellein（）、roccellatol（）、dibutylphthalate（）、p-hydroxybenzoic acid（）、daucosterol（）；化合物、对人肿瘤细胞A549和HepG2具有一定的体外抗增殖活性，其中化合物对人肝癌细胞HepG2有显著的细胞毒活性，IC50值为（0.87 0.41）mol/L；化合物 均无免疫抑制活性。【结论】化合物、为首次从Endomelanconiopsis属菌中分离得到，化合物具有显著的体外细胞毒活性。关键词：红树林；内生真菌；Endomelanconiopsis endophytica；次级代谢产物；细胞毒活性中图分类号：Q939；R282.77文献标志码：A文章编号：1673-9159（2023）04-0027-07doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2023.04.004Secondary Metabolites and Their Biological Activity in vitro fromHainan Mangrove-derived Fungus Endomelaconiopsis endophyticaWU Jie,CHEN Dan-dan,DENG Xiao-lin,XU Zhi-yong,XU Jing(Collaborative Innovation Center of Ecological Civilization,Hainan University/Hainan Provincial FineChemical Engineering Research Center,College of Chemical Engineering and Technology,HainanUniversity,Haikou 570228,China)Abstract:【Objective】ToinvestigatethesecondarymetabolitesandtheirbioactivitiesofEndomelanconiopsis endophytica,which was isolated from the Hainan mangrove Ceriops tagal.【Method】The column chromatography on silica gel,reverse-phase ODS column chromatography,Sephadex LH-20,and semi-preparative High Performance Liquid Chromatography(HPLC)were第43卷广东海洋大学学报applied to isolate and purify the secondary metabolites from the ethyl acetate(EtOAc)extract of thefermentation broth.The structures of the isolated compounds were elucidated on the basis of extensiveNMR and MS spectroscopic data,and by comparison with the literature data.The cytotoxic activity andimmunosuppressive activity of the isolated compounds were evaluated in vitro.【Result】Ninecompounds were obtained from Endomelanconiopsis endophytica.Their structures were identified as(4E,8E)-2-N-(2-hydroxypalmitoyl)-1-O-(-D-glucopyranosyl)-9-methyl-4,8-sphinga-dienine(),2-(1-hydroxethyl)quinazolin-4(3H)-one(),uridine(),citreoisocoumarinol(),5-hydroxymellein(),roccellatol(),dibutylphthalate(),p-hydroxybenzoic acid()and daucosterol().Compounds,and showed in vitro anti-proliferative activity against human tumor cells A549 andHepG2.In particular,compound exhibited significant cytotoxicity against HepG2 cells with anIC50value of(0.87 0.41)mol/L.Compounds -have no immunosuppressive activity.【Conclusion】This is the first report of compounds and being identified in the genusEndomelanconiopsis,and compound showed significant cytotoxic activity in vitro.Key words:mangrove;endophytic fungi;Endomelanconiopsis endophytica;secondary metabolites;cytotoxic activity红树林植物是生长于热带、亚热带海岸和河口潮间带的木本植物群落1,2，海陆边缘生态系统的独特生境使得红树林来源内生真菌具有独特的遗传背景和代谢途径3,4，蕴藏着结构新颖、活性显著的次级代谢产物5,6，是药源分子发现的重要天然宝库，已成为海洋天然产物的研究热点7。Endomelanconiopsis是由 Rojas等8于 2008 年发现并建立的新属，内生拟内黑盘壳菌Endomelanconiopsisendophytica于2015年在我国海南东寨港和广东湛江高桥红树林湿地的秋茄（Kandelia candel）叶片、根及木揽（Bruguiera gymnorrhiza）叶片中被首次发现并命名9，该菌种具有较宽的宿主范围，之后陆续从石菖蒲（Calamus castaneus Griff）10、伞花谷木（Memecylon umbellatum）11和粗叶榕（Ficus hirta）12中分离得到。由于该菌种研究历史较短，目前国内外对于其次级代谢产物及其生物活性研究的相关报道较少，迄今全世界仅报道了9个缩酮类化合物，例如 endomeketals AB13，xyloketals K 和 L14，因此，内生拟内黑盘壳菌的次级代谢产物具有巨大的挖掘潜力。本研究利用正相硅胶柱层析、反相ODS柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、半制备高效液相色谱等色谱分离方法，对红树林植物角果木（Ceriopstagal）内 生 拟 内 黑 盘 壳 菌 Endomelanconiopsisendophytica J10发酵产物的乙酸乙酯提取物进行分离纯化；综合利用核磁共振波谱（NMR）、质谱（MS）等波谱学技术以及与文献数据比对，鉴定化合物的结构；并对化合物进行体外细胞毒活性和免疫抑制活性评价，以期获得活性显著的次级代谢产物，为天然药物的开发提供基础。1 材料与方法1.1 主要材料和设备石油醚、丙酮、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷（分析纯，广东西陇化工有限公司）；甲醇（色谱级，广东西陇化工有限公司）；4 6周BLAB/c小鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司）；RPMI 1640培养基、细胞增殖-毒性检测试剂盒（CCK-8）、红细胞裂解液（武汉博士德生物工程有限公司）；刀豆蛋白A（ConA，美国Sigma公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；MEM培养基（中科迈晨公司）；噻唑蓝（Sigma公司）；质量分数0.1%结晶紫染色液（Solarbio公司）；PDA培养基（广东环凯微生物公司）；PDB培养基（广东环凯微生物公司）；大米（福州稻花香公司）。核磁共振波谱仪（400MHZ，德国Bruker公司）；高分辨电喷雾质谱（HRESIMS，德国Bruker公司）；紫外光谱仪（Shimadzu UV-2550，日本 Shimadzu 公司）；红外光谱仪（Nicolet 380，美国Thermo Fisher公司）；旋光仪（MCP5100，奥地利Anton Paar公司）；薄层层析硅胶板（GF254，200 300 m，青岛海洋化工公司）；柱层析硅胶（60 80 m，青岛海洋化工公司）；Sephadex LH-20（瑞典Pharmacia公司）；ODS反相填料（octadecylsilyl，日本京都Nacalai公司）；半制备高效液相色谱仪（1200LC型，美国安捷伦公司）；C18 反相柱（250 mm10 mm，5 m，美国安捷伦公28第4期吴杰等：海南红树林内生真菌Endomelanconiopsis endophytica次级代谢产物及其体外生物活性司）；CO2细胞培养箱（JY600C，RS Biotech 公司）；430167型培养皿（康宁公司）；0.3100型毛细管（赛默飞公司）。1.2 实验方法1.2.1 菌株发酵 红树林植物角果木（Ceriops tagal)内生真菌Endomelanconiopsis endophytica J10（该菌是本研究团队前期分离自海南东寨港红树林角果木，现保存于海南大学李运强理工实验大楼 B417室）接种在PDA培养基（含马铃薯浸出粉200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15 g/L和氯霉素0.1 g/L）上进行活化，活化后的菌株接种到PDB培养基中摇床培养3 d（100 r/min）获得种子液，然后将种子液转接至灭菌好的大米固体培养基中，于28/mL下静置发酵35 d。1.2.2化合物的分离和纯化菌株发酵完成后，用乙酸乙酯浸泡提取3次，每次间隔24 48 h，提取液经旋转蒸发仪减压浓缩得到15 g浸膏。将浸膏经减压硅胶柱，用二氯甲烷（CH2Cl2）和甲醇（CH3OH）溶液梯度洗脱（体积比依次为100 0、100 1、100 2、100 4、100 8、100 16、100 32、100 64和0 100），得到11个组份（Fr.1 Fr.11）。经正相硅胶柱梯度洗脱（CH2Cl2与 CH3OH 体积比依次为 100 0、100 1、100 2、100 4、100 8），Fr.4可得到6个组分（Fr.4.1 Fr.4.6）。对 Fr.4.2 进行 Sephadex LH-20 凝胶柱层析（CH2Cl2与CH3OH体积比为1 1）和重结晶法，得到化合物（6 mg）。Fr.4.3 经 ODS 反相柱层析（CH3OH与H2O体积比依次为20 100，40 100，60 100，80 100）、Sephadex LH-20 凝胶柱层析（CH2Cl2与CH3OH 体积比为 1 1）和半制备高效液相色谱（CH3OH与H2O体积比为50 50，波长210 nm，流速2 mL/min），可得到化合物（5 mg，保留时间 tR=12 min）和化合物（3 mg，tR=19 min）。对 Fr.5（CH2Cl2与CH3OH体积比为100 4）进行正相硅胶柱（CH2Cl2与CH3OH体积比依次为100 0、100 1、100 2、100 4、100 8、100 16）梯度洗脱，共得到 9 个组分Fr.5.1 Fr.5.9，再经 ODS 反相柱层析（CH3OH 与H2O体积比依次为30 100，50 100，70 100，80 100）和Sephadex LH-20凝胶柱层析（CH2Cl2与CH3OH体积比为1 1），从Fr.5.3得到化合物（8 mg）和化合物（5 mg）。Fr.5.6经ODS反相柱层析 CH3OH与H2O 体积比为（30 100）（80 100）和 SephadexLH-20凝胶柱层析（CH2Cl2与CH3OH体积比为1 1），半制备高效液相色谱（CH3OH与H2O体积比为30：70，210 nm，2 mL/min），可得到化合物（5 mg，tR=16 min）和化合物（3 mg，tR=25 min）。对 Fr.7CH2Cl2与CH3OH体积比为（100 4）（100 8）进行正相硅胶柱（CH2Cl2与CH3OH体积比依次为100 2、100 4、100 8、100 16、100 32）梯度洗脱处理，可得到8个组分（Fr.7.1 Fr.7.8），再经Sephadex LH-20凝胶柱层析（CH2Cl2与CH3OH体积比为1 1），可从Fr.7.3和Fr.7.5分别得到化合物（7 mg）及化合物（5 mg）。1.2.3生物活性检测对所分离的9个化合物进行体外细胞毒活性筛选和免疫抑制活性筛选。通过MTT法15测定化合物对肿瘤细胞HepG2和A549的体外细胞毒活性。MTT法测体外细胞毒活性：将处于对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔板，接种密度为5 000/孔，每孔100 L，贴壁培养24 h后弃掉上清培养基，待测化合物用培养基稀释至终质量浓度10 g/mL，设置3个复孔，然后在培养板中加入待测化合物培养24 h，弃上清，每孔加入新鲜培养基100 L和质量浓度为5 mg/mL的MTT溶液20 L，放入37 的CO2恒温培养箱避光孵育4 h，然后弃上清加纯二甲基亚砜（DMSO），充分震荡 10 min后，用酶标仪于570 nm处测定光密度值。通过CCK-8法16测定化合物对小鼠脾细胞的毒性和对ConA诱导的T细胞增殖的抑制作用17,18。脾细胞毒性测定：96孔板每孔加入100 L制备好的小鼠脾细胞悬浮液（1 107mL-1），放入培养箱4 h以稳定细胞。药物组中，每孔加入100 L用RPMI-1640完全培养基稀释至终质量浓度为10 g/mL的单体化合物；空白对照组中，每孔加入100 L含体积分数为0.2%DMSO的完全培养基。每组设置3个复孔，将培养板置于培养箱中培育72 h后，加入20 L的 CCK-8 试剂，再用培养箱培育 4 h，用酶标仪在450 nm处测定光密度值。ConA诱导脾细胞增殖实验：96孔板中每孔加入100 L小鼠脾细胞悬液（5 106mL-1），等细胞稳定后，ConA组中每孔加入100 L 5 g/mL ConA；药物组中每孔加入100 L 5 g/mL 的ConA和单体化合物溶液。将96孔板置于37、含体积分数5%CO2培养箱中连续培养 48 h，然后加入 20 L的 CCK-8试剂，培养箱中培育4 h后，用酶标仪于450 nm处测定光密度值。2 结果与分析2.1 化合物结构鉴定化合物 的化学结构见图1。29第43卷广东海洋大学学报图1化合物 的化学结构Fig.1Structures of compounds 2 结果与分析 2.1 化合物结构鉴定 化合物 的化学结构见图 1。OH4321OO7OHOH8123456()654321COOHOH()7654a8a843O1OOHOH9()23451016789141312111516172022232428292526271 O2345OOHHOOH6191821HO()OHOHHOOOH13121110943O2154a8a876()5432168OO7OO12341234()5432O 1 6OHHOHOOH12NH12OHO34567891011121314151617183456789101112131415161718OH19()89105674NH32N1O12OH()()N1654NH321234OOOOHHO5HOOHOH图 1 化合物 的化学结构 Fig.1 Structures of compounds 化合物：白色粉末，正源 HRESIMS 测得其准分子离子峰质荷比 m/z=776.5653 M+Na+，推出其分子式为 C43H79NO9（C43H79NO9Na 理论相对分子质量为 776.5652）。1H NMR 数据（400 MHz，氘代甲醇CD3OD）H分别为：5.82(m,H-4),5.70(m,H-5),5.50(dd,J=13.9,6.0 Hz,H-3),5.47(dd,J=15.0,7.3 Hz,H-3),5.13(t,J=6.3 Hz,H-8),4.62(s,NH),4.43(d,J=6.0 Hz,H-2),4.26(d,J=7.8 Hz,H-1),4.13(m,Ha-1),4.12(m,H-3),3.95(td,J=8.3,5.3 Hz,H-2),3.86(d,J=11.6 Hz,Ha-6),3.70(dd,J=13.3,3.2 Hz,Hb-1),3.68(d,J=11.6,3.2Hz,Hb-6),3.35(d,J=8.8 Hz,H-3),3.27(d,J=6.2 Hz,H-4,H-5),3.18(t,J=8.2 Hz,H-2),2.07(m,Ha-7),2.04(m,CH2-6),2.03(t,J=8.4 Hz,CH2-14),2.03(m,CH2-7),1.97(m,CH2-10),1.59(s,CH3-19),1.38(m,H-15),1.31(m,CH2-17,CH2-17),1.28(m,CH2-11CH2-13,CH2-6CH2-15),1.27(m,CH2-5,CH2-16,CH2-16),0.89(t,J=6.4 Hz,CH3-18,CH3-18)；13C NMR 数据(100 MHz,CD3OD)C分别为 175.4(C-1),136.7(C-9),134.7(C-4),134.5(C-5),131.0(C-4),129.0(C-3),124.9(C-8),104.7(C-1),77.9(C-5),77.8(C-3),75.0(C-2),74.1(C-2),72.9(C-2),71.5(C-5),69.7(C-1),62.6(C-6),54.6(C-2),40.8(C-10),33.8(C-6),33.5(C-5),33.1(C-16,C-16),30.85-30.26(C-11C-15、C-6C-15),29.2(C-14),28.8(C-7),23.8(C-17,C-17),16.2(C-19),14.5(C-18,C-18)。综合分析化 合 物 的 氢 谱 和 碳 谱 数 据，并 与 文 献 19 的 数 据 进 行 对 比，确 定 化 合 物 为(4E,8E)-2-N-(2-hydroxypalmitoyl)-1-O-(-D-glucopyranosyl)-9-methyl-4,8-sphingadienine。化合物：白色粉末，正源 HRESIMS 测得其准分子离子峰质荷比 m/z=191.0818 M+H+，推出分子式为 C10H10N2O2（C10H11N2O2理论相对分子质量为 191.0820）。1H NMR 数据（400 MHz，CD3OD）H分别为 8.19(dd,J=8.1,1.5 Hz,H-10),7.81(td,J=8.1,1.5 Hz,H-8),7.68(dd,J=8.1,1.1 Hz,H-7),7.51(td,J=8.1,1.1 Hz,H-9),4.72(q,J=6.7 Hz,H-1),1.53(d,J=5.3 Hz,CH3-2)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)C分别为 164.7(C-4),162.5(C-2),149.6(C-6),140.0(C-8),127.9(C-9),127.5(C-7),127.2(C-10),122.2(C-5),68.1(C-1),22.4(C-2)。综合分析化合的氢谱和碳谱数据，并与文献20的数据进行对比，O化合物：白色粉末，正源HRESIMS测得其准分子离子峰质荷比m/z=776.565 3 M+Na+，推出其分子式为 C43H79NO9（C43H79NO9Na理论相对分子质量为776.565 2）。1H NMR数据（400 MHz，氘代甲醇 CD3OD）H分别为：5.82(m,H-4),5.70(m,H-5),5.50(dd,J=13.9,6.0 Hz,H-3),5.47(dd,J=15.0,7.3 Hz,H-3),5.13(t,J=6.3 Hz,H-8),4.62(s,NH),4.43(d,J=6.0 Hz,H-2),4.26(d,J=7.8 Hz,H-1),4.13(m,Ha-1),4.12(m,H-3),3.95(td,J=8.3,5.3 Hz,H-2),3.86(d,J=11.6 Hz,Ha-6),3.70(dd,J=13.3,3.2 Hz,Hb-1),3.68(d,J=11.6,3.2Hz,Hb-6),3.35(d,J=8.8 Hz,H-3),3.27(d,J=6.2 Hz,H-4,H-5),3.18(t,J=8.2 Hz,H-2),2.07(m,Ha-7),2.04(m,CH2-6),2.03(t,J=8.4 Hz,CH2-14),2.03(m,CH2-7),1.97(m,CH2-10),1.59(s,CH3-19),1.38(m,H-15),1.31(m,CH2-17,CH2-17),1.28(m,CH2-11CH2-13,CH2-6 CH2-15),1.27(m,CH2-5,CH2-16,CH2-16),0.89(t,J=6.4 Hz,CH3-18,CH3-18)；13C NMR数 据(100 MHz,CD3OD)C分 别 为 175.4(C-1),136.7(C-9),134.7(C-4),134.5(C-5),131.0(C-4),129.0(C-3),124.9(C-8),104.7(C-1),77.9(C-5),77.8(C-3),75.0(C-2),74.1(C-2),72.9(C-2),71.5(C-5),69.7(C-1),62.6(C-6),54.6(C-2),40.8(C-10),33.8(C-6),33.5(C-5),33.1(C-16,C-16),30.85-30.26(C-11 C-15、C-6 C-15),29.2(C-14),28.8(C-7),23.8(C-17,C-17),16.2(C-19),14.5(C-18,C-18)。综合分析化合物的氢谱和碳谱数据，并与文献19的数据进行对比，确定化合物为(4E,8E)-2-N-(2-hydroxypalmitoyl)-1-O-(-D-glucopyranosyl)-9-methyl-4,8-sphingadienine。化合物：白色粉末，正源HRESIMS测得其准分子离子峰质荷比 m/z=191.081 8 M+H+，推出分子式为C10H10N2O2（C10H11N2O2理论相对分子质量为191.082 0）。1H NMR数据（400 MHz，CD3OD）H分别为 8.19(dd,J=8.1,1.5 Hz,H-10),7.81(td,J=8.1,1.5 Hz,H-8),7.68(dd,J=8.1,1.1 Hz,H-7),7.51(td,J=8.1,1.1 Hz,H-9),4.72(q,J=6.7 Hz,H-1),1.53(d,J=5.3 Hz,CH3-2)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)C分别为164.7(C-4),162.5(C-2),149.6(C-6),140.0(C-8),127.9(C-9),127.5(C-7),127.2(C-10),122.2(C-5),68.1(C-1),22.4(C-2)。综合分析化合的氢谱和碳谱数据，并与文献20的数据进行对比，确定化合物为 2-(1-hydroxyethyl)quinazolin-4(3H)-one。化合物：白色固体，负源HRESIMS测得其准分子离子峰质荷比m/z=243.063 8 M-H-，推出分子式为 C9H12N2O6（C9H11N2O6理论相对分子质量为243.061 7）。1H NMR 数据（400 MHz，DMSO-d6）H30第4期吴杰等：海南红树林内生真菌Endomelanconiopsis endophytica次级代谢产物及其体外生物活性分别为 11.28(s,NH),7.88(d,J=8.1 Hz,H-6),5.78(d,J=5.4 Hz,H-1),5.63(d,J=8.0 Hz,H-5),5.40(s,OH-2),5.10(s,OH-3),4.01(t,J=5.0 Hz,H-2),3.96(d,J=4.0 Hz,H-3),3.83(dd,J=7.0,3.4 Hz,H-4),3.62(m,Ha-5),3.53(m,Hb-5)；13C NMR数据(100 MHz,DMSO-d6)C分别为 163.1(C-4),150.8(C-2),140.7(C-6),101.7(C-5),87.70(C-1),84.8(C-4),73.5(C-3),69.9(C-2),60.8(C-5)。综合分析化合物的氢谱和碳谱数据，并与文献21的数据进行对比，确定化合物为uridine。化合物：白色晶体，正源HRESIMS测得其准分子离子峰质荷比m/z=303.121 1 M+Na+，推出分子式为C14H16O6（C14H16O6Na理论相对分子质量为303.120 8）。1H NMR数据(400 MHz,CD3OD)H分别为 6.35(d,J=1.5 Hz,H-5),6.28(d,J=1.5 Hz,H-7),4.13(m,H-10),3.96(m,H-12),2.67(dd,J=14.4,3.6 Hz,Ha-9),2.52(dd,J=14.4,8.3 Hz,Hb-9),1.62(td,J=13.9,8.0 Hz,Ha-11),1.59(td,J=13.9,4.9Hz,Hb-11),1.19(d,J=6.2 Hz,CH3-13)。13C NMR(100 MHz,CD3OD)C分别为167.8(C-1),167.3(C-6),164.8(C-8),155.9(C-3),141.2(C-4a),107.3(C-4),103.7(C-5),102.6(C-7),99.8(C-8a),68.7(C-10),67.1(C-12),46.4(C-11),42.5(C-9),23.5(C-13)。综合分析化合物的氢谱和碳谱数据，并与文献22的数据进行对比，确定化合物为citreoisocoumarinol。化合物：白色粉末，负源HRESIMS测得其准分子离子峰质荷比m/z=193.052 6 M-H-，推出分子 式 为 C10H10O4（C10H9O4理 论 相 对 分 子 质 量 为193.050 1）。1H NMR 数据（400 MHz，DMSO-d6）H分别为 10.38(s,8-OH),9.35(s,5-OH),7.05(d,J=8.9 Hz,H-6),6.71(d,J=8.9 Hz,H-7),4.72(m,H-3),3.06(dd,J=17.0,3.4 Hz,Ha-4),2.58(m,J=17.0,11.6 Hz,Hb-4),1.42(d,J=6.3 Hz,H-9)。13C NMR数 据(100MHz,DMSO-d6)C分 别 为 169.6(C-1),153.9(C-8),145.6(C-5),124.5(C-8a),123.9(C-6),115.1(C-7),108.1(C-5a),75.9(C-3),28.0(C-4),20.5(C-9)。综合分析化合物的氢谱和碳谱数据，并与文献23的数据进行对比，确定化合物为(R)-5-hydroxymellein。化合物：白色晶体，负源HRESIMS测得其准分子离子峰质荷比m/z=271.071 9 M-H-，推出分子式为C12H16O7（C12H15O7理论相对分子质量为271.071 2）。1H NMR 数据（400 MHz，CD3OD）H分别为 6.17(d,J=2.4 Hz,H-5),6.11(d,J=2.4 Hz,H-3),4.40(dd,J=11.4,4.3 Hz,Ha-1),4.29(dd,J=11.4,6.2 Hz,Hb-1),3.96(td,J=11.4,5.7 Hz,H-2),3.80(dd,J=4.7,2.7 Hz,H-3),3.62(dd,J=5.4,1.6 Hz,H-4),2.49(s,H3-8)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)C分 别 为172.9(C-7),166.2(C-2),165.4(C-6),144.6(C-4),113.2(C-3),105.0(C-5),102.1(C-1),73.9(C-3),71.1(C-2),67.0(C-1),64.4(C-4),24.6(C-8)。综合分析化合物的氢谱和碳谱数据，并与文献24的数据进行对比，确定化合物为roccellatol。化合物：白色粉末，正源HRESIMS测得其准分子离子峰质荷比m/z=301.141 1 M+Na+，推出分子式为C16H22O4（C16H22O4Na理论相对分子质量为301.141 6）。1H NMR 数据（400 MHz，DMSO-d6）H分别为 7.71(dt,J=5.2,3.4 Hz,H-3,H-6),7.67(dt,J=5.3,3.6 Hz,H-4,H-5),4.20(t,J=6.5 Hz,CH2-1,CH2-1),1.64(m,CH2-2,CH2-2),1.37(m,CH2-3,CH2-3),0.91(t,J=7.4 Hz,CH3-4,CH3-4).13CNMR数据(100 MHz,DMSO-d6)C分别为161.0(C-7,C-8),132.9(C-1,C-2),131.5(C-4,C-5),128.7(C-3,C-6),65.0(C-1,C-1),30.0(C-2,C-2),18.7(C-3,C-3),13.6(C-4,C-4)。综合分析化合物的氢谱和碳谱数据，并与文献25的数据进行对比，确定化合物为dibutylphthalate。化合物：白色固体，负源HRESIMS测得其准分子离子峰质荷比m/z=137.025 9 M-H-，推出分子 式 为 C7H6O3（C7H5O3理 论 相 对 分 子 质 量 为137.023 9）。1H NMR数据（400 MHz，CD3OD）H分别为 7.86(d,J=8.7 Hz,H-2,H-6),6.80(d,J=8.7Hz,H-3,H-5)。13C NMR数据(100 MHz,CD3OD)C分别为 170.3(C-7),163.3(C-4),133.0(C-2,C-6),123.0(C-1),116.0(C-3,C-5)。综合分析化合物的氢谱和碳谱数据，并与文献26的数据进行对比，确定化合物为p-hydroxybenzoic acid。化合物：白色固体，负源HRESIMS测得其准分子离子峰质荷比m/z=575.432 7 M-H-，推出分子 式 为 C35H60O6（C35H59O6理 论 相 对 分 子 质 量 为575.431 2）。1H NMR 数据（400 MHz，DMSO-d6）H分别为5.37(s,H-1),5.32(s,H-6),4.86(dd,J=8.2,3.6 Hz,OH-2 OH-4),4.42(t,J=5.8 Hz,OH-6),4.2(t,J=7.2 Hz,H-2),3.64(m,H-3),3.45(m,H-4,H-5),3.10(m,H-6),0.95(s,H3-19),0.89(d,J=6.4 Hz,CH3-21),0.82(t,J=6.7 Hz,CH3-29),0.81(d,31第43卷广东海洋大学学报J=7.1 Hz,CH3-26),0.78(d,J=7.1 Hz,CH3-27),0.64(s,CH3-18)。13C NMR 数据(100 MHz,DMSO-d6)C分别为 140.4(C-5),121.2(C-6),100.8(C-1),76.9(C-3),76.8(C-5),76.8(C-3),73.5(C-2),70.1(C-4),61.1(C-6),56.2(C-14),55.4(C-17),49.6(C-9),45.2(C-24),41.9(C-13),38.3(C-4),36.8(C-1),36.2(C-10),35.5(C-20),33.3(C-22),31.4(C-7,C-8),29.3(C-2),28.7(C-25),27.8(C-16),25.5(C-23),23.9(C-15),22.6(C-28),20.6(C-11),19.7(C-27),19.1(C-26),18.9(C-19),18.6(C-21),11.8(C-29),11.7(C-18)。综合分析化合物的氢谱和碳谱数据，并与文献27的数据进行对比，确定化合物为daucosterol。化合物 为生物碱类化合物，化合物、为异香豆素类化合物，化合物 为苯类衍生物，化合物为甾体类化合物，其中化合物和化合物均是首次从该菌中分离得到。2.2 化合物的体外生物活性评价对化合物 进行体外免疫抑制活性评价，其结果如图2。化合物 处理后小鼠脾细胞存活率分别为64.24%、68.48%、41.52%、13.77%、10.22%、71.00%、31.51%、68.78%和 32.10%，化合物、和对小鼠脾细胞具有相对较低的毒性（阳性对照药Cyclospo