动物疫病防控技能操作规范.doc

动物疫病防控技能操作规范

一、采血
（一）鸡翅静脉采血
操作步骤：
（1）侧卧保定，展开翅膀，露出腋窝部，拔掉羽毛，在翅下静脉处消毒。先用碘酊（即2%碘酒），再用75%酒精脱碘，采用点状螺旋式消毒。
（2）拇指压迫近心端，待血管怒张后，用装有细针头的注射器，平行刺入静脉，放松对近心端的按压，缓缓抽取血液，采血量不少于2ml。
（3）采血完毕及时用干棉球压迫采血处止血，避免形成淤血块。
（二）鸡心脏采血
操作步骤：
（1）雏鸡心脏采血：选定采血部位先用碘酊（即2%碘酒），再用75%酒精脱碘，以点状螺旋式消毒；左手抓鸡，右手手持采血针，平行颈椎从胸腔前口插入，回抽见有回血时，即把针芯向外拉使血液流入采血针，采血量不少于2ml，拔出针头后用干棉球压迫止血。
（2）成年禽类心脏采血：成年禽类采血可取侧卧或仰卧保定。
侧卧保定采血：助手抓住禽两翅及两腿，右侧卧保定，在触及心搏动明显处，或胸骨脊前端至背部下凹处连线的1/2处消毒（先用2%碘酒，再用75%酒精脱碘，以点状螺旋式消毒），垂直或稍向前方刺入2～3厘米，回抽见有回血时，即把针芯向外拉使血液流入采血针，采血量不少于2ml，拔出针头后用干棉球压迫止血。
仰卧保定采血：胸骨朝上，用手指压离嗉囊，露出胸前口，消毒术部（先用2%碘酒，再用75%酒精脱碘，以点状螺旋式消毒），用装有长针头的注射器，将针头沿其锁骨俯角刺入，顺着体中线方向水平穿行，直到刺入心脏，采血量不少于2ml，拔出针头后用干棉球压迫止血。
注意事项：
（1）确定心脏部位，切忌将针头刺入肺脏。
（2）顺着心脏的跳动频率抽取血液，切忌抽血过快。
（三）猪耳静脉采血
操作步骤：
（1）将猪站立或横卧保定，或用保定器具保定。
（2）耳静脉局部消毒（先用2%碘酒，再用75%酒精脱碘，以点状螺旋式消毒）。
（3）用手指捏压耳根部静脉血管处，使静脉充盈、怒张(或用酒精棉反复局部涂擦以引起其充血)
（4）术者用左手把持耳朵，将其托平并使采血部位稍高
（5）右手持连接针头的采血器，沿静脉管使针头与皮肤呈30°～45°角，刺入皮肤及血管内，轻轻回抽针芯，如有回血即证明已刺入血管，再将针管放平并沿血管稍向前伸入，抽取血液不少于1ml，拔出针头后用干棉球压迫止血。
（四）猪前腔静脉采血
操作步骤：
（1）仰卧保定，把前肢向后方拉直；
（2）选取胸骨端与耳基部的连线上胸骨端旁2cm的凹陷处，消毒（先用2%碘酒，再用75%酒精脱碘，以点状螺旋式消毒）；
（3）用装有20号针头的注射器刺入消毒部位，针刺方向为向后内方与地面呈60°角刺入2～3cm，当进入约2cm时可一边刺入一边回抽针管内芯；刺入血管时即可见血进入管内，采血量不少于５ml，拔出针头后用干棉球压迫止血。
（五）牛颈静脉采血
操作步骤：
（1）保定好动物，使其头部稍前伸并稍偏向对侧；
（2）对颈静脉局部进行剪毛、消毒（先用2%碘酒，再用75%酒精脱碘，以点状螺旋式消毒）；
（3）看清颈静脉后，采血者用左手拇指(或食指与中指)在采血部位稍下方(近心端)压迫静脉血管，使之充盈、怒张；
（4）右手持采血针头，沿颈静脉沟与皮肤呈45°角，迅速刺入皮肤及血管内，如见回血，即证明已刺入；使针头后端靠近皮肤，以减小其间的角度，近似平行地将针头再伸入血管内1～2厘米；
（5）放开压迫脉管的左手，收集血液５ml。采完后，以干棉球压迫局部并拔出针头，再以5％碘酊进行局部消毒。
（六）牛尾静脉采血
操作步骤：
1、采血者左手抓住牛尾巴往上翘，手离尾根部约30厘米。
2在离尾根10厘米左右中点凹陷处，先消毒（先用2%碘酒，再用75%酒精脱碘，以点状螺旋式消毒），然后用注射器针头垂直刺入（约1厘米深。）
3针头触及尾骨后再退出1毫米进行抽血。
4采血量不少于５ml，拔出针头后用干棉球压迫止血。
    注意事项：
牛尾静脉与牛尾中动脉的解剖部位在牛尾腹侧中线处并行，浅部位的为尾静脉，深部的为尾中动脉。进行牛尾采血的具体部位为离尾根10厘米左右，第4、5尾椎骨交界中点凹陷处，静脉血颜色暗、量少，动脉血颜色鲜红、量多。
二、鸡体解剖与采样
操作步骤及顺序如下：
1、将鸡不放血致死；
2、将处死鸡浸于消毒水中使羽毛浸湿，洗去尘垢、污物；
3、先将腹壁和大腿内侧的皮肤切开，用力将大腿按下，使髋关节脱臼，将两大腿向外展开，从而固定尸体；
4、再于胸骨末端后方将皮肤横切，与两侧大腿的竖切口连接，然后将胸骨末端后方的皮肤拉起，向前用力剥离到头部，使整个胸腹及颈部的皮下组织和肌肉充分暴露；
5、然后在胸骨后腹部横切穿透腹壁，从腹壁两侧沿肋骨头关节处向前方剪断肋骨和胸肌，然后握住胸骨用力向上向前翻拉，去掉胸骨露出体腔；
6、对剪刀和镊子消毒；
7、采集肺脏；
8、对剪刀和镊子消毒；
9、采集；肝脏
10、对剪刀和镊子消毒；
11、采集；脾脏
12、对剪刀和镊子消毒；
13、采集肾脏；
14、从口腔下剪，剪开颈部皮肤肌肉，使喉头暴露；
15、对剪刀和镊子消毒；
16、采集喉头、气管；
17、剪开头部皮肤，打开头骨；
18、对剪刀和镊子消毒；
19、采集脑。
注意：采集样品时剪刀和镊子的消毒采用火焰消毒法。
三、牛羊Ｏ-P液采集
牛羊Ｏ-P液指牛羊食道-咽部分泌物，被检动物在采样前禁食（可饮少量水）12h，以免胃内容物返流污染Ｏ-P液。
操作步骤
1、采样探杯在使用前经0.2%柠檬酸或1%～2%氢氧化钠溶液浸泡5分钟，再用与动物体温一致的清水冲洗后使用。
２、采样时动物应站立保定，将探杯随吞咽动作送入食道上部10～15cm处（食道和咽部的结合处），轻轻来回抽动2～3次，然后将探杯拉出。
３、取出5～8mlＯ-P液倒入含有等量细胞培养液（0.5%水解乳蛋白-Earle液）或磷酸缓冲液（0.04%摩/升、PH7.4）的灭菌广口瓶中，充分摇匀加盖封口。
４、采完一头动物，探杯要按步骤２重新进行消毒并充分冲洗。
５、采集的样品放冷藏箱及时送检，未能及时送检应置-30℃冷冻保存。
四、血凝试验
利用血凝试验验证64单位抗原。
（一）操作步骤：
1、在96孔V型微量反应板的1-8排的1-10孔均加入25微升生理盐水稀释液，换Tip头（其中第10孔设为空白对照）；
2、吸取25微升已配制好的64单位抗原加入每排的第一孔中，混匀；
3、从第1孔中吸取25微升混合液加入第2孔，混匀后吸取25微升加入第3孔，如此倍比稀释至第9孔，从第9孔吸出25微升弃去，换Tip头；
4、每孔再加入25微升生理盐水，换Tip头；
5、每孔均加入25微升体积分数为1%鸡红细胞悬液（已配制好的），将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入；
6、振荡混匀，在室温（20-25℃）下静置40分钟后观察结果。
（二）结果判定（竞赛时由评委统一判定）：
将微量反应板倾斜，观察红细胞有无成泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原最高稀释倍数代表一个血凝单位。
对照孔（第10孔）红细胞呈明显的纽扣状沉到孔底（即不凝集）则试验成立；如果64单位抗原配制正确并且血凝试验操作正确，那么应该在每排的前6孔（64=26）出现完全凝集而第7、8、9孔则不出现凝集。
7排（含7排）以上结果正确为合格。
五、ELISA试验
依据标准为《猪伪狂犬病免疫酶试验方法》NY/T678-2003，采用IDEXX生产的猪伪狂犬病毒gpⅠELISA抗体检测试剂盒。
（一）样品稀释
用样品稀释液将被检验样品、阳性和阴性对照稀释2倍（例如：60μL样品稀释液中加60μL待检血清）。
（二）操作步骤
使用前所有试剂应恢复至室温。试剂应轻轻旋转或震荡予以混合。
1、取出抗原包被板，并将样品位置准确记录在记录表上。
2、向A1、B1和C1孔中分别加入100μL稀释好的阴性对照，D1、E1孔中分别加入100μL稀释好的阳性对照，在其余的孔内加入100 μL已稀释好的被检血清。
3、室温下孵育1小时或2～7℃孵育过夜（可以将微量反应板用封条封闭）。
4、在洗板机上用配制好的洗涤液洗涤板孔，重复3～5次。注意应避免包被板孔干燥。
5、每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记抗PRVgpI抗体。室温下孵育20分钟。
6、重复步骤4。
7、每孔加入100μLTMB底物液，室温下孵育15分钟。
8、每孔加入50μL终止液，使反应终止。立即用酶标仪于650nm测定各孔吸光度（OD）值。
（三）结果判定
1、阴性对照OD值的平均值减去阳性对照OD值的平均值必须大于或等于0.3，试验方能有效。如果试验无效，应重做。
2、待检样品是否含有针对gE抗原的抗体取决于每个样品的S/N值，S/N等于样品OD值除以阴性对照OD均值。
3、如果样品的S/N值小于或等于0.60，样品应判定为PRVgpI抗体阳性。
4、如果S/N值大于0.60但小于或等于0.70，样品应重测。如果试验结果不变，三周后应重新采样检测。
5、如果S/N值大于0.70，样品应判定为PRVgpI抗体阴性。
（四）注意事项
1、所有试剂应在2～7℃储存，使用前恢复到室温，使用后放回2～7℃。
2、不要使用超过有效期限的试剂，不同批次试剂盒的成分不得混用，使用试剂时应防止试剂污染。
3、TMB底物和终止液对皮肤有刺激性。
4、TMB不要暴露于强光和任何氧化剂，使用洁净的玻璃或塑料容器盛装TMB底物液。
5、包被板拆封后避免受潮或沾水（未用的包被板放于加干燥剂自封袋中，应尽快置于4℃）。
6、在操作过程中移液时，切忌将气泡加入检测板孔中。
7、所有的废弃液应在丢弃前合理处理以免污染环境。
六、细菌镜检
操作步骤：
1、打开显微镜电源开关；
2、把镜筒上升约1.5厘米，再把油镜转到工作位置；
3、在细菌涂片上所要观察的位置滴一小滴香柏油，放入载物台上并将标本移到适当位置；
4、细心拧动粗调焦螺旋，使镜筒慢慢下降。这时要仔细观察物镜前端与标本之间的距离，先使物镜前端与油滴接触，然后再慢慢下降镜筒，至物镜前端接近而没有碰到玻片为止。这步操作要特别小心，防止油镜压碎标本或损坏油镜。
5、眼睛看目镜中，拧动细调焦螺旋，使镜筒慢慢上升到能看清标本。这步操作要特别注意不要把细调焦螺旋的方向拧错，以防压碎标本。
6、观察并记录结果。
7、观察后，提升镜筒约1厘米，更换标本片；
8、观察完毕后，提升镜筒约1厘米，取下标本片，把油镜转离光轴，关闭电源，及时做清洁工作。先用干的擦镜纸擦一、二次，把大部分油去掉，再用二甲苯滴湿的擦镜纸擦两次，最后再用干擦镜纸擦一次。擦拭时要顺镜头的直径方向，不要沿镜头的圆周擦。擦拭要细心，动作要轻，不可用力擦。