微生物的遗传变异_百替生物.pdf

笫六章微生物的遗传变异(2.0 学时)内容提要内容提要 细菌遗传变异的物质基础主要是基因组。质粒作为自我复制单位，控制细菌的某些次要性状，如抗性等，质粒可以转移、也可以丢失的特点得到高度重视。转座因子因具有可移动性，成为研究细菌遗传变异的有用工具。毒力岛是从基因水平认识细菌毒力因子的新概念。基因突变是细菌最重要的变异，可用化学或物理的方法人为造成。转化、转导、接合是细菌个体间交换遗传物的天然方式，对细菌的变异具有重要意义，还可以采用原生质体融合及转染等人工方法达到相似的目的。掌握细菌遗传变异的规律，有利于动物传染病的诊断和预防，并可推动基因工程技术的进步。细菌与其他生物一样，通过遗传（heredity）与变异（variation）生存与发展。所谓细菌的遗传，系指亲代细菌与子代细菌的相似性，它使细菌的性状保持相对稳定，是各种细菌存在的根据。所谓细菌的变异，指亲代与子代以及子代细菌之间的不相似性，细菌得以发展进化。第一节细菌遗传的物质基础一、基因组（genome）细菌的基因组位于核体，是遗传的主要物质基础。核体又称染色体（chromosome）是由环状双螺旋两条 DNA 长链组成，含细菌的遗传基因，控制细菌的遗传与变异。每条DNA 单链的骨架由磷酸和脱氧核糖组成，支链含有四种碱基，即两种嘌呤：腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G），两种嘧啶：胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。细菌染色体 DNA 以半保留方式进行复制。新形成的 DNA 双链分子与亲代的完全相同，所携带的遗传信息也与亲代的完全相同。倘若在 DNA 复制中，子代 DNA 发生改变，便会出现变异。二、质粒（plasmid）质粒是细菌染色体外的遗传物质，多为环状双螺旋 DNA 分子，可为一种或若干种。质粒可以自身复制，随宿主菌分裂传到子代菌体。质粒是自行复制单位，有多个拷贝者，称为松弛型复制；有的需随染色体一起复制，仅一个拷贝者，称为严紧型复制（stringentreplication）。前者称为松弛型质粒，后者称为严紧型质粒。质粒可编码细菌多种重要的生物学性状，但不为细菌生命所必需的性状。在一定条件下，质粒可以转移，可丢失，也可重新获得。编码性菌毛的质粒称致育质粒致育质粒致育质粒致育质粒或 F F F F 质粒质粒质粒质粒（fertilityplasmid），具有 F 质粒的细菌有性菌毛，为雄性细菌；无 F 质粒的细菌无性菌毛，为雌性细菌，该质粒与细菌的有性结合有关。编码细菌各种毒力因子的质粒统称毒力质粒毒力质粒毒力质粒毒力质粒或ViViViVi 质粒质粒质粒质粒（virulence plasmid），如致病性大肠杆菌在粘膜上定居及产生毒素的能力可由不同质粒编码，其中 K 质粒编码对粘膜具有粘附活性的菌毛，ST 质粒与 LT 质粒分别编码耐热肠毒素和不耐热肠毒素。细菌对抗菌药物或重金属盐类的抗性则由 R R R R 质粒质粒（resistanceplasmid）所决定。一个质粒可同时具有几种编码功能。质粒可以在细菌间转移，当质粒从一个细菌转移至另一个细菌时，携带的性状也随之转移。质粒的转移不仅可以发生在同种、同属的细菌之间，有的甚至还可以在不同种属的细菌间进行。按其转移的特性可将质粒分为二类：接合性质粒接合性质粒接合性质粒接合性质粒（conjugative plasmid）与非接合性质粒非接合性质粒非接合性质粒非接合性质粒（nonconjugative plasmid）。接合性质粒一般使细菌有致育性，并且在细菌之间接触时能从一个细菌转移到另一个细菌中去（如 F 质粒）。非接合性质粒不能在细菌之间转移，但有的可以通过以噬菌体为载体或直接进入另一个细菌而转移。非接合性质粒也可以与接合性质粒结合随接合性质粒转移。有的质粒还可以结合到染色体上，如 F 质粒在变形杆菌内是独立存在的，但在大肠杆菌内则可与染色体结合，这种质粒称为附加体附加体附加体附加体（episome）。穿梭载体穿梭载体穿梭载体穿梭载体（shuttleshuttleshuttleshuttle vectorvectorvectorvector）是一类特殊的质粒，可在某种属关系差异较大的微生物中转移，例如在大肠杆菌与酵母之间。利用它可携带质核或真核微生物的外源序列。三、转座因子（transposable element）近年来发现微生物的某些 DNA 片段作为一个独立单位可在染色体上移动，此种移动甚至可发生在不同种细胞之间。这种可移动的 DNA 片段称之为转座因子。细菌的转座因子有三种类型：插入序列插入序列插入序列插入序列（insertion sequence,IS）、转座子转座子转座子转座子（transposon,Tn）以及某些特殊的噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体，例如 Mu，是促变噬菌体（mutator phage）的简称。IS 与 Tn 具有两个共同特点，一是都携带编码转座酶（transposase）的基因，二是在其 DNA 末端都有短的倒置末端重复子。重复子长约 401000 bp。IS 分子量较小（kb），Tn 比 IS 大（22.5 kb），除转座酶基因外，还含某些具有重要特性例如抗性标记的基因。Tn 是当今遗传学及基因工程研究的有用工具。Mu 分子量约 22.5 kb，与一般温和噬菌体不同，它可整合到大肠杆菌染色体的任何位置，从而引起插入突变。四、毒力岛（pathogenicity island,PAI）是 20 世纪 90 年代提出的一个新概念。PAI 是指病原菌的某个或某些毒力基因群，分子结构与功能有别于细菌染色体，但位于细菌染色体之内，因此称之为“岛”。PAI 虽然是染色体的 DNA 片段，但两端往往具有重复序列与插入元件，其 G+Cmol%及密码使用与细菌染色体有明显差异，分子量较大，多为 3040 kb，也有达 100 kb 者。一般认为，PAI 不位于质粒或附加体，基因编码的产物多为分泌性蛋白或细胞表面蛋白。一种病原菌可以有一个以上的毒力岛。毒力岛的生物学意义尚不清楚，推测其与细菌的毒力变异有关。鉴于毒力岛的结构特点，决定了它可在细菌的不同菌株甚至不同菌种之间进行 DNA 重组。有人指出，在环境中存在着致病菌株与非致病菌株，后者通过基因重组从前者获得了毒力岛，从而具备了致病性，而不是通过自身固有基因的修饰导致的毒力变异。目前一些新致病菌的出现有可能归咎于此。笫二节基因突变基因突变（gene mutation）简称突变，是变异的一种，指生物细胞遗传物质 DNA 分子结构突然发生了稳定的可遗传的变化。它是生物进化的一个重要因素。一、细菌变异的类型细菌的变异可分为非遗传性变异和遗传性变异。前者基因无改变，只是为了适应外界环境的不适而发生的暂时性性状改变，细菌的菌落形态变异多属于此；后者基因发生改变，引起相应性状的稳定可遗传的变化，因基因突变和基因重组所致。细菌的基因突变按发生改变的范围大小，分为染色体畸变染色体畸变染色体畸变染色体畸变（chromosomal aberration）和点突变点突变点突变点突变（point mutation）。染色体畸变是指染色体的一大段发生了变化，它包括染色体结构上的缺失（delection）、重复（duplication）、插入(insertion)、易位（translocation）、和倒置（inversion）。点突变是相应基因上的 DNA 链中一个或少数几个核苷酸对的改变，包括核苷酸对的置换（replacement），进一步可分为转换（transition）与颠换（transversion）和因缺失或插入而造成的移码（frame shift）。细菌的突变也可分为自发突变自发突变自发突变自发突变（spontaneous mutation）和人工诱变人工诱变人工诱变人工诱变（induced mutation）。自发突变是在未经人工改变的外界条件下，自然发生的突变，它经常发生，但发生的机率（突变率）很低，通常仅约 106109。人工诱变是在应用诱变因素的影响下而发生的突变，其突变率常高于自然突变。二、细菌变异的常见表型细菌基因突变而表现的变异类型很多，常见有以下几种。（一）菌落形态变异细菌的菌落可大致分为两种类型，即菌落表面光滑、湿润，边缘整齐的光滑型（smoothtype，S 型）和菌落表面粗糙、枯干，边缘不整齐的粗糙型（rough type，R 型）。在一定条件下，光滑型菌落可变为粗糙型，称为 SR 变异。SR 变异，经常伴随着 S 型抗原的丧失和病原菌毒力由强变弱等性状的改变（表 6-1）。表表 6-16-16-16-1光滑型与粗糙型菌落的性状改变光滑型与粗糙型菌落的性状改变性状光滑型（S 型）粗糙型（R 型）菌落性状光滑、湿润、边缘整齐粗糙、枯干、边缘不整齐菌体形态正常、一致可异常而不一致表面抗原具有特异性表面多糖抗原特异性表面多糖抗原毒力强弱或完全丧失对噬菌体的敏感性敏感不敏感生化反应性强弱在生理盐水或 0.2%的台盼蓝中的悬浮均匀混悬自家凝集肉汤中的培养特性均匀混浊颗粒状生长，易于沉淀对正常血清杀菌作用的敏感性不敏感敏感对吞噬作用的抵抗力较强较弱荚膜细菌的荚膜形成可形成不形成（二）抗原变异由于细菌基因突变而引起其抗原结构发生改变的变异类型。当编码细菌的抗原结构包括菌体抗原、鞭毛抗原、荚膜抗原等的基因发生突变时，细菌形成相应抗原结构的能力丧失，引起细菌抗原性变异。如常见的细菌细胞壁缺陷变异（细菌L 型等）、荚膜变异或鞭毛变异等。（三）抗性变异是对某种化学药物或致死物理因子抗性的变异。通过自发突变以及抗性遗传因子的传递，而产生大多数抗性。它和化学药物的存在并无关系，细菌获得抗性以后，即使在没有药物的条件下生长繁殖数代，一般也不丧失抗性。但细菌对于青霉素、氯霉素、四环素、红霉素等抗生素可出现由于诱导而产生的耐药性，它并非起源于遗传因子的改变，而类似于诱导酶的产生，系基因所携带的遗传信息在表达过程中发生的诱导现象，例如培养枯草杆菌或蜡样芽胞杆菌于含少量青霉素 G 的培养基中时，可诱导这些细菌产生青霉素酶以破坏青霉素。（四）营养型变异营养缺陷型变异是细菌丧失合成一种或几种生长因子的能力，无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。如变异株丧失对某种糖类、维生素、氨基酸或其它生长因子的合成能力，在补充这些营养物质的培养基上才能生长。这种突变对研究细菌代谢产物的生物合成途径很有用处。此外，营养型变异菌株可作为杂交、转化、转导和原生质体融合等研究中的标记菌种。三、诱发细菌变异的方法诱发突变是应用人工方法使细菌增殖和复制 DNA 时出现“错误”，从而育成人类需要的细菌变异品系。许多物理和化学因素可作为细菌的诱变剂，提高细菌的突变率。如下介绍常用的诱变方法及其致突变的机制。（一）物理方法包括温度及各种射线，如紫外线、激光等非电离辐射和射线、射线、射线、快中子等电离辐射。1.温度：温度诱发基因突变的机制似乎是专一对 GC 碱基对的作用。包括使 C 脱氨基转换为尿嘧啶（U），在复制中造成 GCAT 转换；以及引起 G-脱氧核糖键的移动，从而在 DNA 复制过程中出现包括两个 G 的碱基对，在再一次复制中造成 GCCG 颠换。2.辐射：辐射的诱变作用一般认为有直接作用和间接作用两个方面。前者是指辐射直接作用于染色体，包括引起 DNA 骨架断裂所造成的染色体畸变，和使 DNA 分子上相邻的 T 形成二聚体而引起的复制差错。间接作用是使染色体以外的细胞物质发生变化，再由这些物质作用于染色体引起突变；它包括碱基类似物的形成及其突变诱发作用，和电离辐射引起过氧化氢和游离基的产生以及它们对突变的诱发。（二）化学方法常用的化学诱变剂有碱基类似物（如 5 溴脱氧尿苷（UBr）、5 氟脱氧尿苷、2 氨基嘌呤、8 氮鸟嘌呤）、亚硝酸、羟胺、烷化剂（丙酸内酯和芥子气等）、亚硝基胍、吖啶类染料（吖啶黄、吖啶橙、原黄素等）、烷化剂和吖啶类结合的化合物（名为 ICR191，是美国某癌症研究所的制品）、溴化乙锭等。它们的作用机制复杂而各有差异，总的说来主要有以下几方面。1.取代 DNA 中的碱基，从而使 DNA 的某些碱基对发生置换。例如 UBr是 T 的结构类似物，通常以酮式出现，能代替 T 与 A 形成氢键而配对；在较少的情况下，也能以烯醇式出现，此烯醇式可与鸟嘌呤（G）形成氢键。因此，当它代替 T 与 A 配对掺入 DNA时，在以后的 DNA 复制中就可能引起 AT 对被 GC 对置换的突变发生（图 6-1 a）；当它首先是代替 C 与 G 配对参入 DNA 时，则在 DNA 复制中就可能出现 GC 对被 AT 对的置换（图 6-1 b）。ATGCaAUBrbGUBrAT+GUBrGC+AUBrAT+ATGC+AUBrGC+GCAT+AUBr图 6-15 溴尿嘧啶的诱变机制2.使碱基发生化学变构，从而引起 DNA 的某些碱基对发生置换。例如亚硝酸对碱基有氧化脱氨基作用，可以使 C 成为 U 与 A 配对，或 A 成为次黄嘌呤（H）与 C 配对，从而引起 DNA 的某些碱基对发生置换突变。3.插入 DNA 相邻的碱基之间，引起移码突变。在邻近的两个嘌呤碱基之间插入吖啶染料分子，可引起 DNA 复制时碱基增添或缺失的错误，造成密码子的移码，出现基因突变。4.引起 DNA 分子断裂而诱发染色体畸变。例如许多烷化剂（氮芥、硫芥、环氧乙烷等）除能诱发点突变以外，还能诱发染色体畸变。其作用机制据认为是使 DNA 分子上的碱基被烷化以后，能够被核酸内切酶所断裂。亚硝酸也是一种很有效的诱发缺失的诱变剂。（三）生物学方法利用各种生物学的方法可诱使微生物发生变异，使细菌发生毒力等性状的改变，获得性能良好的菌株。1增强毒力：连续通过易感动物，可使病原菌毒力增强。有的细菌与其他微生物共生，或被温和噬菌体感染，也可增强毒力。例如产气荚膜梭菌与八叠球菌共生时毒力增强；肉毒梭菌当被温和噬菌体感染时，方产生毒素。2减弱毒力：病原菌毒力自发减弱的现象，常见于传染病流行末期所分得的病原菌株。人工减弱病原微生物的毒力通常使用病原菌通过非易感动物、鸡胚等方法。如将禽霍乱强毒菌株通过豚鼠 190 代后，再经鸡胚传 40 代，育成禽霍乱弱毒菌株。无论自然变异弱毒株或人工培育的变异弱毒株，均由于 DNA 上核苷酸碱基顺序的改变的结果。第三节基因的转移与重组在某种情况下，两个不同性状细菌的基因可以发生部分转移，经过基因间的重组(recombination)，形成新的遗传型个体。接受基因的细菌为受体菌，提供基因的细菌为供体菌。细菌的基因转移和重组的主要形式有转化、转导、接合、原生质体融合和转染。（一）转化(transformation)供体菌游离的 DNA 片段直接进入受体菌，使受体菌获得新的性状，称为转化。转化的发生过程，首先是供体的 DNA 片段吸附于受体细菌的细胞膜上。这种吸附起先是可逆的，后来则不可逆，细胞膜上的双链 DNA 分解成单链，与一种特异的蛋白结合，穿入受体菌细胞内，与其 DNA 发生整合，取代一部分原来的 DNA，受体菌由于获得外源的 DNA而改变了遗传性状（图 6-2）。20 世纪 20 年代发现的肺炎链球菌的转化是经典范例转化现象不是所有细菌都有转化现象。大多数细菌不能接受外源性 DNA，不能将它整合到染色体之中；另外，细菌还能产生内切酶，能识别并破坏进入细胞的外源性 DNA。是否发生转化与菌株在进化过程中的亲缘关系有着密切的联系。同时受体菌必须处于感受态（competence）才能转化。（二）转导（transduction）以温和噬菌体为媒介，把供体菌的 DNA 小片段携带到受体菌中，通过交换与整合，使受体菌获得图 6-2 革兰氏阳性菌转化模式图 a.转化的 DNA 被细菌胞壁的 DNA 结合蛋白结合。b.转化的双股 DNA 中一股由于核酸酶的作用降解，另一股与结合蛋白结合，进入细胞细菌胞内。c.进入细胞的一股 DNA 被 ReA 蛋白（一种与细菌 DNA 重组有关的蛋白结合，并由它介导与细菌染色体同源 DNA 重组。d.转化的细菌。ReA 蛋白 感受态特异的单股 DNA 结合蛋白 游离的核苷酸 核酸酶 细菌染色体 DNA 结合蛋白 转化的 DNA（a）（b）（c）（d）供体菌的部分遗传性状，称为转导。获得新遗传性状的受体菌细胞，称为转导子（transductant）。细菌的转导又分普遍性转导普遍性转导和局限性转导局限性转导，普遍性转导与温和噬菌体的裂解期有关，局限性转导则与温和噬菌体的溶原期有关。1.普遍性转导（generaltransduction）：温和噬菌体在裂解期的后期，其 DNA 已大量复制，与外壳蛋白装备新的噬菌体时，大约 105107分子之一的新噬菌体装配错误，将细菌 DNA 的裂解片段装入噬菌体外壳蛋白中，成为一个完全缺陷的转导性噬菌体转导性噬菌体（transducing phage）。误被装入的DNA 片段可以是供体菌染色体上的任何部分，也可以是质粒 DNA。由这种噬菌体介导的转导，称为普遍性转导（图 6-3）。当转导噬菌体侵入另一受体菌时，可将错装的供体菌DNA 片段带入受体菌，出现两种结果，一种是供体菌 DNA 片段与受体菌的染色体 DNA整合，使后者成为遗传性状稳定的转导子，称完全转导完全转导（complete transduction）；另一种情况是，有一些供体菌的 DNA 片段不能与受体菌染色体整合，仍保持游离状态，不自身复制，但能转录、翻译和表达性状，称为顿挫转导顿挫转导（abortive transduction）。2.局限性转导（restricted transduction）：由噬菌体所介导的供体菌染色体上个别特定基因的转导，称为局限性转导。例如噬菌体进入大肠杆菌，当处于溶源期时，噬菌体DNA 整合在大肠杆菌染色体的特定部位，即在半乳糖苷酶基因（gal）与生物素基因（bio）之间，细菌受紫外线照射或化学因素作用后，噬菌体从溶原期进入裂解期，其 DNA 又从细菌染色体上分离，分离时会有 106的噬菌体将其本身 DNA 上的一段留在细菌染色体上，却带走了细菌 DNA 上两侧的 gal 或 bio 基因，这种发生偏差的噬菌体，称为部分缺部分缺陷噬菌体陷噬菌体，当此噬菌体再次侵入受体菌时，可带入原来供体菌的特定基因 gal 或 bio（图6-4）。图 6-3 普遍性转导模式图 流产转导 完全转导 整合 未整合 噬菌体 DNA 细菌 DNA 细菌被裂解 细菌被普遍性转必噬菌体感染 细菌被普遍性转导噬菌体感染图6-4 局部性转导模式图 应当注意转导与溶源转换溶源转换（lysogenic conversion）两者的差别。后者是指温和噬菌体感染其寄主后，噬菌体基因整合于寄主基因组中，寄主的性状发生变异，它是一种表面上与转导相似但本质上却不同的特殊现象。当噬菌体在寄主中消失时，通过噬菌体转换而获得的性状也同时丧失。（三）接合（conjugation）是两个完整的细菌细胞通过性菌毛直接接触，由供体菌将质粒 DNA 转移给受体菌的过程。接合性质粒有 F 质粒、R 质粒、Col 质粒等。1.F 质粒的接合：F 质粒通过性菌毛由雄性菌（F+）转移给雌性菌（F）的过程，称为F 质粒的接合。在受体菌获得 F质粒时，供体菌并不失去 F 质粒。受体菌在获得 F 质粒后即变为 F+菌，也长出性菌毛（图6-5）。大肠杆菌的 F 质粒进入 F菌后，能单独存在，自行复制。但有小部分 F 质粒可整合到受体菌的染色体上，与染色体一起复制。整合后的细菌能以高效率转移染色体上的基因，称为高频重组菌(high frequency recombinant，Hfr)。Hfr 不稳定，F 质粒可从染色体上脱离下来变为 F+菌，终止其 Hfr 状态。从染色体上脱离下的 F 质粒有时可带有染色体上几个邻近的基因，这种质粒称为 F质粒。当 F质粒转入 F菌时，F菌可同时获得这一部分新的基因而成为 F菌。所以 F质粒有类似转导中的温和噬菌体，起着基因载体的作用。这种通过 F质粒转移基因称为性导性导（sexduction）。F+、Hfr、F三种菌都有性菌毛，均为雄性菌。2.R 质粒的接合：细菌耐药性的产生主要是由于 R 质粒在菌株间的迅速转移和快速生长繁殖所致。R质粒有两种功能不同的部分组成，一是耐药性转移因子（resistance transferfactor，RTF），其作用类似 F 因子；另一种是耐药性因子（RF），它决定耐药性。RTF图 6-5 接合时 F 因子的转移与复制 F+F-F-F-F+F+和 RF 均能自主复制，但是只有两者一起存在时，这个细菌才能将耐药性转移给另一个细菌。R 质粒的接合方式类似 F 因子的转移方式，先由 RTF 控制，耐药菌（R+）长出 R 菌毛，和敏感菌（R-）相接触，RF 即由 R+菌转移至 R-菌内。当 RF 与 F 因子一起共存于某个细菌细胞时，有些 RF 可以阻止 F 因子的转移，称为 fi+（fertility inhibition）因子；而另一些不阻止 F 因子转移的 RF，称为 fi-R 因子。3.Col 质粒的接合：Col 质粒控制细菌素的合成，这类质粒很多，有的可以产生性菌毛，在细菌间进行接合转移，称为转移性质粒转移性质粒；有的不能进行在细菌间接合转移，称为非非转移性质粒转移性质粒；但当细菌细胞同时具有可转移的质粒如 F 因子时，则两者可同时发生接合转移。（四）原生质体融合（protoplast fusion）通过人为的方法，使遗传性状不同的两细菌细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组，以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子(fusant)的过程，称为原生质体融合。原生质体融合技术是继转化、转导和接合之后一种更加有效的转移遗传物质的手段。当前，有关原生质体融合在育种工作中的研究甚多，成绩显著，除不同菌株间或种间进行融合外，还能做到属间、科间甚至更远缘的微生物细胞间的融合。（五）转染（transfection）受体菌获得从噬菌体而非从其它供体菌提取的 DNA 的过程，称为转染。另外，转染一词更广泛地用于真核生物细胞，其含义有差别，指真核细胞通过病毒感染，获得某一片段 DNA 或 RNA 的过程。与原生质体融合一样，转染也是一种人为的手段，通常多用于哺乳动物细胞，往往为了获得重组病毒而设计。笫四节细菌遗传变异研究的实际意义以细菌进行遗传学研究，不仅可揭示细菌本身的许多遗传变异规律，而且推动整个分子遗传学的迅速发展。在微生物学领域内，细菌遗传变异的研究也有助于对其他有关问题的了解和发展，例如帮助了解微生物的起源和进化，微生物结构与功能的关系，原核生物性状的调节控制，以及推动微生物分类学的深入发展。在实践方面，细菌遗传变异的研究在以下若干方面具有重大的实用意义。（一）疾病诊断在临床细菌学检查工作中，要作出正确的诊断，不但要熟悉细菌的典型特性，还要了解细菌的变异规律和变异现象，这对于临床分离菌的鉴定与疾病诊断具有重要意义。（二）疾病预防和治疗由于抗生素的广泛使用，细菌可发生变异而形成对该药物的耐性，或形成必须有该药物才方能生长的赖药性（drug dependence）。所以，在治疗细菌疾病用药时，应选择敏感的抗菌药物，并应防止耐药菌株的扩散。菌苗接种是使机体建立特异性免疫，预防传染性疾病的有效措施，弱毒菌苗株都是病原菌的减毒变异株，有较好的免疫效果。可通过人工致弱的方法获得弱毒疫苗菌株。目前菌苗的研究，进一步应用变异的原理，通过基因工程技术改变决定毒力的基因，获得符合既定目标的变异株，以更有效地制备理想的菌苗。（三）基因工程基因工程是用人工方法将所需要的某一供体生物的目的基因 DNA 片段提取出来，在离体的条件下用适当的工具酶切割，将它与载体(vector)的 DNA 分子连接构建重组载体，再将其导入某一易生长、繁殖的受体细胞中，让外源遗传物质受体细胞中进行正常的复制和表达，从而获得新的产物。基因工程的主要操作步骤有：（1）目的基因分离。（2）目的基因与载体 DNA 的体外重组，形成一个完整的有复制能力的嵌合体（chimaera）。（3）重组载体导入受体细胞，通常用转化的方法，导入能容纳外源载体的受体细菌。（4）复制与表达。重组载体在受体细胞内必须自主复制而获得扩增，以表达目的基因特有的遗传性状或产物，使之成为“工程菌”。如将人胰岛素的人工合成基因组合到大肠杆菌的质粒上，然后再转移至菌体内，生产出胰岛素。近年来，应用微生物的遗传工程获得如脑啡肽、卵清蛋白、干扰素等，极大地改进了这些生物制剂的生产工艺。应用基因工程技术来使细菌表达病毒的抗原成分，用以制备新型诊断试剂或疫苗，或用一种细菌表达出二种细菌的抗原，制备多价菌苗等。第五节病毒的遗传与变异（1.5 学时）随着分子生物学理论和其技术的发展，极大地推动了病毒遗传和进化的研究，丰富了对病毒基因组结构与功能的认识，使病毒遗传学成为病毒学研究的热点之一。一、突变一、突变病毒复制中出现的差错均为突变(mutation)，但大多数突变对病毒是致命的，使之不再具有存活和复制的能力，而极少数能够适应环境选择的突变是非致死性的。一般所说突变系指非致死性的突变，因为致死性突变无遗传与进化意义。病毒的自发性突变的类型有基因组变异与表型变异，后者表现为病毒颗粒的理化特性或复制性质的改变。（一）、基因组变异单个核苷酸的替换为点突变(point mutation)，也可发生单个、小段或大段核苷酸缺失或插入突变。点突变最常见，小片段核苷酸缺失或插入次之，大片段核苷酸的缺失很少发生。突变的核苷酸有可能发生回复突变，也可能因为相同甚至不同基因发生抑制性突变(suppresser mutation)，使突变逆转，重新具有与起始毒株相同的表型。如流感病毒往往由于毫不相关的基因自行发生抑制性突变，使之失去作为弱毒疫苗的价值。缺损型干扰缺损型干扰(defective interfering，DI)突变株突变株是突变的一个特例。大多数病毒均能产生DI 突变株，这些突变株自身不能复制，只能在亲本野生株作为辅助病毒(helper virus)存在时才能复制，并可干扰亲本病毒的复制，使后者数量减少。（二）、表型变异表型变异有不同的方式，可涉及病毒颗粒理化特性和复制性质等的变异。常见表型变异如下：1.空斑变异株(plaque mutants)：是其空斑形态发生不同于野生株空斑形态的变异。2.抗体逃逸变异株(antibody escape mutants)：由于变异株表面蛋白抗原决定簇发生变异，致使对野生株有中和作用的抗体产生抵抗，从而导致持续感染。3.条件致死性突变株(conditional lethal mutants)：此种变异株只能在经选择的特定条件下复制，而在非特定条件下死亡。此突变株常有若干基因变异株，研究最多的是宿主范围突变株(host rang mutants)及温度突变株。温度突变株包括温度敏感(temperature-sensitve)及冷适应(cold-adapted)突变株，经改变培育细胞的温度进行筛选。温度突变常被广泛用于制备弱毒疫苗，如流感病毒疫苗。（三）、突变率突变率系指每个核苷酸在一次复制周期内发生复制错误的频率。DNA 病毒的突变率为 10101011，RNA 病毒的突变率为 103104，两者间突变率的差异可能是 DNA 病毒在核内复制受真核细胞 DNA 复制校正功能的影响所致。密码子的第三个核苷酸的点突变，往往为同义码突变。病毒 RNA 的突变率远高于病毒 DNA，这致使几乎每个子代基因组都与亲本不同，子代基因组之间也至少有一个核苷酸差异。基因组的突变是不均匀的，意味着编码不同蛋白的基因以不同的速率进化。（四）、诱变所谓诱变就是利用理化因素等处理病毒和其核酸以提高其突变率，如紫外线、X-射线、放射性同位素的射线以及亚硝基胍、碱基同类物(5 氟尿嘧啶、5 溴脱氧尿苷)等化学试剂，碱基同类物在核酸复制时可掺入其中，达到诱变的目的。定点诱变定点诱变(site-directed mutagenesis)就是将 DNA 基因组或 RNA 基因组的 cDNA 任何既定部位的核苷酸替换，或者使之缺失，或者插入另一段核苷酸。为达到这一目的，一般用分子杂交技术，即将含有特定位点变异的寡核苷酸通过分子杂交，导入载体 DNA，再转化到载体中扩增杂交 DNA，最后根据设计的分子标记，在一定条件下筛选突变株。定点诱变在病毒学研究中，可用于确定病毒基因的致病作用和研制具有免疫学标记的弱毒疫苗等。在事先不了解特定核苷酸序列作用的情况下，通过对定点诱变产物的分析，推测该序列编码的蛋白质及其功能，这种利用基因序列资料反过来研究动物体内的遗传学效应的手段，称之为反向遗传学(reverse genetics)。二、基因重组二、基因重组两种不同的病毒或同一种病毒的两个不同毒株感染同一细胞时，在其核酸复制中发生基因交换，产生不同于两亲本性状的子代病毒的过程叫基因重组(genetic recombination)，包括分子内重组、重配或复活。（一）、分子内重组(intramolecular recombination)是两种不同、通常密切相关的两种病毒的核苷酸片段的交换，DNA 病毒可发生此现象，RNA 病毒则更普遍。如西部马脑脊髓炎病毒(WEEV)就是早期的类仙台病毒与东部马脑脊髓炎病毒(EEEV)分子内重组的产物。在实验条件下，甚至不同科病毒间也可发生分子内重组，这是目前病毒学研究的热点。在病毒与宿主细胞的基因组之间也会发生分子内重组。如反录病毒基因组内发现有细胞基因，在其前病毒阶段，病毒将细胞的肿瘤基因掺入其基因组，使其变为病毒的肿瘤基因。（二）、重配(reassortment)亲缘关系相近的基因组分节段 RNA 病毒的两毒株感染同一细胞时，二者可交换其基因组片段，产生稳定的或不稳定的重配毒株。在自然界中，流感病毒、蓝舌病毒即以此方式呈现其遗传变异性。（三）、复活(reactivation)又称增殖性复活(multiplicity reactivation)，是指用同一毒株的具不同程度致死性突变的若干病毒颗粒同时感染某一细胞，产生具有感染性病毒的现象。在理论上，用紫外线照射或化学诱变培育的疫苗有可能发生此种复活，因此上述方法不能用于制备病毒疫苗。在有感染性的病毒与灭活的相关病毒或该病毒的 DNA 片段之间，可发生交叉复活(cross-reactivation)、基因组拯救(genome rescue)以及 DNA 片段拯救(DNA fragment rescue)，这些现象在利用病毒作为制备疫苗载体是应予重视。四、病毒基因产物间的相互作用四、病毒基因产物间的相互作用病毒基因的产物蛋白质相互作用也可影响病毒的表型，大多发生在实验室，有的也可发生在自然界。（一）、补偿作用(complementation)在感染细胞中，同一种病毒的两个毒株、两种相关或不相关的病毒之间由于病毒蛋白质的相互作用，拯救了一种或两种病毒或增加了病毒产量，即为补偿作用。一种病毒为另一种病毒提供了其不能合成的基因产物，使后者在二者混合感染的细胞中得以增殖。如缺损病毒与其辅助病毒间的关系。（二）、表型混合(phenotypic mixing)是指两种病毒混合感染细胞后，子代病毒获得二者的表型特性。如流感病毒与副黏病毒共感染(coinfection)时，子代病毒颗粒的囊膜可具有双亲的抗原，但每个病毒颗粒仅含双亲之一的基因组。无囊膜的病毒之间的表型混合可以衣壳转化(transcapsidation)的形式出现，即病毒的衣壳可全部或部分在病毒之间互换，这可改变病毒的嗜性。（三）、多倍性(polypoidy)是病毒成熟过程中，出现数个核衣壳被一个囊膜包裹的现象，可见于副黏病毒。五、遗传变异与病毒进化五、遗传变异与病毒进化病毒之间在形态学及理化特性上的千差万别，是病毒各自在漫长的进化过程中适应环境而发生变异和遗传积累的结果，很难用用一个“进化树”描述所有病毒的亲缘关系。病毒与宿主彼此从对方获得某些功能基因，某些病毒也从其他病毒获得基因，这使病毒基因组具有许多功能的及非功能的“基因化石”。虽然不同科间病毒的基因组互不相同，但某些不相关的病毒之间诱可能有相似的基因次序、结构及复制方式，甚至有编码相似功能蛋白的共同保守序列，据此可以根据病毒的某些基因序列的相似程度绘制病毒的若干套较小的进化树，以比较病毒间进化的系统发生关系，即亲缘关系。这在病毒分类及流行毒株衍生关系研究中具有重要意义。在病毒进化关系研究中，令人感兴趣的是，哪一种病毒最古老？哪一种最现代？哪一种最稳定？哪一种最易变？解决这些问题在于研究进化关系的基因选择。如有人认为病毒颗粒的结构成分是最古老的，也有人认为病毒基因组表达方式是最古老的，可是目前仅发现病毒的酶有共同的保守序列，而未在病毒结构基因上发现，因此尚不足以回答上述进化的有关问题。目前所进行的病毒进化及其衍生关系的研究，仅在具有相同主要功能基因的病毒间或同一种病毒的不同毒株间进行比较，以分析其部分基因的进化和衍生关系，这在流行毒株的抗原变异性研究上具有一定的意义。抗原性转移及漂移抗原性转移及漂移：甲型流感病毒感染禽类、多种哺乳动物及人类，引致人及动物的流行性感冒。自 1933 年首次分离甲型流感病毒以来，现已发现该病毒囊膜上的血凝素(H)纤突有 15 个亚型、神经氨酸酶(N)纤突有 9 个亚型。H 的 15 个亚型在禽类全部存在，人类有 3 个，猪、马、海豹及鲸各有 2 个；N 的 9 个亚型在各种动物有相似的分布。该病毒显著特点是H和N二者的遗传性或抗原性漂移(genetic or antigenic drift)及遗传性或抗原性转移(genetic or antigenic shift)导致的抗原性变异。漂移发生在某一亚型内，其中和表位与未突变株稍有差异，是点突变的积蓄，是量变过程；转移则骤然获得一个全新的 H 或 N基因，从而产生新的亚型，可能在全世界引致新型流感的暴发流行，是质变过程。