多重耐药基因lsa(E)实时荧光定量PCR检测方法的创新.pdf
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1、第 57 卷第 4 期河 南 农 业 大 学 学 报Vol.57No.42023 年8 月Journal of Henan Agricultural UniversityAug.2023收稿日期:2022-11-05基金项目:国家自然科学基金项目(U1704108);河南省高校科技创新团队支持计划项目(18IRTSTHN020);中国博士后科学基金项目(2021M690924)作者简介:张博(1998),男,河南郑州人,硕士研究生,主要从事畜禽源病原菌的耐药与防控研究。通信作者:许春燕(1988),女,河南驻马店人,讲师,博士,硕士生导师。引用:张博,陈峥,李琼,等.多重耐药基因 lsa(E)
2、实时荧光定量 PCR 检测方法的创新J.河南农业大学学报,2023,57(4):639-645.DOI:10.16445/ki.1000-2340.20230515.001多重耐药基因 lsa(E)实时荧光定量PCR 检测方法的创新张博,陈峥,李琼,刘伟成,杜聪阳,杜向党,许春燕(河南农业大学动物医学院,河南 郑州 450046)摘要:【目的】创新多重耐药基因 lsa(E)实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)的检测方法,为lsa(E)基因流行和传播的监测提供参考。【方法】根据 GenBank 中 lsa(E)基因的参考序列设计特异性引物,
3、通过纯化、连接和转化等步骤,提取含有 lsa(E)基因片段的重组质粒 DNA 为标准品进行检测,绘制标准曲线,验证其特异性和重复性,从而对多重耐药基因 lsa(E)qRT-PCR 检测方法进行创新;使用该检测方法对牛场粪便、土壤、淤泥和卧料等环境样品中 lsa(E)基因的拷贝数量和相对丰度进行检测。【结果】该多重耐药基因 lsa(E)qRT-PCR 检测方法熔解曲线均为平滑单峰,特异性强;扩增效率良好(101.56%);标准曲线呈现良好的线性关系(r20.997);检测拷贝数量范围广(1.711021.71108 copiesL-1)且灵敏度高,组内组间变异系数范围为0.45%1.66%,重复
4、性强;使用该方法检测牛场环境样品,lsa(E)基因拷贝数量范围为 2.54104 1.52108 copiesL-1,相对丰度范围为 9.3910-41.20103,而普通 PCR 方法仅能在拷贝数量大于 1106 copiesL-1的环境样品中检测到 lsa(E)基因。【结论】本研究创新了多重耐药基因 lsa(E)的 qRT-PCR 检测方法,特异性强,灵敏度高,检测范围广,且能应用于不同养殖环境样品(粪便、土壤和淤泥等)中 lsa(E)基因的定量检测,为lsa(E)基因流行和传播的监测提供技术支持和理论指导。关键词:lsa(E)基因;多重耐药;实时荧光定量 PCR;拷贝数量;相对丰度中图分
5、类号:S852.61文献标志码:A文章编号:1000-2340(2023)04-0639-07Innovation of qRT-PCR assay for detection of multiple drug resistance gene lsa(E)ZHANG Bo,CHEN Zheng,LI Qiong,LIU Weicheng,DU Congyang,DU Xiangdang,XU Chunyan(College of Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450046,China)Abstract:【
6、Objective】To provide a reference for monitoring the prevalence and spread of lsa(E)gene by innovating a real-time quantitative PCR(qRT-PCR)method for the detection of multi-drug resistance gene lsa(E).【Method】Specific primers were designed according to the reference sequence of the lsa(E)gene in Gen
7、Bank.The recombinant plasmid DNA containing lsa(E)gene was extracted following purification,ligation and transformation and used as the standard substance for detection.The standard curve was drawn and its specificity and repeatability were verified to establish the innova-tive method of a qRT-PCR a
8、ssay for multidrug-resistant gene lsa(E).Then,the method was applied to detect the copy numbers and relative abundance of lsa(E)gene in feces,soil,sludge and padding collected from cattle farms.【Result】The results showed that the melting curves of this method were 640 河南农业大学学报第 57 卷smooth and unimod
9、al,and exhibited a strong specificity;the amplification efficiency was 101.56%;the value of r2 was 0.997,indicating a good linearity relationship of the standard curve;the detec-tion range(number of gene copies)of the assay for lsa(E)was wide with 1.71102 to 1.71108 copiesL-1 and its sensitivity was
10、 high,and both the variable coefficients of intra and inter batch re-peated tests were within 0.45%to 1.66%,with a good repeatability.For environmental samples from cattle farm,the copy number of the lsa(E)gene was from 2.54104 to 1.52108 copiesL-1 and the relative abundance was from 9.3910-4 to 1.2
11、010-3 detected by qRT-PCR.However,the conven-tional PCR method could only detect lsa(E)in environment samples with more than 1106 copiesL-1 of the copy number of gene.【Conclusion】This study innovated a qRT-PCR assay for the detection of multidrug-resistant gene lsa(E)with high specificity,sensitivit
12、y,and wide range of application.The innovative method could be used in different environment samples(including feces,soil and sludge)collected from cattle farms,and provided a technical and theoretical guidance for monitoring the epi-demic and transmission of lsa(E)gene.Key words:lsa(E)gene;multidru
13、g resistance;real-time quantitative PCR;copy number;relative abundance细菌耐药已成为全球公共卫生问题,严重威胁食品安全和公共健康1。多重耐药基因 lsa(E)属于能 够 编 码 ATP 结 合 盒(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白的基因,通过外排作用介导革兰氏阳性菌感染的代表药物(林可胺类、链阳菌素 A 类和截短侧耳素类)的抗性2。此外,lsa(E)基因还可介导阳性菌株对人类医学临床上重要的抗革兰氏阳性菌药物来法莫林(lefamulin)3和瑞他莫林(retapamulin)4的耐药性。多重耐药基因
14、 lsa(E)由德国 STEFAN Schwarz 教授于 2012 年首次在欧洲人源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-re-sistant staphylococcus aureus,MRSA)和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylo-coccus aureus,MSSA)中被检出并命名2。同年,LI等4在江苏和浙江猪场 MRSA 中检测到 lsa(E)基因,并证实该基因位于多重耐药基因簇中。随后,该基因又在多种细菌中被发现,包括粪肠球菌5、屎肠球菌5、表皮葡萄球菌6、无乳链球菌7和猪红斑丹毒丝菌8等。目前,lsa(E)基因
15、相继在世界各地被 报 道,包 括 亚 洲、欧 洲、南 美 洲 和 北 美 洲等2,7,9-12。此外,lsa(E)基因可以通过质粒在不同细菌之间传播4-6,这加速了其散播的速率和广度,对畜禽养殖业和人类健康带来威胁。在耐药基因的相关研究中,普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法或多重 PCR 检测方法只能对其进行定性检测,检测对象限定为纯培养菌株的基因组,并在检测之后还需要 进 行 测 序 验 证。谷 立 慧 等13使 用 普 通PCR 方法与测序技术相结合对猪源金黄色葡萄球菌 lsa(E)基因的流行情况进行调查,需要先使用 PCR 对纯培养物
16、进行扩增,然后对扩增产物进行测序验证。随着耐药基因和耐药菌株作为新型污染物概念的出现,实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)和宏基因组学等非培养的检测方法已被用于表征各种环境介质中耐药 基 因 的 污 染 水 平。然 而,宏 基 因 组 成 本高,仍未被广泛应用。而荧光定量 PCR 敏感 性高14,特异性和重复性好15,成本低廉,可以被广泛应用于微生物诊断检测的研究中。目前,常见的检 测 方 法 并 不 能 满 足 畜 禽 养 殖 环 境 中 lsa(E)基因 定量 检 测 的 需 求,而 关 于 lsa(E)基 因qRT-PCR 检测方法
17、尚未报道。基于此,本研究创新了 lsa(E)基因的 qRT-PCR 检测方法,并使用该方法检测牛养殖环境中 lsa(E)基因的拷贝数量和相对丰度,为畜禽养殖环境中 lsa(E)基因的快速精准检测提供了理论依据。1材料与方法1.1试验材料1.1.1材料河南农业大学病原菌耐药与新兽药创制实验室分离保存的 1 株携带 lsa(E)基因的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)a90 为阳性对照菌株,以其基因组作为阳性对照模板。2021 年 9 月在河南省中牟县 2 个牛养殖场采集牛场粪便(NNF1NNF3,RCF1RCF3,NBF1 NBF3,RDF1 RDF3)、卧料(NNW1 NN
18、W3,NBW1 NBW3)、土壤(RDT1 RDT3)和淤泥(RDY1 RDY3)共 24 份环境样品。1.1.2主要试剂 细菌基因组 DNA 提取试剂盒,天第 4 期张博,等:多重耐药基因 lsa(E)实时荧光定量 PCR 检测方法的创新641 根生化科技有限公司;HiPure Soil DNA Mini Kit,广州美基生物科技有限公司;QIAGEN Plasmid Mini Kit,德 国 QIAGEN 公 司;PowerUPTM SYBRTM Green Master Mix(2),北京赛默飞世尔科技(中国)有限公司;胶回收纯化试剂盒,北京天根生化科技有限公司;One step ZTO
19、PO-Blunt/TA 零背景快速克隆试剂盒,北京庄盟国际生物基因科技有限公司;DH5 感受态细胞,北京天根生化科技有限公司。1.1.3主要仪器qRT-PCR 仪(CFX96),美国Bio-Rad 公司;PCR 仪(T100 Thermal Cycler),美国Bio-Rad 公司;凝胶成像系统(Tanon 1600),上海天能科技有限公司;电泳仪(HE-120),上海天能科技有限 公 司;超 微 量 分 光 光 度 计(NanoDrop ND-2000),美 国 Thermo 公 司;荧 光 定 量 仪(Qubit 4.0),美国 Thermo 公司。1.2试验方法1.2.1引物的设计与合成
20、通过 NCBI 查找并下载 lsa(E)基因的参考序列,用软件 Oligo7 进行 qRT-PCR 特异性引物设计,lsa(E)基因 qRT-PCR 引物(基因序列号 67412470)F:ACCAAAATAAACCCCTTCTT-GCGTT,R:CCTGCTTATTGATGAACCTACAAACCA,片段长度为 93 bp;T 载体引物(M13 引物),F:TGTA-AAACGACGGCCAGT,R:CAGGAAACAGCTATGACC,片段长度为 237 bp;lsa(E)基因普通 PCR 引物16:F:TGTCAAATGGTGAGCAAACG,R:TGTAAAACGGCT-TCCTGAT
21、G,片段长度为 496 bp;16S rRNA 基因引物参考已发表文献17进行合成,F:CGGTGAATACGT-TCTCGG,R:GGATACCTTGTTACGACTT,片段长度为143 bp。1.2.2阳性标准质粒的制备将保存的 lsa(E)基因阳性肠球菌 a90 扩大培养,参照 DNA 提取试剂盒说明书提取 DNA,以其为模板进行 PCR 扩增lsa(E)基因,反应体系为:模板 2 L,上、下游引物各 1 L,Premix Ex taq DNA 聚合酶 10 L,ddH2O 6 L,总体积为 20 L。反应程序为:94 预变性 5 min;94 30 s,58 30 s,72 15 s,
22、进行 30 个循环;72 延伸 10 min;4 保存备用。通过常规方法,将目的片段 lsa(E)基因与 T载体连接,构建重组质粒。测序验证之后将重组质粒电转化入大肠杆菌 DH5 中,提取质粒后使用Qubit 4.0 荧光定量仪检测质粒 DNA 质量浓度,NanoDrop ND-2000 超微量分光光度计确定 质粒DNA 纯度,-20 保存备用。1.2.3lsa(E)基因 qRT-PCR 方法设计使用 Qu-bit 4.0 对重组质粒定量后,根据下式计算质粒拷贝数量18。将重组质粒质量浓度稀释至 30 40 mgL-1,之后进行 10 倍的倍比稀释,获得重组质粒的 10 个稀释点,即 10-1
23、、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10;每 个 点 设 置 3 个 平行19,另设超纯水(ddH2O)组作为阴性对照,按照式(1)计算拷贝数量。CN=(LC)/(NM109)(1)式中:CN 为拷贝数量/(CopiesL-1);L 为阿伏伽德罗常数/(6.021023 mol-1);C 为重组质粒质量浓度,36.8 mgL-1;N 为重组质粒的总长度,1 958 bp;M 为每对碱基的平均摩尔质量,660 gmol-1。反应体系为:SYBRTM Green Master Mix(2)10 L,lsa(E)基因的上、下游引物各 0.8 L,d
24、dH2O 6.4 L,DNA 模板 2 L。反应程序如下:(50 ,2 min)+(95 ,3 min)+(95 ,30 s+58 ,30 s+72 ,10 s)40;熔解曲线的反应条件是(95 ,30 s)+(60 ,30 s)+(72 ,30 s)。反应后整理相关数据,以标准品拷贝数量的对数值为横坐标,qRT-PCR 得到的 Ct 值为纵坐标,绘制 lsa(E)基因的标准曲线。1.2.4qRT-PCR 方法的重复性试验qRT-PCR反应选择同一批 3 个不同质量浓度的标准品进行批内重复试验;用不同批次的 3 个质量浓度的标准品为模板,在不同时间内进行批间重复试验,运用变异系数数值,即标准差
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