杜(氏)进行性肌营养不良和脊髓性肌萎缩的基因诊断和产前诊断.pdf

中国神经免疫学和神经病学 杂志 2 0 0 8 年 7月第 l 5卷第 4期C h i n J Ne u r o i mmu n o l Ne u r o l 2 O O 8，Vo 1 1 5，N o 4 杜(氏)进行性肌营养不 良和脊髓性肌萎缩 的基 因诊断和产前诊断 黄 尚 志(中国医学科学院基础 医学研究所北京协和医学院医学遗传学系，WHO遗传病社 区控制合作 中心，北京 1 0 0 0 0 5)摘要：杜(氏)进行性肌 营养不 良(D MD)和脊髓性肌萎缩(S MA)是最常见 的两种 累及肌 肉的遗传病，以基 因片 段缺失 为主要突变类型。联合应用各种基 因分 析手 段可准确地进行基 因诊断和杂合子检测。在产前诊 断 中，应 采用两种 不同技术路线进行分析 以避免样 品污染造 成差错。D MD散发病例 的母 亲可能是生殖腺嵌合 甚至就 是 携带 者，应一律进行产 前诊 断。一 、关键 词：D MD；S MA；基 因诊 断；产前 诊断 中图分类号：R7 2 9 文献标识码：A 文章编号：1 0 0 6-2 9 6 3(2 0 0 8)0 4-0 3 1 7-0 4 神经肌肉遗传病是一大组临床常见而又复杂 的疾 病，需 要进 行 准 确 的 鉴别 诊 断，基 因诊 断被 认 为是此类疾病 的最终诊断依据。这类疾病具有遗 传异质性，需要为每种疾病制定相应的基因诊断策 略。此文仅 以临床常见的两种 遗传性 肌病杜(氏)进行性肌营养不 良(Du c h e n n e mu s c u l a r d y s t r o p h y，D MD)和脊髓性肌 萎缩(s p i n a l mu s c u l a r a t r o p h y，S MA)为例，做 一简 单介 绍。1 DMD和 S MA是最 常见 的肌 肉受累遗传 病 在北京协和医院儿科遗传咨询门诊就诊 和申 请 产 前 诊 断 的患 者 中，D MD 和 S MA 最 常 见。2 0 0 7年 就诊 的 2 6 0例病 例 中，D MD 占 5 8。5 9 5，S MA 占 2 1。7 5 。准确 提供 这 两种 遗传 病 的诊 断，可解决 目前临床实践 中大部分相关病例 的诊断 问题。DMD系 x 一 连锁隐性遗传病，是 由抗肌萎缩蛋 白(d y s t r o p h i n)基 因(亦称 D MD基 因)突 变所 致 的 肌 源性 损 伤。贝(氏)进 行 性 肌 营 养 不 良(B e c k e r mu s c u l a r d y s t r o p h y，B MD)也 由 D MD基 因突 变 所致，发病较 D MD晚，而且 1 2岁之后还能行走。白种人 中 D MD发 病率 为 1 3 5 0 0活产 男 婴，约 2 5 9 6 的女性携带者因不幸 的“莱昂化”而得病，但 症状 比男性轻。所谓“莱昂化”是指 X染色体灭活 现象，人类女性两条 x染色 体中随机有一条在胚 胎早期发生失活。如果女性杂合子正常基 因所在 的 x染色体灭活导致细胞功能异常，则 为“不幸 的 莱 昂化”。一旦“不幸 的莱 昂化”细胞 占优势，个体 就会患病。由于其组织 中还有一些细胞是正常 的(缺陷基因所在 x染色体失活)，因此相对于男性 患者 而言 症状 要轻。S MA 为常染色体隐性遗传病，白种人发病率 为 1 6 0 0 0 1 1 0 0 0 0，是脊髓前角细胞和脑干运动 核退变所致神经根 和肌 肉萎缩，临床根据其发病年 龄和症状轻重程度分为 4型，皆由运动神经元存活 基 因(s u r v i v a l mo t o r n e u r o n，S MN)突变 所致。DMD基 因编码 的抗肌萎缩 蛋 白与其他 肌浆 蛋 白形成复合体，与膜蛋 白一起形成细胞骨架，并 与细胞外蛋 白结构 连接。复合体 中其他蛋 白组 分 缺陷也可导致复合体功能异常，引起类似 DMD的 肌 肉疾 病 如 肢 带 型 肌 营 养 不 良(1 i mb g i r d l e d y s t r o p h y，L GD)，且多为 常染色体 隐性遗传，易与不 典型 DMD(尤其是 B MD)混淆，应注意鉴别诊断。收稿 日期：2 0 0 8 0 2 1 3；修订 日期：2 0 0 8 0 3 2 9 基金项 目：N-技 部“十 五”国家 科 技 攻 关 计 划 基 金 资 助 项 目(2 0 0 4 B A7 2 0 A0 4)；北 京 市 科 学 技术 委员 会 研 发 攻 关 类 基金 资 助 项 目 (D 0 9 0 6 0 0 5 0 4 0 4 9 1)；科技部“十一五”国家科技支撑计划基金资助项 目(2 0 0 6 B A1 0 5 A0 3)作者简介：黄尚志(1 9 4 4 一)，男，江苏省人，硕士，研究员，博士生导师，主要从事遗传 病 的遗传 咨询、基 因诊断 和产前诊断策 略研 究。通讯地 址：中国医学科学院基础 医学 研究所 北京 协 和 医学 院 医学遗 传学 系，北 京 1 0 0 0 0 5。联系 电话：[phone]。E ma i l：h s z p u mc y a h o o c o rn c n。维普资讯 http:/ 中国神经免疫学和神经病学杂志 2 0 0 8年 7月第 1 5卷第 4期Ch i n J Ne u r o i mmu !：2 基因结构特点 DMD基 因位 于 X p ，基 因 组 DNA 片 段 长 约 2 3 Mb，由 7 9个 外 显 子 组 成，c DNA 长 约 1 4 k b。在 DMD基 因内存在许多重复序列，形成许多断裂 和交 换 热 点，导 致基 因缺 失 重 复及 容 易 发 生新 生 突变。S MN 基 因位 于 5 2 2-q 1 3 3区 域，在 这 4 0 0 k b范围内存在一个镜像重复 区域，具有高度 同源 性。位于端粒侧 的基 因(S MN1或 S MN)具有生 物活性，而位于着丝粒侧的拷 贝(S MN2或 S MN )没有 活性，二 者 之 间 只有 8个 核 苷 酸 的差 别，5个 位于内含子中，3个位于外显子中。S MN1基因外 显子 7的+6位 为 C，S MN2基 因为 T。S MN1 基 因长 2 O k b，c DNA 长 1 7 k b，蛋 白含 2 9 4个 氨基 酸。S MN2基因由于外显子 7的+6位为 T，导致 mRNA剪接异常，跳越 了外显子 7而不具有功能，但仍可产生少量全长 mRNA，与 S MN1转录本 相 同，对 S MN1 基 因缺失有 补 偿 作 用，可 减轻 患 者 症 状。这两个基因都具有拷贝数多态性，即一条染色 体 上有 多个 S MN1和 S MN2基 因拷 贝，正 常 染 色 体 4 含 有 两 个 S MN1基 因，5 9 5 没 有 S MN2基 因l_ 2 。这种高度同源性和拷贝数多态性，导致该染 色体 区间频繁发 生互换，使 S MA成 为常见 遗传 病。S MA 的 4种 临床 表 型 差 别 就 在 于 S MN2基 因拷贝数量多少 以及发挥补偿作用 的大小口 。3 基 因突变的特点 DMD基因突变的主要类 型是基 因片段缺失，在基因 5 端和 3 端分别存在一个缺失高发区，尤 其后者，以外显子 5 1区域 为高峰，中国人病例近 8 O 的缺失突变发生在此区域E s 。其中大范围(一 个 或数 个 外 显 子)缺 失 型 占 6 O 9 5，重 复 型 突变 占 6 ，还有缺失区域不连续或同一患者 既有缺失又 有重复的复杂突变l_ 6 。通过序列分析显示，微小缺 失 占 3 9 5，单核苷酸改变 占 2 9 E 7 3。9 5 的 S MA为 S MN1基 因外 显子 7纯 合型 缺失，其余 为缺失型突变与非缺失型突变遗传复合 体。非 缺失 型 S MN1 基 因为 点 突变、微 小缺 失 重 复。在所 有 患者 中均 未见 到 S MN2基 因 的纯 合 性 缺 失，最 少 者遗 留一个 S MN2基 因拷 贝 2-4-。4基因突变检测 联合应用各种基 因突变检测技术 可对绝大部 分病例进行致病突变鉴定。对于不能鉴定 出突变 的个体，应考虑其临床诊断是否准确。4 1基 因缺 失 重 复 突 变 检 测 S o u t h e r n印 迹 法 是检测基 因缺失的经典方法，而 P C R(p o l y me r a s e c h a i n r e a c t i o n)技术的应用使缺失突变检测变得更 简便。最 初采 用 多 重 外 显 子 P C R 扩 增 检 测 DMD 缺失突变E S,8 ，后来又创建 了各种定量检测基 因片 段 的 方 法，如 定 量一 P C R(q u a n t i t a t i v e-P C R，Q P C R)E g 、多 重 可扩 增 探 针 杂 交(mu l t i p l e x a mp l i f i a b l e p r o b e h y b r i d i z a t i o n，MAP H)0 o 、多重连接依 赖 式 探 针 扩 增(Mu l t i p l e x l i g a t i o n-d e p e n d e n t p r o b e s a s s a y，ML P A)技术口 妇 等，可对 DMD基因 7 9个外显子进行分析，不仅可检测基 因缺失还 可 检测基 因重复。联合应用各种 DNA分析手段，对 于 D MD致病 突变 基 因综合 检测 能力 可 达 9 8 9 5，可 直接确诊 D MD患者，并且将来有可能取代创伤性 肌 肉活检的病理诊断；而对 B MD病例的检测能 力仅 6 O ，尚需进一步研究，部分 B MD病例可能 属于抗肌萎缩蛋白复合体中其他蛋白的异常_ 7 。在 S MA 基 因 诊 断 中，针 对 S MN1和 S MN2 基 因同源性很大的特点，曾用酶切法区分二者的外 显子 7，确定 是 否 存 在 S MN1基 因 的纯 合 性 缺 失E 1 2 3，由于酶切不完 全的 S MN2基 因残 留片段可 能会被误认为是 S MN1扩增片段，有 导致结 果判 断错误 的潜在 风险。应 用等位 基 因特异性 P C R (a l l e l e s p e c i f i c P C R，AS-P C R)、变 性 高 效 液 相 层析(d e n a t u r i n g h i g h p e r f o r ma n c e l i q u i d e h r o ma t o g r a p h y，DHP L C)胡和 ML P A_】等 技 术，可 进 行 S MN1和 S MN2基 因拷贝数定量分析。近来，此文作 者 设计 内对 照参 比基 因扩 增片 段，并 使 S MN1和 S MN2扩增产物 片段 长度不 同，将 A P C R和 Q-P C R结合，通过 电泳不仅能检测 S MN1 纯合性缺失，还 可进行 S MN1和 S MN2基 因拷贝 数定量。作 者还分 析 了北 京地 区 2 6 4例 拟诊 为 S MA 的 病 例，只 检 测 到 7 5 9 5 的 患 者 为 纯 合 性 缺 失，而其余 2 5 9 5 未检测到缺失，提示临床诊断标准 控制不严格，其中一些患者并不是 S MA。4 2 点 突 变 的检 测 策 略 对 于 非 缺 失 重 复 型 DMD突变，可应用 DHP L C _】或高分辨溶解 曲线 分 析(h i g h r e s o l u t i o n me l t i n g c u r v e a s s a y，HR M)逐个检测基 因外显子，筛查出突变所在的扩增片段 后通过 P C R产物直接测序确定突变细节。但仅靠 基 因组 DNA分析不能检测到深埋在基 因 内含子 中或基 因调控序列中的致病突变，而用外周血提取 维普资讯 http:/ 中国 神经免疫学和神经病学杂志2 0 0 8 年7 月第l 5 卷第4 期C h i n J e u!坠 !：!：mR NA 后 经 逆 转 录(r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n，RT)一 P C R进行突变分析则可大大减少工作量。如 出现 扩增片段数 目和长度改变，可直接判 断基 因缺失 重复及影响剪切的突变，而对未发生改变 的其他患 者，可 逐 个 对 R T P C R 片 段 进 行 突 变 筛 查 和 测 序。对于 S MA点突变的检测，必须在 S MN1基因 定量分析基础上选择仅存一个 S MN1基 因的非纯 合型缺失患者 进行 S MN1基因序列测定，而 非缺 失型突变的纯合子，因其罕见可不予考虑。5 遗传 咨询 中应提供的信息 5 1 新生 突 变 与 生殖 腺 嵌 合D MD 病例 中，新 生突变多见，这是 DMD的另外一个特点，表现为 散发性、无家族史。严格 的新生突变是指在减数分 裂过 程 中 出现 差错，再 次 发 生 可 能性 不 高。但 DMD基因中存在高度重复结构，决定 了该基 因不 仅在减数分裂过程 中易发生差错，在有丝分裂过程 中也可发生差错；不仅在两条 x染色体 问发生，在 一条 x染色体 内也可发生。因此，临床分析中男、女性都可发生。即使缺失型患儿母亲的外周血分 析结果显示为多态性杂合(不缺失)，也不能排除生 殖腺嵌合。当母亲基 因为生殖腺嵌合时再 次生育 DMD病例的风险高，因此在临床实践中对散发病 例再次妊娠都应进行产前诊断。当突变基因标记 为外祖父来源时，患者的姨表亲也可能是携带者。5 2 杂合子(携带者)检测 在 x连锁隐性遗传 病 中，女性携带者生育男性患儿风险为 5 0 ，如能 确定女性携带者身份，在其首次妊娠时就可提供产 前诊断。此文作者 曾应用 D MD基因两端和 内部 缺失高发区域的多态性 串联重复序列(s h o r t t a n d e m r e p e a t s，S TR)u 结合外显子扩增创建的“一 步到位”法口 引，在检测缺失型基因中8 0 病例，并 可同时准确进行 携带者检测。对重复性 突变和先 证者已故的病例，可用 ML P A进行基 因剂量分析 以检测缺失 重复突变型携带者。对于 S MA，文献报道 白种人群体 中 S MN1缺 失的杂合子频率为 1 5 0 1 a 0 I 2 ，如中国人群也 是如此，则应考虑对群体 中杂合子的筛查。5 3 产 前诊 断 的 时机 和 前 提 由于 基 因突 变 情 况复杂，产前诊断前要进行先证者预分析，以确定 其基因突变细节及父母基 因多态性标记是否提供 了杂合状态的信息，以确定在该家系中实行产前诊 断的途径和策略。产前诊 断 有 2个 时 间 窗 E l：首 选 1 0 1 2孕 周 采集绒毛；次选 为 1 5 1 8孕周采集羊水。选择绒 毛进行 产 前诊 断 的理 由有 3条：(1)防止母 源污 染：D MD和 S MA 以缺失 型突变 为主，母源污染将导 致诊断错误，发生血性羊水时若不经培养则直接导 致诊 断错 误，而 绒 毛则 可 通 过 形 态 检查 准 确挑 选。(2)早期诊断：如胎儿受 累，处理 比较方便(夫妇 的 知情选择)，而且万一取材失败或分析中出现问题，还可在稍后时间取羊水；采集羊水在孕中期，万一 发生血性污染则需进行羊水培养，回旋余地太小，重新取样时间上 比较 困难。(3)成功率高：绒毛提 取 的 D NA质好量多，成功率高。6 产 前诊断 的策 略 产前诊断时，首先应进行 家系成员 2 1号染色 体上 S TR标记 的分析。该项检测具备的优点：一 是检测 2 1三体综合征，因为在二次生育时孕妇年 龄普遍偏大，生育 2 1三体综合征患儿 的风险大为 提高；二是 判 断是 否 有母 源 污 染及 污 染 程 度，有 时 会出现“胎儿材料”完全是母源的情况；三是核对所 分析的 D NA 材料是否存在混乱。后两点是导致 产前 诊 断差错 的 主要原 因。D MD的产前诊断，首先 需确定胎儿性别。如 胎儿为男性，则应针对先证者的基因突变或多态性 标记进行分析，确定胎儿是否获得 突变等位基 因；如为女性，则可停止基 因诊断，因为女性杂合子通 常不患病。目前临床受 检 的 S MA病例 中非 纯合缺失型 病例所 占比例较文献报道高，提示其中部分病例可 能不 是 S MA。若 不 能 通 过 定 量 分 析 S MN1基 因 确定复合杂合子，最好只对纯合缺失 型 S MA病例 进行产前诊断。无论 D MD还是 S MA，在检测基 因缺失时均 应 设 置 内对 照，以 明 确 目标 基 因 片 段 未 扩 增 不 是 P C R反应 失 败 所 致(此 时，内对 照 扩 增 阳性)以及 微弱扩增不是污染所致，以保证分析的真实性。对于缺失型基因突变的产前诊断，母源污染是 导 致诊 断错误 的 重要 根 源。对 胎儿 绒 毛 组 织 要 精 心挑选，以去除可能的母源 物质，当羊水有血性污 染时要进行细胞培养。为保证产前诊断的准确性，应 同时采用直接检 测基因突变(缺失检测)与多态性连锁分析两套分 析途径，当多态性标记出现额外等位基因时则提示 母源污染的可能。通过基因拷贝数定量分析也可 维普资讯 http:/ 3 2 O 中国神经免疫学和神经病学杂志2 0 0 8 年7 月笙i s 箜 塑 !里 !塾 !：!：确定胎儿微弱 的阳性信号是否为污染所致。胎儿 无基 因缺失(不受 累)时有扩增信号，剂量接 近于 1，而母源污染所致的扩增信号较弱，其剂量不会达 到 1。参 考 文 献 1 盛文利，柴建华，刘 焯霖D MD基 因内含子 中的多种、多个重复顺序 与外显子缺失关系 的探讨E J 中华 神经 科杂 志，1 9 9 7，3 0：2 1 4 2 1 7 r 2Fe l d k o t t e r M，W i r t h R，S c h wa r z e r V，e t a 1 Qu a n t i t a t i v e a n a l y s e s o f SMN 1 a n d S M N2 b a s e d o n r e a l t i m e l i ght c y c l er PCR：f a s t a nd hi ghl y r e l i ab l e c a r r i e r t e s t i n g a n d p r e d i c t i o n o f s e v e r i t y o f s p i n a l mu s c u l a r a t r o p h y I-J Am J G e n e t，2 0 0 2，7 0：3 5 8 3 6 8 3 Wi r t h B An u p d a t e o f t h e m u t a t i o n s p e c t r u m o f t h e s u r v i v a l mo t o r n e u r o n g e n e(S M N1)i n a u t o s o ma l r e c e s s i v e s p i n a l mu s c u l a r a t r o p h y(S MA)I-J Hu m M u t a t，2 0 0 0，1 5(3)：2 2 8-2 3 7 4 罗新 明，杨 晓苏，肖 波脊 髓性肌萎缩症患者神经 元 样 细胞 S MN2基 因 mR NA 的表达 J 中华 内科 杂 志，2 0 0 6，4 5(1 0)：8 3 1 8 3 4 5 汪江，沈定 国，刘 红。两 步一 多重 P C R诊断 1 3 4例 假肥大型进行性肌 营养不 良症 基 因缺失 J 中华 神 经科杂志，1 9 9 7，3 0(5)：2 7 2 2 7 5 6 Z e n g F，R e n Z R，Hu a n g S Z，e t a 1 Ar r a y-ML P A：c o mpr e h e ns i v e d e t e c t i on of d e l e t i on s a nd dup l i c a t i ons a n d i t s a p p l i c a t i o n t o D MD p a t i e n t s l,J Hu m Mu t a t，2 0 0 8；2 9(1)：1 9 0-1 9 7 7 S t o c k l e y T L，Ak b e r S，B u l g i n N，e t a 1 S t r a t e g y f o r c ompr e he n s i v e mol e c ul a r t e s t i ng f or Duc h en ne a n d B e c k e r mu s c u l a r d y s t r o p h i e s I-J G e n e t T e s t，2 0 0 6，1 0(4)：2 2 9-2 4 3 8 C h a mb e r l a i n J S，Gi b b s R A，R a n i e r J E，e t a 1 D e l e t i on s c r e e ni ng of t he Du c he nn e mus cu l a r dy s t r ophy l o c u s v i a mu l t i p l e x DN A a mp l i f i c a t i o n I-J N u c l e i c A e l d s Re s，1 9 8 8，1 0(2 3)：1 1 1 4 1 1 1 1 5 6 9 Tr a v e r s o M，Ma l n a t i M，Mi n e t t i C，e t a 1 Mu l t i p l e x r e a l-t i me P CR f o r d e t e c t i o n o f d e l e t i o n s a n d d u p l i c a t i o n s i n d y s t r o p h i n g e n e J B i o c h e m B i o p h y s R e s Co mmun，2 006，3 39(1)：l 45 一 l 5 0 r 1 0 Ar mo u r J A，S i s ma n i C，P a t s a l i s P C，e t a 1 Me a s u r e me n t of l o c us c op y n umbe r by hy br i d i s a t i o n wi t h a mp l i f i a b l e p r o b e s J 。Nu c l e i c Ac i d s Re s，2 0 0 0，2 8 (2)：6 0 5-6 0 9 1 1 J a n s s e n B，H,a r t ma n n C，S c h o l z V，e t a 1 MI P A a na l ys i s f or t he de t e c t i on o f de l e t i ons，d upl i c at i o ns a nd c o mpl e x r e a r r a n ge me nt s i n t he dy s t r o ph i n ge n e：p o t e n t i a l a n d p i t f a l l s l,J Ne u r o g e n e t i c s，2 0 0 5，6(1)：2 9 35 1 2 v a n d e r S t e e g e G，Gr o o t s c h o l t e n P M，v a n d e r Vl i e s P，e t al。PCR ba s e d DNA t e s t t o c onf i r m t he c l i n i c a l di a gn os i s of a ut os o ma l r e c e s s i v e s pi na l mus c ul a r a t r o p h y J L a n c e t，1 9 9 5，3 4 5(8 9 5 5)：9 8 5 9 8 6 1 3 C h e n WJ，Wu Z Y，L i n MT，e t a l。Mo l e c u l a r a n a l y s i s a nd p r en a t a l p r e di c t i on of s p i n a l mu s c ul a r at r o phy i n c hi ne s e pa t i e nt s b y t he c omb i n a t i o n of r e s t r i c t i o n f r a g me nt l e ngt h p ol ymor ph i s m a n a l y s i s，de n at ur i ng h i gh-pe r f or ma nc e l i qui d c hr oma t o gr a p hy，a n d l i n ka ge a na l y s i s l,J 。Ar c h Ne u r o l，2 0 0 7，6 4(2)：2 2 5 2 3 1 1,1 4 T o ma s z e wi c z K，Ka n g P，Wu B L D e t e c t i o n o f ho mo z yg ous a nd h e t e r o z y go us SM N d el e t i on s o f s p i n a l mu s c u l a r a t r o p h y i n a s i n g l e a s s a y wi t h mu l t i p l e x l i g a t i o n d e p e n d e n t p r o b e a mp l i f i c a t i o n l-J B e i j i n g Da Xu e Xu e Ba o，2 0 0 5，3 7(1)：5 5-5 7 -1 5 陈亚男，周鑫，金春 莲，等。应用 DHP L C技 术检测 非缺失 型 D MD致 病基 因 的新 突 变I-J 。中华 儿科杂 志，2 0 0 7，4 5(6)：4 1 3-4 1 6 -1 6 Ve z a i n M，S a u g i e r-Ve b e r P，Me l k i J，e t a 1 A s e n s i t i v e a s s a y f or me a s ur i ng SM N mRNA l e ve l s i n pe r i p h e r a l bl oo d an d i n m u s c l e s a mpl e s of p at i e nt s a f f e c t e d wi t h s p i n a l mu s c u l a r a t r o p h y l,J E u r J Hu m G e n e t，2 0 0 7，1 5(1 0)：1 0 5 4 1 0 6 2 1 7 许顺斌，黄 尚志，罗会 元D MD B MD基 因诊 断的新 体 系 Amp F L P连锁分 析 J 中 国医学科 学院学 报，1 9 9 3，1 5：4 0 5 4 1 0 1,1 8 黄 尚志遗传 病 的诊 断 M 见：李 璞医学遗 传学 I-M 第 2版 北京：中国协 和医科 大学出版社，2 0 0 4 2 64 3 O7 维普资讯 http:/