一种半变性琼脂糖凝胶电泳技术的改良_钟正伟.pdf

第 40 卷第 12 期2012 年 6 月广州化工Guangzhou Chemical IndustryVol 40 No 12June 2012一种半变性琼脂糖凝胶电泳技术的改良*钟正伟(承德石油高等专科学校化学工程系，河北承德067000)摘要:建立一种经济快捷的利用半变性琼脂糖凝胶电泳技术分析酵母朊病毒迁移特性的方法，在蛋白样品制备过程中采用珠磨破碎法代替文献使用的昂贵的藤黄节杆菌酶酶解法破碎酵母细胞，使用 TBE 代替文献使用的 TAE 作为电泳缓冲液，并使用电湿转法代替文献使用的毛细虹吸法转印蛋白。对酵母朊病毒 PSI+的朊蛋白迁移特性分析结果显示，改良法不影响文献法的准确性，但降低了实验成本，缩短了实验时间。关键词:半变性琼脂糖凝胶电泳;酵母朊病毒;迁移;改良中图分类号:Q936文献标识码:A文章编号:1001 9677(2012)12 0077 03*基金项目:承德市科学技术研究与发展指导计划项目(No:201121127)。作者简介:钟正伟(1980 )，男，讲师，主要从事疯牛病发病机理和药物防治研究。An Improved Semi Denaturing Detergent AgaroseGel Electrophoresis Technique*ZHONG Zheng wei(Department of Chemical Engineering，Chengde Petroleum College，Hebei Chengde 067000，China)Abstract:An economic and fast method for assaying the mobility properties of yeast prion by Semi Denaturing De-tergent Agarose Gel Electrophoresis(SDD AGE)was established based on the previous reports The expensive Zy-molyase enzymatic hydrolysis method，which was used to breaking yeast cells in the process of protein sample preparationwas replaced with bead mill method TAE electrophoresis buffer and the capillary blotting for transfer of proteins describedin the literature were replaced by TBE buffer and a wet electroblotting，respectively The mobility properties of fusion pro-tein GFP Sup35p in yeast prion PSI+and psicells were detected by our improved SDD AGE technique Theresults showed that the improved method not only maintained the accuracy of the literature method，but also reduced ex-perimental costs and timeKey words:SDD AGE;yeast prion;mobility;improvement目前的研究表明酵母朊病毒不仅在淀粉状纤维的结构和形成机制上与动物朊病毒类似，而且酵母朊病毒细胞形成淀粉状纤维的生物化学环境和分子伴侣体系也和动物细胞极为相似1 4。因此酵母朊病毒为研究哺乳动物朊病毒形成的分子机制及研发抗朊病毒疾病药物提供了一个良好模型。在酵母朊病毒形成的分子机制及利用酵母朊病毒模型筛选抗朊病毒药物的研究中，获得酵母朊病毒聚集状态或朊病毒聚集体大小的相关信息是最重要的问题之一5 6。早期研究酵母朊病毒聚集状态在蛋白水平采用的方法是 SDS PAGE 结合免疫印迹技术，该技术可以准确区分酵母朊病毒的聚集或可溶状态，但由于大量的SDS 将朊病毒聚集体完全裂解为 SDS 不溶的朊病毒单体的技术缺陷因而无法定量分析朊病毒聚集体的大小5 6，而朊病毒聚集体的分子大小是影响朊病毒传播的重要因素7，也是衡量抗朊病毒药物作用效果的重要指标8。近年来 Kryndushkin 和 Lindquist 等研发并发展了一种半变性琼脂糖凝胶电泳技术(Semi Denaturing Detergent Agarose GelElectrophoresis，SDD AGE)用于分析酵母朊病毒聚集体的分子大小9 10，这种新技术 SDS 用量少，基本不裂解朊病毒聚集体，并借助疏松网状结构的琼脂糖凝胶支持大分子蛋白的分离，蛋白显影后可以清晰地观察酵母朊病毒聚集体的迁移特性从而可分析酵母朊病毒聚集体的大小。在他们报道的 SDD AGE 操作流程中一般采用藤黄节杆菌酶酶解酵母细胞壁后制备蛋白样品，采用 TAE 作为电泳缓冲液进行水平半变性琼脂糖凝胶电泳，并采用毛细虹吸法转印蛋白后进行标准的蛋白显影操作9 10。本文以表达融合蛋白 GFP Sup35p 的酵母朊病毒PSI+为研究对象，对文献的 SDD AGE 操作方法进行改良，采用珠磨破碎仪破碎酵母细胞壁后制备蛋白样品，使用 TBE 代替 TAE 作为电泳缓冲液，并使用电湿转法转印蛋白后进行蛋白显影操作。实验结果显示，改良法不影响文献 SDD AGE 技术的准确性，但降低了实验成本，缩短了实验时间。1材料与方法11材料1 1 1菌种酿 酒 酵 母:MAT kar1 SUQ5 ade2 1 his3202 leu2178广州化工2012 年 6 月trp163 ura3 52 sup35 KanMX/pJ510，GPSI+，GFP 基因插入 SUP35 基因的第 123 124 位之间，辽宁大学生命科学院提供。将 GPSI+细胞划线含有 5 mmol/L 盐酸胍的 1/2YPD 固体平板上培养 7 d 后，分离红色单菌落得到 Gpsi 细胞。1 1 2培养基1/2YPD 培养基:酵母浸粉 0 5%，蛋白胨 2%，葡萄糖 2%。1 1 3仪器超速冷冻离心机，美国科峻仪器公司;珠磨破碎仪 Bead Beater，美国 Biospec 公司;电泳仪 PowerPac HCTM，美国 Biorad 公司;转膜仪，美国 Biorad 公司，水平电泳槽 DYCO 31DN，北京六一电泳仪器厂。12方法1 2 1蛋白样品制备无菌条件下分别挑取酵母朊病毒GPSI+与Gpsi单菌落，接种到 10 mL 1/2YPD 液体培养基中，于 30，200 r/min 活化培养 24 h。取 1 mL 活化培养的酵母菌液，转接至 100 mL1/2YPD 液体培养基中，30，200 r/min 过夜培养。离心收集菌体(3000 r/min，5 min)，用裂解液(100 mmol/L NaCl，50 mmol/LKCl，5 mmol/L MgCl2，4%甘油，1%TritonX 100，2 5 mmol/LEDTA，0 1%SDS，25 mmol/L Tris HCl pH 7 4，2 mmol/L DTT，5 mmol/L PMSF)悬浮菌体，再次离心，收集菌体。在收集的菌体中加入 0 5 mL 裂解液，0 25 ml 玻璃珠，用珠磨破碎仪破碎细胞(30 s/次，共 3 次，4)。离心收集上清(3000 r/min，5 min，4)，小心转移上清至另一干净的样品管，再次离心收集上清(5000 r/min，3 min，4)，用蛋白质测定试剂盒(Protein assaykit)分别测定蛋白样品的浓度。1 2 2凝胶制备用 0 5 TBE 配制 1 5%琼脂糖凝胶，凝胶厚度一般 1 5 2 mm，为确保上样量，梳子厚度一般选择 1 5 2 5 mm。使用微波炉加热溶解琼脂糖，至混合物均匀透明。冷却至 42 后加入一定量的 SDS，使 SDS 终浓度为 0 1%，混合均匀后，轻轻倒入凝胶框架中，避免产生气泡。凝胶凝固后，在胶面上滴少量 0 5 TBE，小心地拔出梳子，将凝胶放入电泳槽，使其完全浸没在电泳缓冲液(含 0 1%SDS 的 0 5 TBE)中。1 2 3电泳在蛋白样品中添加 SDS 至终浓度为 0 5%，涡流震荡混匀，置 42 水浴中温育 10 min。将温育后的样品与上样缓冲液(2 5 TBE，2 5%SDS，25%甘油，0 25%溴酚蓝)按 41 混匀，室温静置 3 min。用移液器上样 20 L。根据凝胶宽度设置电压(10 V/cm)进行 4 恒流电泳，直至指示剂到达目的位置(约 1 h)，停止电泳。1 2 4转膜(电湿转法)裁剪比凝胶稍小的滤纸 6 张，放入转膜缓冲液(48 mmol/L甘氨酸，39 mmol/L Tris 碱，0 0375%SDS，20%甲醇)中浸泡备用。裁剪比凝胶稍大的 PVDF 膜，用甲醇浸泡 30 s，取出放入转膜缓冲液中。将转膜海绵垫放入转膜缓冲液中浸透，打开转膜夹心支架，黑板在下，依次放一层海绵垫、3 层滤纸、凝胶、PVDF膜、3 层滤纸、海绵垫，确保每层间都没有气泡，最后扣上白板并夹紧，放入电转槽中，黑板对应负极白板对应正极。在电转槽中加满转膜缓冲液，100 V 恒压转膜 50 min。1 2 5免疫印迹实验转膜后，进行标准的蛋白质印迹实验，兔抗 GFP 抗原(12000)脱色摇床震荡结合 2 h，HRP 标记的羊抗兔 IgG(15000)脱色摇床震荡结合 1 h，采用 ECL 发光试剂盒对其进行放射自显影检测，获得图像信息。2结果与分析酵母朊病毒 PSI+是翻译终止因子 Sup35p 的淀粉样聚集形式11。GFP 基因插入 SUP35 基因的第 123 124 位之间并不影响融合蛋白 GFP Sup35p 的淀粉样聚集特性12，这极大地方便了采用廉价的 GFP 抗体分析酵母朊病毒的聚集特性。图 1 所示为改良的 SDD AGE 技术分析PSI+和psi酵母细胞的朊病毒 GFP Sup35p 的聚集状态结果，从图 1 可以看出，改良的SDD AGE 技术分析结果背景清晰，而且在PSI+细胞中，Sup35p 主要以聚集体形式存在;在被治愈的psi细胞中，其Sup35p 主要以可溶单体形式存在，分析结果与文献的 SDD AGE 技术分析结果是完全一致的9 10。图 1改良的 SDD AGE 技术分析PSI+和 psi酵母细胞的朊病毒聚集特性Fig1The mobility properties of GFP Sup35p in yeast prion PSI+andpsicells detected by improvedSDD AGE technique The migration of molecular size standards(in kilodaltons)is shown on the left3结论本文借助表达融合蛋白 GFP Sup35p 的 酵 母 朊 病 毒 PSI+，对文献报道的分析酵母朊病毒迁移特性的 SDD AGE技术进行了改良。首先，在蛋白样品制备中使用珠磨破碎仪代替文献中昂贵的藤黄节杆菌酶破碎酵母细胞，节约了实验成本;其次，在电泳过程中使用 TBE 代替文献中的 TAE 作为电泳缓冲液，降低了电泳过程中的发热量，使电泳电压从文献中使用的3 V/cm 提高到 10 V/cm 左右，从而使电泳时间从 3 h 缩短至 1h;再次，在转印过程中使用电转湿法转印蛋白代替文献的毛细虹吸法，使转印时间由 3 h 或过夜缩短到 50 min 左右，从而缩短了实验时间。总体上看，改良法在不影响文献 SDD AGE/技术分析准确性的基础上，降低了实验成本，缩短了实验时间。本文利用常用的实验室仪器探索了一种改良的 SDD AGE 分析技术，丰富了 SDD AGE 技术操作流程的内容，为分析酵母朊病毒聚集状态和朊病毒聚集体大小的实验室提供了更多的选择。另外本方法也可为其他蛋白质电泳分析技术提供参考。参考文献 1Baxa U，Taylor KL，Steven AC，et al Prions of Saccharomyces andPodosporaJ Contrib Microbiol，2004，11:50 71 2Perrett，S and Jones，GW Insights into the mechanism of prion prop-agation J Curr Opin Struct Biol，2008，18:52 59(下转第 92 页)92广州化工2012 年 6 月系压力为 20 5 kPa，设定活化温度为600、活化时间为60 min，以 10 /min 升温速率对原料进行真空化学活化，制得竹质生物质活性炭。浸渍时间对活性炭吸附性能的影响如图 5 所示。图 5浸泡时间对产物吸附性能的影响由图 5 可以看出，随着浸渍时间的延长，活性炭产物的碘吸附值和亚甲基蓝吸附值的变化趋势相似。浸渍时间由 24 h 增加至 120 h，活性炭的吸附能力有总体下降的趋势。竹质生物质真空化学活化原料的最佳浸渍时间为 24 h。3结论(1)以竹质生物质为原料、氯化锌为活化剂，采用真空化学活化法制备竹质生物质活性炭。所得活性炭产品对碘和亚甲基蓝的吸附值均较大，碘吸附值最高达 1314 04 mg/g，亚甲基蓝吸附值最高达 321 07 mg/g。所得活性炭具有较高的碘吸附值和亚甲基蓝吸附值，因而适宜用于气相吸附和液相吸附。(2)实验最佳制备条件为:浸渍比 150%，浸渍时间 24 h，活化温度为 600，活化时间为 60 min。参考文献 1Ahmed Hared I，Dirion J L，Salvador S，et al Pyrolysis of wood im-pregnated with phosphoric acid for the production of activated carbon:kinetics and porosity development studies J Journal of Analytical andApplied Pyrolysis，2007，79(1 2):101 105 2李东艳，周花蕾，田亚峻，等 用无烟煤制备高比表面积活性炭的研究J 稀有金属材料与工程，2007，36(S1):583 586 3马蓉，张丽芳，张双全，等 太西无烟煤制备微孔活性炭的实验研究 J 新型炭材料，2004，19(1):57 60 4解立平，林伟刚，扬学民 城市固体有机废弃物制备中孔活性炭。过程工程学报，2002，2(5):465 469 5周建斌，张齐生 磷酸复合活化剂法制竹屑活性炭的研究J 林产化学与工业，2003，23(4):59 62 6马柏辉，叶李艺，张会平，等 氯化锌法制备竹活性炭J 厦门大学学报:自然科学版，2004，43(5):669 671 7彭金辉，樊希安，王尧，等 微波辐射竹节磷酸法制备活性炭的研究 J 林产化学与工业，2004，24(1):91 94 8樊希安，彭金辉，秦文峰，等 微波辐射在制备竹节活性炭中的应用研究 J 离子交换与吸附，2003，19(3):254 261 9樊希安，彭金辉，秦文峰，等 微波辐射处理竹节废料制备活性炭研究J 林产化学与工业，2003，23(3):56 60 10 A Bacaoui，A Dahbi，A Yaacoubi，et al Experimental design tooptimize preparation of activated carbons for use in water treatment En-vironmental Science Technology，2002，36(17):檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵3844 3849(上接第 78 页)3Tutar Y，Song Y，Masison，DC Primate chaperones Hsc70(constitu-tive)and Hsp70(induced)differ functionally in supporting growth andprion propagation in Saccharomyces cerevisiaeJ Genetics，2006，172:851 861 4Alberti S，Halfmann R，King O，et al A Systematic Survey IdentifiesPrions and Illuminates Sequence Features of Prionogenic ProteinsJ Cell，2009，137:146 158 5Liu J，Sondheimer N，Lindquist SL Changes in the middle region ofSup35 profoundly alter the nature of epigenetic inheritance for the yeastprionPSI+J Proc Natl Acad Sci，2002，99(4):16446 16453 6Bach S，Talarek N，Andrieu T，et al Isolation of drugs active againstmammalian prions using a yeast based screening assayJ Nat Bio-technol，2003，21:1075 1081 7Derdowski A，Sindi S，Klaips CL，et al A Size Threshold Limits PrionTransmission and Establishes Phenotypic DiversityJ Science，2010，330:680 683 8Song Y，Song Y，Zhong Z，et al Illuminating precise quantification inyeast based model for antiprion compounds screening C 2010 FirstInternational Conference on Cellular，Molecular Biology，Biophysicsand Bioengineering Qiqihar:Institute of Electrical and Electronics En-gineers，2010:296 299 9Kryndushkin DS，Alexandrov IM，Ter Avanesyan MD，et al YeastPSI+prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmen-ted by Hsp104J J Biol Chem，2003，278:49636 49643 10 Halfmann R，Lindquist SL Screening for amyloid aggregation by semi denaturing detergent agarose gel electrophoresisJ J Vis Exp，2008，17(1):1 4 11 Wickner RB Evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae:the URE3non Mendelian genetic element as an altered URE2 pro-teinJ Science，1994，264:566 569 12 Song Y，Wu Y，Jung G，et al Role for Hsp70 chaperone in Saccharo-myces cerevisiae prion seed replicationJ Eukaryot Cell，2005，4:289 297