云师大植物生理学.doc

本科学生综合性实验报告

学号： 114120146 姓 名： 段霞飞
学院： 生命科学学院 专业、班级：11级生物科学C班
实验课程名称：光合色素的提取、理化性质、分离、吸收光谱
及含量的测定
教 师： 李忠光
开 课 学 期： 2013 至 2014 学年 第二 学期
填 报 时 间： 2014 年 4 月 21 日

云南师范大学教务处编印

一．实验设计方案
实验序号
实验二
实验名称
光合色素的提取、理化性质、分离、吸收光谱及含量的测定
实验时间
2014年3月、4月
实验室
睿智3栋 428
（一）实验目的
1、掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。
2、掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。
3、掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。

（二）实验原理及实验流程或装置示意图
I 光合色素的提取与理化性质：
光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。
提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。
离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物。
叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。
叶绿素分子中Mg2+与仆啉环结合不稳定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等离子所取代。
II 光合色素的分离与吸收光谱：
光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。
不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对它们的吸附力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。
叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收，主要是红光和蓝紫光。
III 光合色素含量的测定
混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重叠，仍然可以根据Lambert-Beer定律（A = k L C）求出各组分含量。Lambert定律：A = k L；Beer定律A = k C。叶绿素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分别为663nm、645nm，由此得出：见推导过程
Ca = 12.7 A663 – 2.69 A645；Cb = 22.9 A645 – 4.68 A663
Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A64
（三）实验设备及材料
1、主要实验用具和仪器
研钵、试管、滤纸﹑三角瓶﹑天平﹑滤纸条﹑分光光度计﹑离心机﹑离心管﹑A4纸﹑吸管。
2、药瓶和试剂
CaCO3﹑石英砂﹑丙酮﹑20%KOH甲醇溶液﹑苯﹑50%醋酸﹑醋酸铜粉末﹑四氯化碳﹑80%苯丙。
3、实验材料：植物绿色叶片

(四)、实验方法步骤
I 光合色素的提取与理化性质
光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，准确称取2 g，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。
观察荧光现象：与光线垂直的方向观察色素颜色。
光破坏作用：1ml色素提取液于室内，1ml于太阳光下，30min后观察颜色变化。
皂化反应：取一支试管，加入色素提取液2.5ml，再加入30%KOH甲醇溶液1ml，摇匀，再加入苯2.5ml，轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水1ml，轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的变化。
取代反应：取一支试管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶液变为黄褐色。倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，酒精灯上加热，与另一半比较颜色的差异。
吸收光谱的变化：皂化和取代反应后的色素进行吸收光谱分析。

II 光合色素的分离与吸收光谱
光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，准确称取2 g，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。
光合色素分离：剪取适当长度和宽度的滤纸条→ 用上行纸层析法分离色素→ 启动剂：石油醚：丙酮：苯=10：2：1。
吸收光谱的测定：
光合色素的吸收光谱：取色素溶液1 mL，加入丙酮3 mL，摇匀后在分光光度计上400到700 nm处每隔10 nm进行扫描。
各色素的吸收光谱：上述层析出的3~4种色素，分别剪下后溶于3 mL丙酮中，按上述方法扫描。

III 光合色素含量的测定
方法一：快速测定法
由于叶绿素a、b在652nm处有共同吸收，k = 34.5 L g-1. cm-1。可直接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，最后浓度单位为mg/dm2。
方法二: 分光光度计法
色素提取：将上述植物叶片洗净并用滤纸吸干，准确称取已知Φ的叶圆片0.05g左右，加入少许CaCO3和石英砂及80%丙酮2ml，充分研磨，转入离心管中（离心机使用），再用5ml 80%丙酮洗研钵，转入离心管中，平衡，5000rpm离心10min, 记录上清液体积，取1ml稀释到4ml。
测定：以1cm比色皿分别测定A663、A645。使A控制在0.1 ~ 0.8之间。

(五) 、实验结果与讨论
1、实验现象数据及观察结果：
光合色素含量测定
实验数据及计算
三类色素浓度:
=0.862
=0.418A
由公式:
=9.822mg/L
=5.538mg/L

各叶绿素含量：
V=10ml
W=0.05g
由公式：

叶片面积：
GSM=70-105
W=0.47g
由公式： 叶面积=0.0067—0.0045（m2）

观察结果：
（1）可以观察到荧光现象，因为在提取液中无任何的电子受体，因此可以观察到荧光现象。
（2）皂化反应后的颜色分为三层.上层的颜色为黄色，中间层的颜色为绿色，下层的为墨绿色.
（3）在取代反应后的颜色为黄褐色。
2、对实验现象、数据及观察结果的分析与讨论：
（1） 之所以发生荧光现象，叶绿体色素在透射光呈绿色，在反射光下呈紫色，这是由于叶绿体色素主要吸收自然光汇中的红橙光和蓝紫光，未被吸收的光线透射过叶绿体色素溶液，呈现出绿色；在可见光下，叶绿体色素受激发，再从激发态跃迁到基态的过程中发出荧光，故反射光为深紫色。
（2）在向2-3ml叶绿体色素溶叶中加20%KOH甲醇溶液后，溶液立即转化为黄褐色，稍微有点浑浊，不断震荡 3min 后溶液变澄清，颜色 呈深黄绿色。分析：对于这一现象，我们查阅相关资料后明白，向叶绿体色素溶液中氢氧化钾的甲醇溶液后，如不将此溶液立即混匀，则两种溶剂 界面处的叶绿素分子会发生分子内的结构改变，可能是 V 环 C10 的氢 原子转移到 C9 的氧原子上，形成了羟基，双键的位置则转移到 C9 与 C10 之间。正由于叶绿素分子的这种由酮式向烯醇式的变构,所以其颜 色由绿色变为棕色。同时，C9 的羟基又可与氢氧化钾发生反应而生成 钾盐，颜色也呈棕色。1 V环在实验和对照的两支试管分别再加入 3ml 乙醚和 4ml 蒸馏水，两试管溶液均分为两层.
（4）其颜色由下至上分别为黄绿色、 黄色、 橙黄色，由资料可知由下至上依次为叶绿素 b、叶绿素 a、叶黄素、胡萝卜素； 其中蓝绿色条带最宽，黄绿色条带次之，黄色、橙黄色条带较细，说明叶绿体中含量较多的是叶绿素 a 和叶绿素 b。 另外，在距这四条条带较远处，有一条黄色的条带，查阅资料得到，这是 叶绿素的降解产

(六) 、注意事项
（1）在观察荧光现象时试管的液体要要与光线垂直的方向观察色素的颜色。
（2）在研磨时不宜加入过多的CaCO3和石英砂，研磨时间不宜过长，以免破坏叶绿体。
（3）在色素分离中，滤纸条的长度和宽度适度，过长会侵入到缓冲液中，过宽会触到水管内壁。
（4）在皂化反应中只能用20%KOH甲醇溶液，而不能用20%KOH水溶液.色素只溶于具有极性有机溶剂.

(六) 、思考题
1、为什么在皂化反应中只能用20%KOH甲醇溶液，而不能用20%KOH水溶液？答：因为色素不能溶于水，甲醇其实在这里只是当做溶剂使用，化学中有“相似相容”，色素是有机物所以只能溶于有机溶剂
2、 光合色素的吸收光谱对我们理解光合作用有何意义？
答：叶绿体色素的吸收光谱的来年改革峰值分别在430nm左右和660nm左右。基本不吸收绿光，因而绿光被反射而是叶子（大部分）显绿色。也就是说主要吸收这些波长的光的能量在叶绿体内合成植物所需要的物质。
3、试论述高等植物光合色素的种类和生理功能
答：植物含有几种类型的叶绿素，它们之间的差别在于烃侧链的不同。大多数能进行光合作用的细胞还有第二种类型的叶绿素，即叶绿素b 或叶绿素c。在高等植物的细胞中含有叶绿素b,而在其它一些类型的细胞中含有叶绿素c。不同类型的叶绿素对光的吸收也是不同的，如叶绿素a最大的吸收光的波长在420～663nm,叶绿素b 的最大吸收波长范围在460～645nm。当叶绿素分子位于叶绿体膜上时，由于叶绿素与膜蛋白的相互作用，会使光吸收的特性稍有改变。
4、一般正常的植物叶片，Chla / Chlb = 3 / 1，你所测定的结果符合此比例吗？为什么？
答：我算出的结果大约为2:1,我所测出的结果不符合，我想原因可能是在我们采集叶片时有用的叶片的差异，因为在同一片叶子上的不同部位叶绿素的含量是不同的.
5、 两种测定方法含量有何不同？为什么？
答：快速测定法用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，局部含量测定。比较准确，但不便于整体测定，取样多次平均值也不能代表整体叶绿素含量；分光光度计法采用低杂散光,高分辨率的单光束单色器,保证了波长准确度.波长重复性和更高的分辨率 ,自动调0%T和100%T,自动调波长用多种方法的数据处理功能 ,高分辨,宽大的样品糟,可容纳100mm,光径吸收池和相应的反射附件 ,仪器配有标准的RS-232双向通讯接口,可外接打印机,打印相应的实验数据. 个性代的外形设计,轻触式按键使操作更为方便. 可见分光光度计广泛应用于医药,卫生,化工,学校,生物化学,石油化工,质量控制,环境保护及科研实验室等化学分析.

(七) 、实验小结
本次试验持续时间较长，在试验中我们通过试验的过程对光合作用的过程进一步的加深了解.通过本次试验，我们知道光和色素在高等植物中有着重要的作用，光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对它们的吸附力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收，主要是红光和蓝紫光。混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重叠，仍然可以根据Lambert-Beer定律（A = k L C）求出各组分含量。Lambert定律：A = k L；Beer定律A = k C。叶绿素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分别为663nm、645nm，光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物。叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。
成功之处：本次实验的成功之处是我们通过合作的方式完成实验，并且获得了一些实验数据，还用分光光度计弄出吸收光谱图，通过吸收光谱图更加的了解高等植物的色素种类。
不足之处：在研磨是可能因为我们选择的叶子不同，导致结果不一样。

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