奶牛乳腺上皮细胞系的建立.pdf

畜牧兽医学报2 0 0 9，加(5)：7 4 3 7 4 7A c t aV e t e r i n a r i ae tZ o o t e c h n i c aS i n i c a奶牛乳腺上皮细胞系的建立陈建晖，佟慧丽，李庆章，高学军(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨1 5 0 0 3 0)摘要：采用组织块种植法，成功地培养了奶牛乳腺上皮细胞，并利用细胞角蛋白1 8 的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行了鉴定。通过对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状的检测，建立并鉴定了正常培养的奶牛乳腺上皮细胞系，细胞传至2 0 代以上时仍保持旺盛的增殖活力。通过对细胞传代及反复冻存，建立了奶牛乳腺上皮细胞系，获得了大量的乳腺上皮细胞。关键词：奶牛；乳腺上皮细胞；细胞系中图分类号：S 8 2 3 9 1文献标识码：A文章编号：0 3 6 6 6 9 6 4(2 0 0 9)0 5-0 7 4 3 0 5E s t a b l i s h m e n to fD a i r yC o wM a m m a r yG l a n dE p i t h e l i a lC e l lL i n eC H E NJ i a n-h u i，T O N GH u i l i，L IQ i n g-z h a n g，G A OX u e-i u n(K e yL a b o r a t o r yo fD a i r yS c i e n c eo fM i n i s t r yo fE d u c a t i o n，N o r t h e a s tA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y，H a r b i n1 5 0 0 3 0，C h i n a)A b s t r a c t：T i s s u em a s si n o c u l a t i o nm e t h o dw a su s e di nt h i ss t u d y，a n dm a m m a r ye p i t h e l i a lc e l l so fd i a r yC O Ww e r es u c c e s s f u l l yc u l t i v a t e d，m a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sw e r ei d e n t i f i e du s i n gc y t o k e r a t i n1 8i m m u n o f l u o r e s c e n c es t a i n i n g T h es u r v i v a lr a t eo fc e i l si n o c u l a t i o n，d o u b l i n gt i m eo fc e l lp o p u l a t i o n，g r o w t hc u r v e，m o r p h o l o g i c a la n db i o l o g i c a lc h a r a c t e rw e r ed e t e c t e d，a n di d e n t i f i c a t i o na n de s t a b l i s h m e n to fn o r m a lc u l t u r e dd a i r yC O Wm a m m a r ye p i t h e l i a lc e l l l i n e sw e r es e tu p，c e l lc o u l db ep a s s a g e d2 0g e n e r a t i o n sw i t hag o o db e h a v i o ro fp r o l i f e r a t i o n T h r o u g ht h ec e l lp a s s a g ea n dr e p e a t e d l yf r e e z e-t h a w，d a i r yC O Wm a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l ll i n e sw e r ee s t a b l i s h e d，a n dal a r g en u m b e ro fm a m m a r ye p i t h e l i a lc e l l sw e r ea c q u i r e d K e yw o r d s：d a i r yC O W；m a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l；c e l ll i n e乳腺上皮细胞具有合成和分泌乳汁的功能，是制作乳腺生物反应器的靶细胞，体外培养的能合成和分泌乳蛋白的乳腺上皮细胞具有方便、快捷且真实反映乳腺在体内表达水平的功能 1 。国际上对奶牛乳腺上皮细胞培养的研究较早，其培养方法较复杂，传代次数较少，尚处于初步研究，极少商品化 2-5。国内对奶牛乳腺上皮细胞的培养也进行了一些探索降引，但体外培养的细胞传代次数有限，没有获得正常的奶牛乳腺上皮细胞系。因此，奶牛乳腺上皮细胞系的建立，将为奶牛乳腺发育学、乳腺病理学、乳腺生物工程学等相关研究奠定良好的基础，对进一步了解泌乳的调控机理以及验证乳腺表达载体具有重要的意义。本研究中成功建立了奶牛乳腺上皮细胞系，获得了大量的乳腺上皮细胞，为进一步在此方面的深入研究提供了理论依据。l 材料与方法1 1 试验材料乳腺组织来自哈尔滨市成高子屠宰场屠宰的泌乳后期健康的荷斯坦奶牛。收疆日期：2 0 0 8 0 3-2 4基金项目：科技部“8 6 3”项目(2 0 0 6 A A l 0 2 1 A 4)作者简介：陈建晖(1 9 8 1 一)，男，河南人，硕士生。主要从事基础兽医学研究，E m a i l：c h e n j i a n h u i 一2 0 0 5 1 2 6 C O I T I*通讯作者：高学军(1 9 6 9 一)，男，黑龙江人，教授，博导，主要从事乳业生物技术研究。T e l：0 4 5 1 5 5 1 9 0 2 4 4，E-m a i l：g a o x j 5 3 9 0 s i n a c 咖 万方数据7 4 4畜牧兽医学报1 2 主要试剂表皮生长因子、胰岛素、牛酪蛋白标准品均购自S i g m a 公司，优质胎牛血清、D F l 2 培养基均购自G i b c o 公司；细胞角蛋白1 8 抗体购自德国A c r i s 公司；其他常规试验药品及试剂均为国产。1 3 主要仪器C 0：培养箱(日本C O-1 5 0 型)；D F C 2 8 0 倒置相差显微镜(德国L E I C A)；T CS P 2A O B S 激光扫描共聚焦显微镜(德国L E I C A)；C A S Y 细胞活力分析仪(德国L E I C A)；其他仪器均为国产。1 4 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养无菌取倚斯坦奶牛乳腺组织，取材按常规手术消毒乳房中部，切取少量乳腺组织块，置于含有5 胎牛血清的D F l 2 培养液的小瓶中，于冰盒中迅速带回实验室，在超净工作台上分离修剪，用胁H a n k s 液洗组织块3 5 次，直到洗净为止，尽量剥离脂肪组织和结缔组织，将呈白色颗粒状的腺泡组织尽量剪碎，组织块大约为1m m 3，用吸管将组织块以适量的密度接种于铺有0 5 胶原活性蛋白的培养瓶中，加入3m L1 5 D F l 2 完全培养液，于5 C 0。培养箱中3 7 培养。1 5 奶牛乳腺上皮细胞的传代培养和纯化原代细胞培养至第3 天时，对细胞进行换液，以后每隔1d 换液1 次，培养至第6 天左右时，少量成纤维细胞开始从组织块周围出现，1 0d 左右时乳腺上皮细胞开始从组织块周围生长，单层细胞融合至培养底壁的9 0 左右，吸出原有培养液，根据上皮细胞与成纤维细胞对胰蛋白酶消化敏感性不同，在混合生长的原代或传代细胞培养物中，经过0 2 5o A胰蛋白酶的D-H a n k s 液，3 7 消化，在倒置显微镜下观察，待成纤维细胞质回缩，细胞问隙增大。脱离瓶壁时，加培养液终止消化，将酶液倾出，离心后得到的大部分是成纤维细胞。3 5 次选择传代，弃掉组织块，可得到纯化的乳腺上皮细胞。1 6 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定应用免疫荧光细胞染色法检测纯化后乳腺上皮细胞角蛋白1 8 的表达情况，激光共聚焦显微镜下观察，一抗染细胞角蛋白，P I 染核，细胞中的角蛋白1 8染成绿色，细胞核染为红色，方法参考文献 9 。1 7 奶牛乳腺上皮细胞生物性状的检测根据每天对细胞生长情况的观察，记录奶牛乳腺上皮细胞的生长特性和细胞形态的差异，对乳腺上皮细胞做生物学性状的检测。细胞形态学观察、生长曲线、细胞接种存活率、细胞群体倍增时间、细胞的冻存和复苏参照佟慧丽等的报道1 0 。2 结果与分析2 1奶牛乳腺上皮细胞的原代培养当奶牛乳腺组织块培养到第6 天时，成纤维细胞从组织块周围长出(图1-A)，当组织块培养到第1 0 天时，可看到成纤维细胞和乳腺上皮细胞的混合生长(图l-B)。2 2 奶牛乳腺上皮细胞的传代培养和纯化根据成纤维细胞和乳腺 皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同，可得到纯化的奶牛乳腺上皮细胞(图l-C)和纯化的成纤维细胞(图卜D)。2 3 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定应用激光共聚焦显微镜观察，结果显示分离培养的乳腺上皮细胞角蛋白1 8 的表达呈阳性(图2，图3)。2 4 奶牛乳腺上皮细胞生物性状的检测2 4 1细胞形态学观察在细胞进行传代过程中，出现了不规则的多边形奶牛乳腺上皮细胞(图1 一E)、长形乳腺上皮细胞(图1 一F)、蜂窝状的乳腺上皮细胞(图l-G)、圆顶型的乳腺上皮细胞(图1 一H)、含有丰富乳滴的乳腺上皮细胞(图1-I，1 一J)和细胞出现含有2 6 个核仁的乳腺上皮细胞(图1-K)、拉网结构的乳腺上皮细胞(图卜L)、岛屿状的乳腺上皮细胞(图1 一M)，当细胞生长非常紧密时，出现细胞抑制现象(图1-N)，当细胞传到2 0 代时，细胞为长梭形(图l 一0)。2 4 2 细胞生长曲线以培养时间为横坐标，3 孔细胞数的平均值为纵坐标绘制奶牛乳腺上皮细胞生长曲线(图4)。细胞生长曲线显示：奶牛乳腺上皮细胞生长延迟期为O 5d，对数生长期为5 9d，9d 后进入平台期。结果表明，培养的奶牛乳腺上皮细胞具有正常的分裂增殖特性，符合细胞生长的生物学规律。2 4 3 细胞接种存活率用对数生长期的细胞，通过消化法制成细胞悬液，C A S Y 细胞活力分析仪计数后，按每平皿5 7 1 0 5 个细胞接种，每组3 平皿。每2h 消化计数1 组已贴壁细胞，共观察2 4h，分1 2次进行。结果表明，细胞贴壁率及存活率在2 4h 内逐渐升高，并达到最高值9 2 以上，说明细胞的生存及贴壁能力较强(表1)。万方数据5 期陈建晖等：奶牛乳腺上皮细胞系的建立7 4 5A 第6 天组织块周围出现成纤维细胞(1 0 0)；B 第1 0 天左右组织块周围长出的乳腺上皮细胞和成纤维细胞混合牛长(1 0 0)；C 纯化的乳腺上皮细胞(2 0 0)；D 纯化的成纤维细胞(2 0 0)；E 不规则多边形乳腺上皮细胞(2 0 0)；F 长形的乳腺卜皮细胞(2 0 0 X)；G 蜂窝状的乳腺卜皮细胞(1 0 0 X)；H 圆顶型的乳腺卜皮细胞(2 0 0)；1 含乳滴的乳腺上皮细胞(2 0 0)；J 含乳滴的乳腺上皮细胞(1 0 0)；K 含2 6 枚核t：的乳腺上皮细胞(2 0 0 X)；L 拉网结构的乳腺上皮细胞(2 0 0)；M 岛屿状乳腺上皮细胞(1 0 0 X)；N 抑制现象的乳腺上皮细胞(2 0 0)；O 2 0 代处于分化状态的乳腺上皮细胞(2 0 0)A F i b r o b l a s t sa t6“d a y(1 0 0)；t gM a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sa n df i b r o b l a s t sa t1 0“d a y(1 0 0)；C M a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sp u r i f i e d(2 0 0 X)；D F i b r o b l a s t sp u r i f i e d(2 0 0)；E I r r e g u l a rp o l y g o n(2 0 0X)；F E l o n g a t em a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l s(2 0 0X)；G A l v e o l a t em a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l s(1O OX)；H D o m e l i k em a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l s(2 0 0)；I M a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sw i t he m u l s i o nd r o p s(2 0 0X)；J M a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sw i t he m u l s i o nd r o p s(10 0)；K M a m-m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sw i t h2-6n u c l e o l u s(2 0 0X)；L R e t i c u l a t em a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l s(2 0 0)；M M a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sl i k ei s l a n d s(1 0 0)；N M a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sr e s t r a i n e d(2 0 0X)；0 D i f f e r e n t i a t i o nm a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sa t2 0p a s s a g e s(2 0 0X)图1奶牛乳腺上皮细胞形态F i g 1S h a p eo fd i a r yC O wm a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l s图28 代乳腺上皮细胞角蛋白1 8 染色2 0 0 XF i g 2C e r a t i n1 8s t a i n i n go fm a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sa t8p a s s a g e s2 0 0X图32 0 代乳腺上皮细胞角蛋白1 8 染色1 0 0 F i g 3C e r a t i n1 8s t a i n i n go fm a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l sa t2 0p a s s a g e s1 0 0 万方数据7 4 6畜牧兽医学报4 0 卷,-1昌七童邑兽口越亏稍。霎最图4 奶牛乳腺上皮细胞生长曲线F i g 4G r o w t hc u r v eo fd a i r yC O Wm a m m a r yg l a n de p i t h e l i a lc e l l表1 细胞接种存活率(接种细胞数5 7 1 0 5 m L)T a b l elC e l lp l a n t i n gs u r v i v a le f f i c i e n c y(i n n o c u l a t i o nc e l lp o p u l a t i o n5 7 1 0 5 m L)接种时间h 贴壁平均细胞数(1 0 5)细胞存活率2 4 4 细胞群体倍增时间随着时间的增加，细胞群体倍增时间逐渐减少；培养到第7 天时细胞群体倍增时间达到最短，表明此时细胞增殖能力最强；随后细胞倍增时间逐渐增加(表2)。裹2 细胞群体倍增时间(接种细胞数3 1 0 5 m L)T a b l e2C e l lp o p u l a t i o nd o u b l i n gt i m e(i n n o c u l a t i o nc e l lp o p-a l a t i o n3 1 0 5 m L l接种时间h 贴壁平均细胞数(1 0 5)群体倍增时间h2 4 5 细胞活力检测对不同代数奶牛乳腺上皮细胞反复进行冻存，冻存复苏后检测到细胞活力均达8 9 以上，细胞接种率达9 2 以上。且复苏后的奶牛乳腺上皮细胞密度较大，形状规则，边缘整齐，折光率好，贴附于培养底壁上，具有良好的贴壁及生长趋势(图5，图6)。图5 复苏0h 后的乳腺上皮细胞1 0 0 F 嘻5R e s u s c i t a t i o no fm a m m a r yg l a n dc e l l sa f t e r0h o u r1 0 0 圈6 复苏2 4h 后的乳腺上皮细胞2 0 0 F 唔6R e s u s c i t a t i o no fm a m m a r yg l a n dc e l l sa f t e r2 4h o u r s2 0 0 3 讨论有泌乳功能的乳腺上皮细胞系既可以用来研究乳蛋白基因表达及乳汁分泌机制 9 ，又可以作为研究于乳期细胞凋亡及乳腺退化的宝贵材料。但奶牛乳腺上皮细胞的体外培养比较困难，给乳腺上皮细胞分化增殖的进一步研究带来极大不便。本研究发现，要想获得较纯的奶牛乳腺上皮细胞，取材是最关键的一步，由于乳腺组织与其它组织的颜色、界限分辨不是十分清晰，所以取材过程中一定要特别避免淋巴结、肌腱、脂肪等非乳腺组织的掺入，从而避免培养过程中淋巴细胞和成纤维细胞的污染。此外，在妊娠的中晚期或哺乳期，乳腺腺泡数量最多，是乳腺上皮细胞取材的最佳时期。乳腺上皮细胞生物学功能的分化取决于细胞与细胞外基质的相互作用，应用鼠尾胶原或胶原蛋白处理过的培养皿进行乳腺上皮细胞的原代培养已经成为一种普遍采用的方法，胶原蛋白对于原代乳腺细胞培养时细胞的贴壁和展开都有促进作用H。8“2 1，本试验使用的0 5 的胶原蛋白铺底对 万方数据5 期陈建晖等：奶牛乳腺上皮细胞系的建立7 4 7原代乳腺上皮细胞的贴壁和展开具有明显作用，获得了较理想的培养效果。另外，体内多种激素成分共同作用于乳腺组织，促进上皮细胞的生长及分化，缺乏任何一种因子或激素，其它激素也会部分或全部失去作用D 3 3，胰岛素能增加乳腺上皮细胞的贴壁率和伸展H4|，氢化可的松对维持乳腺上皮细胞的生长也是必需的，正常乳腺上皮细胞的增殖分化涉及到类固醇、生长因子、胰岛素、结合蛋白及细胞外基质的相互作用 1 引，本试验选用的含1 5 的胎牛血清、5 肛g m L _ 1 胰岛素、5p g m L _ 1 表皮生长因子、1“g m L-1 氢化可的松、1 0 0I U m L-1 青链霉素的D M E M F 1 2 培养液，细胞增殖分化良好，活力旺盛，能够传至2 0 代以上，说明此培养液是乳腺上皮细胞较为理想的培养液。乳腺上皮细胞的原代培养方法主要为组织块接种法和胶原酶消化法，本试验在奶牛乳腺上皮细胞的原代培养时，也试图用胶原酶消化法或奶汁进行培养，均未获得成功，这与R o s e 等报道的不一致 2 ，这可能是与胶原酶适时消化的程度和乳腺取材有很大关系，用组织块接种法成功的获得了纯化的奶牛乳腺上皮细胞，但组织块长出乳腺上皮细胞的时间较晚，在6d 时，看到长形的成纤维细胞从组织块周围长出，1 0d 时，看到乳腺上皮细胞从组织块周围出现，与杜娟等报道相似 7 ，乳腺上皮细胞能够反复冻存和复苏，获得了大量的奶牛乳腺上皮细胞，这主要与选用的冻存保护液中添加了较强保护能力的H E P E S 有关 1 引。建立正常的奶牛乳腺上皮细胞系，结果较理想。当细胞传代到2 0 代时，失去了乳腺上皮细胞的形态，逐渐趋向于长梭形，但细胞分化增殖良好，其分化的细胞是否具有乳蛋白的基因表达还有待进一步探讨。参考文献：1 X UMN，L ISG，Z H A OJY，e ta 1 T h ed e t e c t i o nm e t h o do fm a m m a r yg l a n db i o r e a c t o re x p r e s s i o nv e c t o r E J B i o t e c h n o lB u l l，2 0 0 3，5：2 3 2 6 2 R O S EMT，A S OH，Y O N E K U R AS，e ta 1 I nv i t r od i f f e r e n t i a t i o no fac l o n e db o v i n em a m m a r ye p i t h e l i a lc e l l E J JD a i r yR e s，2 0 0 2，6 9(3)：3 4 5 3 5 5 3 S A K A M o T oK，K O M A T S UT，K O B A Y A S H IT，e ta 1 G r o w t hh o r m o n ea c t so nt h es y n t h e s i sa n ds e-c r e t i o no fa l p h a c a s e i ni nb o v i n em a m m a r ye p i t h e l i a lc e l l s F J JD a i r yR e s，2 0 0 5，7 2(3)：2 6 4 2 7 0 4 B U E H R I N GGC C u l t u r eo fm a m m a r ye p i t h e l i a lc e l l sf r o mb o v i n em i l k J D a i r yS c i，19 9 0，7 3：9 5 6 9 6 3 5 W E L L N I T ZO，K E R RDE C r y o p r e s e r v e db o v i n em a m m a r yc e l l st Om o d e le p i t h e l i a lr e s p o n s et Oi n f e e t i o n J V e tI m m u n o lI m m u n o p a t h o l，2 0 0 4，1 0 1(3 4)：1 9 1 2 0 2 6 王亨，韩超，邱昌伟，等体外培养奶牛乳腺上皮细胞的形态学观察 J 中国兽医杂志，2 0 0 7，4 3(6)：1 5 1 7 7 杜娟，狄和双，王根林奶牛乳腺上皮细胞系的建立及高温对细胞超微结构的影响 J 生物工程学报，2 0 0 7，2 3(3)：4 7 1-4 7 6 8 多曙光，吴应积，罗奋华，等牛乳腺上皮细胞的分离培养及其生物学特性口 动物学研究，2 0 0 6，2 7(3)：2 9 9-3 0 5 9 W H E E L E RTT，C A L L A G H A NMR，D A V I SSR，e ta 1 M i l kp r o t e i ns y n t h e s i s，g e n ee x p r e s s i o n，a n dh o r m o n a lr e s p o n s i v e n e s si np r i m a r yc u l t u r e so fm a m m a r yc e l l sf r o ml a c t a t i n gs h e e p J E x pC e l lR e s，1 9 9 5，2 1 7(2)：3 4 6-3 5 4 1 0 佟慧丽，尹德云，高学军，等奶山羊乳腺上皮细胞系的建立中国科技论文在线，2 0 0 7，2 0 0 7 0 5 0 6(h t t p：w w w p a p e r e d u c n)11 3V I A N D E RB，A L A u 0 T I L AS，J A L K A N E DM，e ta 1 V i a b l eA C 一2，an e wa d u l tb o v i n es e r u m a n dc o l o s t r u m b a s e ds u p p l e m e n tf o rt h ec u l t u r eo fm a m m a l i a nc e l l s J B i o t e c h n i q u e s，1 9 9 6，2 0：7 0 2 7 0 7 1 2 L I NCQ，B I S S E L LMJ M u l t i f a c e t e dr e g u l a t i o no fc e l ld i f f e r e n t i a t i o nb ye x t r a c e l l u l a rm a t r i x J T h eF A S E BJ o u r n a l，1 9 9 3，(7)：7 3 7 7 4 3 1 3 1B U L L O C KLP，B A R T H EPL，M O W A Z O W I C ZI，e ta 1 T h ee f f e c t so fp r o g e s t i n so ns u b m a x i l l a r yg l a n de p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r：d e m o n s t r a t i o no fa n d r o g e n i c，s y n a n d r o g i e n i ca n da n t i a n d r o g e n i ca c t i o n s J E n d o c r i n o l o g y，1 9 7 5，9 7：1 8 9 1 9 5 1 4 L A M O T El，M E Y E RE，M A S S A R T-L EAM，e ta 1 S e xs t e r o i d sa n dg r o w t hf a c t o r si nt h er e g u l a t i o no fm a m m a r yg l a n dp r o l i f e r a t i o n，d i f f e r e n t i a t i o n，a n di n v o l u t i o n E J S t e r o i d s，2 0 0 4，6 9：1 4 5 1 5 9 1 5 W O O D W A R DTL，X I EJ，F E N D R I C KJL，e ta 1 P r o l i f e r a t i o no fm o u s em a m m a r ye p i t h e l i a lc e l l si nv i t r o：I n t e r a c t i o n sa m o n ge p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r，i n s u l i n-l i k eg r o w t hf a c t o r-i，o v a r i a nh o r m o n e s，a n de x t r a c e l l u l a rm a t r i xp r o t e i n s J E n d o c r i n o l o g y，2 0 0 0，1 4 1(1 0)：3 5 7 8 3 5 8 6 万方数据奶牛乳腺上皮细胞系的建立奶牛乳腺上皮细胞系的建立作者：陈建晖，佟慧丽，李庆章，高学军，CHEN Jian-hui，TONG Hui-li，LI Qing-zhang，GAO Xue-jun作者单位：东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,哈尔滨,150030刊名：畜牧兽医学报英文刊名：ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA年，卷(期)：2009,40(5)被引用次数：3次 参考文献(15条)参考文献(15条)1.VIANDER B;ALA-UOTILA S;JALKANED M Vfable AC-2,a new adult bovine serum-and colostrum-basedsupplement for the culture of mammalian cells 19962.佟慧丽;尹德云;高学军 奶山羊乳腺上皮细胞系的建立 20073.XU M N;LI S G;ZHAO J Y The detection method of mammary gland bioreactor expression vector 20034.WHEELER T T;CALLAGHAN M R;DAVIS S R Milk protein synthesis,gene expression,and hormonalresponsiveness in primary cultures of mammary cells from lactating sheep外文期刊 1995(02)5.多曙光;吴应积;罗奋华 牛乳腺上皮细胞的分离培养及其生物学特性期刊论文-动物学研究 2006(03)6.杜娟;狄和双;王根林 奶牛乳腺上皮细胞系的建立及高温对细胞超微结构的影响期刊论文-生物工程学报2007(03)7.王亨;韩超;邱吕伟 体外培养奶牛乳腺上皮细胞的形态学观察期刊论文-中国兽医杂志 2007(06)8.LIN C Q;BISSELL M J Muhifaceted regulation of cell differentiation by extracellular matrix1993(07)9.WELLNITZ O;KERR D E Cryopreserved bovine mammary cells to model epithelial response to infection外文期刊 2004(3-4)10.BUEHRING G C Culture of mammary epithelial 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Huili.YIN Deyun.LI Qingzhang.GAO Xuejun 奶山羊乳腺上皮细胞系的建立期刊论文-东北农业大学学报2008,39(8)3.刘玮.董雅娟.柏学进.王文明.张守宝.董懿为 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养及分子生物学鉴定期刊论文-安徽农业科学2010,38(6)4.富国文.武海军.靳亚平 消化法培养山羊乳腺上皮细胞期刊论文-安徽农业科学2007,35(24)5.刘镜.何光中.孔德顺.何金平 贵阳市奶牛小区奶牛繁殖性能调查期刊论文-畜牧与兽医2011,43(6)6.王月影.李宏基.钟凯.王艳玲.WANG Yue-ying.LI Hong-ji.ZHONG Kai.WANG Yan-ling 生长抑素对泌乳大鼠乳腺发育的作用期刊论文-江西农业学报2008,20(8)7.张峰.吴占军.张新同.王昆.王学清.马书林.刘小虎.ZHANG Feng.WU Zhan-jun.ZHANG Xin-tong.WANG Kun.WANGXue-qing.MA Shu-lin.LIU Xiao-hu 二氢吡啶对热应激奶牛产奶量以及奶牛体温、呼吸频率的影响期刊论文-华北农学报2010,25(z1)8.杨永新.曹随忠.张勇.程广龙.赵辉玲.赵兴绪.Yang Yongxin.Cao Suizhong.Zhang Yong.Cheng Guanglong.Zhao Huiling.Zhao Xingxu 金黄色葡萄球菌乳房炎奶牛血浆的比较蛋白质组研究期刊论文-农业生物技术学报2011,19(2)9.王潍波.郭熠洁.王瑞龙.韩庆广.赵国琦.WANG Wei-bo.GUO Yi-jie.WANG Rui-long.HAN Qing-guang.ZHAO Guo-qi 不同蛋白质日粮对山羊瘤胃左静脉和肠系膜静脉氨基酸浓度的影响期刊论文-动物营养学报2009,21(1)10.李瑞国.苗朝华.安晓荣.陈永福.LI Rui-guo.MIAO Chao-hua.AN Xiao-rong.CHEN Yong-fu 牛乳腺上皮细胞体外分离、培养和鉴定的研究期刊论文-中国农业科技导报2010,12(4)引证文献(8条)引证文献(8条)1.刘荣.高学军.李庆章.黄建国.陆黎敏.骆超超.金鑫.王佳丽 奶牛乳腺上皮细胞核蛋白质组双向电泳方法的建立期刊论文-中国畜牧兽医 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