辽师微生物实验.doc

实验一油镜的使用和细菌的简单染色一、目的要求1.学习并掌握使用油镜的原理和方法。2.通过简单染色，初步认识细菌的形态特征。3.掌握染色的基本技术和无菌操作技术。二、实验原理1、油镜的使用原理普通显微镜通常配置几种物镜，其中油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间滴加镜油，这主要有两方面的原因：（1）增加照明亮度：油镜的放大倍数为100，其焦距很短，但所需要的光照强度却最大，从玻片透过来的光线，有些会因折射和反射不能进入镜头，致使物象不清。为了不使光线有所损失，在使用油镜时，需在镜头与玻片之间加入与玻璃折射率相仿的镜油（香柏油）。（2）增加显微镜的分辨率：由于香柏油的折射率比空气和水的折射率要高，因此以香柏油为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径要高于低倍镜、高倍镜等干镜。2、简单染色原理利用单一种染料对菌体进行染色的方法称为简单染色法。用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。3、无菌操作技术原理高温对微生物具有致死的作用，因此在微生物的转接过程中，一般在火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环，已达到灭菌目的，但一定要注意冷却后再进行转接，以免烫死微生物。如果转接液体培养物，则用预先已灭菌的玻璃吸管；如果只取少量而且无需定量也可用接种环，视实验目的而定。三、器材1、菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌(E.coli)和口腔细菌。2、染色剂：结晶紫染液或碱性复红。3、仪器或其他用具：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶（内装香柏油、二甲苯）、擦镜纸、生理盐水。四、步骤：1、涂片：取三块载玻片，分别滴一滴生理盐水于载玻片中央，用接种环以无菌操作技术分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌少许菌苔于水滴中（口腔中细菌用牙签从口腔中刮取），均匀并涂成薄膜。载玻片要洁净无油迹，取菌适量，涂片要均匀，不宜过厚。注意无菌操作。2、干燥：自然干燥。3、固定：涂面朝上，通过火焰23次。热固定时温度不宜过高，否则会改变或破坏细胞形态。4、染色：滴加染液于玻片上，以刚好覆盖涂面为宜，染色1min。 5、水洗：用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时不要直接冲洗涂面，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。6、干燥：自然干燥。7、镜检：涂片干后镜检。按照先低倍镜后高倍镜再油镜的顺序进行。油镜的滴加方法为：在高倍镜下找到观察样品区域后，用用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心下降，使油镜浸在镜油中几乎与标本相接。调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器使镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像，并使用细调节器使其清晰准焦为止。油镜使用完毕后一定要将油镜镜头擦试干净。五、作业：1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片与物镜镜头间滴加香柏油的作用是什么？2、绘出在油镜下观察到的细菌形态图。3、思考题：（1）在进行涂片时应注意那些环节？（2）进行细菌制片时为什么要进行热固定？在加热固定时应注意什么？（3）为什么要在制片完全干燥后才能进行油镜观察？（4）进行微生物制片时是否都需要进行涂片？为什么？（5）进行简单染色的目的及原理是什么？进行微生物制片时是否都需要染色？为什么？（6）根据你的实验结果，对细菌进行简单染色时，染色时间对染色效果有何影响？为什么？（7）你是否观察到金黄色葡萄球菌聚集成葡萄串状？试解释其形成原因。实验二细菌革兰氏染色法、芽胞染色和荚膜染色一、目的要求1、掌握革兰氏染色法。2、掌握芽胞染色法并观察芽胞的形态特征。3、掌握荚膜染色法并观察荚膜的形态特征。4、巩固显微操作技术及无菌操作技术。二、基本原理1、革兰氏染色原理革兰氏染色法能将细菌分为G+菌和G-菌，其原因是这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。然后利用卢氏碘液进行媒染处理，由于形成碘结晶紫复合物增强了染料在菌体中的滞留能力。之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所有的网孔结构可以滞留碘结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增强，原先滞留在细胞壁中的碘结晶紫复合物容易被脱洗下来，菌体变为无色，用复染剂（番红）染色后又变成复染剂颜色（红色）。2、芽胞染色原理芽胞染色法是根据细菌的芽胞和菌体对染料的亲和力不同，用不同的染料进行染色，使芽胞和菌体呈不同颜色而便于区别。芽胞壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽胞使其着色，而进入芽胞的染料则难以透出。若再复染（番红液），则菌体呈红色而芽胞呈绿色。3、荚膜染色原理荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质。 由于荚膜与染料的亲和力弱，不容易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。 所以通常用 (负染色法)染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，从而与菌体区分开。 三、器材1、菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、荚膜细菌。2、染色剂：革兰氏染色液 、孔雀绿染色液。3、器材：酒精灯、载玻片、显微镜、双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸、接种环，载玻片夹子、滴管等。四、实验步骤（一）革兰氏染色1、制片取活跃生长期菌种按常规方法涂片、干燥、固定。 选择对数生长期的菌种，防止染色结果错误。2、初染滴加草酸铵结晶紫染液染色1min-2min后倾倒去染液，水洗。3、媒染先用卢氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，水洗4、脱色将玻片上的残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管滴加95%乙醇20s-30s冲洗,当流出液无色时立即用水洗去乙醇。脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。5、复染将玻片上的残留水用吸水纸吸去，番红染液染色2min，水洗，晾干。6、镜检低倍高倍油镜。（二）芽胞染色1、制片：按常规方法涂片、干燥、固定。选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽胞，而老龄菌芽胞囊已经破裂。2、加热染色：向载玻片滴加数滴孔雀绿染色液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。3、脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗直至水流无色为止。4、复染：用番红水溶液复染2min。5、水洗：用缓流自来水冲洗直至水流无色为止。6、镜检：低倍高倍油镜。（三）荚膜染色1、推片：在载玻片一端滴一滴草酸铵结晶紫染液，无菌操作取少量菌体于其中混匀。另取一块载玻片作为推片，将推片一端与混合液接触，轻轻左右移动使混合液沿推片散开，之后以约30度角迅速向载玻片另一端推动，带动混合液在载玻片上铺成薄膜。玻片必须干净无油迹，否则混合液不能均匀铺开。2、水洗：用缓流自来水冲洗直至水流无色为止。3、干燥：室温自然干燥。4、镜检：低倍高倍五、作业1、绘图并说明显微镜下观察到的革兰氏染色鉴定结果、芽胞和荚膜的形态特征。2、思考题：（1）革兰氏染色是否成功，有哪些问题需要注意，为什么？（2）现有一未知菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴别该菌是革兰氏阴性还是革兰氏阳性，如何确定你染色结果的正确性？（3）为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？（4）你认为革兰氏染色中哪步可以省略？在哪种情况下可以省略？（5）Gram在对死于肺炎的患者肺部组织进行检查时，经过染色，某些细菌如肺炎球菌保持蓝紫色，肺部组织背景为淡黄色，为什么肺部组织细胞未被染成蓝紫色？实验四微生物的分离与纯化一、目的要求1、掌握倒平板的方法2、掌握分离纯化微生物的基本操作技术二、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法主要有平板划线分离法和稀释涂布平板法。后者除能有效分离纯化微生物外，还可用于测定样品中活菌数。三、器材1、土壤样品：从校园中采集的土壤样品2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、查氏培养基、高氏号培养基3、试剂和溶液：10%酚、1%链霉素、盛4.5mL无菌水的试管、盛45mL无菌水带有玻璃珠的三角瓶4、仪器：玻璃棒、吸管、无菌玻璃涂棒等四、操作步骤1、倒平板将三种培养基加热融化冷却至50左右，在高氏号培养基中加入10%酚数滴，查氏培养基中加入1%链霉素溶液（终质量浓度为30ug/mL），混均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。倒平板的方法：右手持盛培养基的三角瓶于火焰旁用，左手将棉塞轻轻拔出，瓶口保持对着火焰，然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住棉塞，左手持培养皿，并在火焰旁打开皿盖，成一条缝，迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。2、制备土壤稀释液取土样5g，放入盛45mL无菌水带有玻璃珠的三角瓶中，振摇约20min使土样与水充分混合，使细胞分散。用一0.5mL的移液管吸取0.5mL土壤悬液加入盛4.5mL无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5几种稀释度的土壤溶液。悬液细胞密度适宜，混合均匀。3、涂布将上述每种培养基的平皿上标记10-3、10-4、10-5三种稀释浓度，做三个重复。用0.1mL移液管吸取稀释好的土壤悬液按标记分别准确加入，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻涂布均匀。其方法是先沿一条直线来回推动，然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动，再转动平板涂布边缘。4、培养查氏培养基和高氏号培养基的平板倒置于28温室培养35d，牛肉膏蛋白胨培养基的平板倒置于37温室中培养12d。实验五三大类群微生物的菌落形态比较和放线菌及霉菌的形态观察一、目的要求1、初步观察三大类微生物的群落形态特征。2、学会平板菌落计数的基本原理和方法。3、掌握放线菌和霉菌的形态特征。二、基本原理平板计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上；经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。统计菌落数根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。由于待测样品往往不易于分离成单个细胞，平板上形成的单个菌落不一定是由单个细胞繁殖而成，有的可能来自两个或多个细胞，因此，平板计数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用菌落形成单位取代以前用绝对菌落数来表示样品中活菌含量的原因。三、器材1、菌种：青霉、曲霉、上次课分离纯化的微生物。2、染液：乳酸石炭酸棉蓝染液。3、各种装片四、实验步骤1、三大类微生物菌落形态比较观察上次实验课分离得到的细菌、放线菌、霉菌，从菌落含水状态、外观状态、菌落透明度、菌落与培养基结合程度、菌落颜色、菌落正反面颜色差别、气味几个方面比较辨别三大微生物。2、平板菌落计数从每种培养基10-3、10-4、10-5三种稀释浓度的平板中选出平板中菌落在50200的稀释浓度进行计数。按以下公式进行计算：每毫升样液中菌落形成单位数（cfu）=同一稀释浓度的平均菌落数*稀释倍数*10平均菌落数在五十左右最好。3、放线菌及霉菌的装片观察4、霉菌的制片观察滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染液于载玻片上，用镊子分别取青霉和曲霉，先放在50%的乙醇中浸一下洗去脱落的孢子，然后置于染液中，用解剖针小心将菌丝分开，去掉培养基，盖上盖玻片，在低倍镜和高倍镜下观察。注意无菌操作，取菌时要带下一些培养基，盖片时要将培养基分离出去，制片要薄。五、作业1、平板计数结果.2、绘制根霉的形态和构造，青霉和曲霉分生孢子头的结构。实验六酵母菌的形态观察、死活细胞的鉴别和显微镜直接计数一、目的要求1、观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞。2、学习并掌握使用显微测微尺测定微生物大小的方法。3、学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞数目的方法。二、实验原理美蓝染液有两种形式，其氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母菌进行染色后，由于活细胞体新陈代谢力强，染料进入细胞后，细胞可将氧化型美蓝还原为无色的还原型，由此区分酵母菌的死活细胞。微生物大小的测定需要借助特殊的测量工具显微测微尺，它包括目镜测微尺和镜台测微尺两个相互配合的部件。镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其总长度为1mm精确的分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100个小格，每一小个长度为0.01mm，即10m镜台测微尺并不直接用来测定微生物的大小，而是用来校正目镜测微尺每一小格的相对长度。目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜的隔板上，用于测量经显微镜放大后的细胞物像。由于不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。因此用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以测定该显微镜在一定目镜和物镜的组合下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。转换公式如下：用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm。则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(1/10000ml)。计数时。计数时求出每一小格的平均值，然后通过公式，得到lmL菌液中的总菌数。设每个小格的平均菌数为A，菌液稀释倍数为B，则总菌数/ml = 4106AB 三、器材1、菌种：酵母菌悬液。2、仪器：目镜测微尺、镜台测微尺、血细胞计数板等。3、染液：0.1%美蓝染色液。四、实验步骤1、酵母菌的形态观察取一滴酵母菌悬液于载玻片中央，在悬液上滴加一滴美蓝染液混匀，盖上盖玻片，在低倍镜和高倍镜下观察。2、酵母菌大小的测定把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下，然后放回到镜筒内。将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，并使两尺左边的一条线重合，向右寻找另外一条两尺相重合的直线。校准目镜测微尺，根据公式计算目镜测微尺每格长度，卸下镜台测微尺，换上酵母菌装片，测定酵母菌的大小。测量完毕后取出目镜测微尺，将目镜放回镜筒，并将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。校准目镜测微尺每格长度和测定酵母菌大小要在相同的放大倍数下进行。光线不宜过强。3、酵母菌计数在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗并吹干。将洁净的血细胞计数板盖上盖玻片，用无菌的毛细滴管将摇匀的酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用镊子轻压盖玻片然后将加有样品的的血细胞计数板置于载物台上，先在低倍镜下找到计数室，再在高倍镜下观察，并计数。取样时先要摇匀菌液，加样时计数室内不可有气泡。计数时，视野要调暗些。不可用刷子等硬物清洗，不可用酒精灯烘烤计数板。五、作业1、绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。2、计算酵母菌养液的浓度，该方法得到的结果与平板菌落计数有何不同？实验七化学因素对微生物的影响一、目的要求1、了解常用化学消毒剂对微生物的作用。2、学习测定消毒剂对微生物作用效果的实验方法。二、实验原理常用化学消毒剂包括有机溶剂（酚、醇、醛等）、重金属盐、卤族元素及其化合物、染料和表面活性剂等。有机溶剂使蛋白质（酶）和核酸变性失活，破坏细胞壁；重金属盐也使蛋白质（酶）和核酸变性失活，或与细胞代谢产物螯合成无效化合物；碘与蛋白质酪氨酸残基不可逆结合使蛋白质失活，氯与水作用形成强氧化剂使蛋白质氧化变性；低浓度染料可以抑制细菌生长，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌对染料更加敏感；表面活性剂可以改变细胞膜透性，也是蛋白质变性。三、实验器材1、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。3、溶液或试剂：2.5%碘酒、75%乙醇、5%石碳酸、0.05%龙胆紫、2%过氧乙酸、0.25%新洁尔灭、无菌生理盐水。4、仪器及其他用具：无菌培养皿、牛津杯、试管、吸管、三角涂棒等。四、实验步骤1、倒平板2、涂菌吸取0.2mL菌悬液加入到上述平板中，用无菌三角涂棒涂匀。3、平皿划分将每种培养基的两个平板底皿分别划分成三等份和四等份，并标注要加的消毒剂名称。4、放置牛津杯在无菌操作台中用镊子取一牛津杯放在培养皿各份的中心位置，并用镊子稍稍平压，使牛津杯和培养基充分接触。5、加样分别取0.2mL不同的消毒剂加在牛津杯中。小心加入，不要将消毒剂洒在牛津杯外。6、培养将上述加好消毒剂的培养皿放入37温室中培养。培养皿不要倒置，要轻拿轻放，勿使牛津杯翻倒。7、记录结果24h后测量抑菌圈的大小，并拍照。五、作业1、医院用作消毒剂的乙醇浓度是多少，为何采用该浓度乙醇作为消毒剂？3、利用牛津杯法测定化学消毒剂对微生物的作用时，影响抑（杀）菌圈大小的因素有哪些？抑（杀）菌圈大小能否准确反映化学消毒剂抑（杀）菌能力的强弱？3、设计一个简单实验，证明某化学消毒剂对某试验菌起抑菌作用还是杀菌作用。实验八微生物的生理生化反应一、目的要求1、证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。2、掌握进行微生物大分子物质水解实验的原理和方法。3、了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中的重要的作用。4、掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。二、实验原理1、明胶水解的原理明胶是由胶原蛋白水解产生的蛋白质，在25以下可维持凝胶状态，以固体形式存在，而在25以上明胶会液化。有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4仍能保持液化状态。2、糖发酵试验的原理糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化实验，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大差异，有些细菌能分解某种糖，产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。三、器材1、菌种：枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌。2、培养基：明胶培养基试管、葡萄糖发酵培养基试管、乳糖发酵培养基试管。3、仪器：接种针、接种环、试管架。四、实验步骤1、明胶水解实验（1） 取3支明胶培养基试管，用记号笔标明各管预接种的菌名。（2） 用接种针分别穿刺接种枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。（3） 将接种后的试管置20中培养2-5d。（4） 观察明胶液化情况。2、糖酵解试验（1） 用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。（2） 取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三只不接菌，作为对照。另取乳糖发酵培养基试管3支，同样分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三只不接菌，作为对照。在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。（3） 将接过种和作为对照的6支试管均置于37中培养2448h。（4） 观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。五、作业1、记录明胶水解试验结果。2、记录糖发酵实验结果。实验九噬菌体的分离纯化及其效价的测定一、目的要求1、学习分离纯化噬菌体的基本原理和方法，观察噬菌斑。2、掌握噬菌体效价测定技术。二、实验原理噬菌体是细菌的专性寄生物，自然界中凡是有细菌存在的地方，均可以发现其特异性的噬菌体，噬菌体侵入细菌细胞后，利用宿主细胞的酶系统进行复制和增殖，最终导致细菌细胞裂解，噬菌体从细胞中释放出来，可以进一步侵染细菌细胞。在液体培养基中，噬菌体可以使浑浊的菌悬液变为澄清。在长有宿主细菌的固体培养基平板上，噬菌体可以裂解细菌形成透明的空斑，即噬菌斑，一个噬菌体产生一个噬菌斑，因此可以利用这个性质对噬菌体进行分离和效价的测定。 噬菌体的效价是指噬菌体的浓度，即一毫升培养液中所含有的噬菌体数量。噬菌体效价的测定方法多采用双层琼脂平板法。先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有宿主细菌和一定稀释度噬菌体的半固体培养基。培养一段时间后，计算噬菌斑的数量。三、器材1、菌种：大肠杆菌2、培养基：500mL三角烧瓶内装3倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基10mL，试管液体培养基，上层琼脂培养基（琼脂粉约0.5%，试管分装，每管4mL）,底层琼脂平板（含培养基10mL，琼脂1.5%-2%）.3.仪器和其它用品：无菌小试管、玻璃涂棒、无菌细菌过滤器，恒温水浴锅和蠕动泵。4、阴沟污水。四、实验步骤1、噬菌体的分离（1）宿主细胞的培养：用接种环在斜面上挑取少许菌苔接入5mL牛肉膏蛋白胨培养液中，混合均匀后37振荡培养过夜。（2）噬菌体增殖：在10mL 3倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中加入阴沟污水20mL和大肠杆菌过夜培养物0.3mL，混合后37振荡培养12-24h。（3）裂解液制备：将上述混合培养物倒入一支50mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液转入另一支无菌离心管中，所得裂解液37振荡培养过夜，做无菌检查，此为噬菌体裂解液，还可以加入几滴氯仿，稍作混匀，备用。（4）噬菌体的检测：在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入1mL大肠杆菌菌液，用无菌玻璃涂棒，将菌液均匀的涂布在培养基表面。待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，37培养过夜。如果滴加裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌体斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。2、高效价噬菌体的制备一般来说，开始从自然环境中分离得到的噬菌体效价不高，需将噬菌体进行增殖。将纯化的噬菌体裂解液与液体培养基按1：10的比例混合，再加入大肠杆菌悬液适量，37培养，使噬菌体增殖，如此重复数次，便可得到高效价的噬菌体制品。3、噬菌体的纯化（1）取含噬菌体的裂解液0.1mL于一支试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌培养物，混合均匀。（2）取上层琼脂培养基溶化并冷却到55，加入0.2mL上述噬菌体与细菌的混合液，混匀后迅速倒入盛有底层培养基的平板上，铺匀，37培养24h。（3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的特征，如不纯需进一步纯化。4、噬菌体效价的测定（1）噬菌体液的稀释将4支含0.9mL液体培养基的试管分别表明10-3、10-4、10-5、10-6字样。用1mL无菌吸管吸0.1mL10-2大肠杆菌噬菌体液加入10-3试管中摇匀。用1mL无菌吸管吸0.1mL10-3大肠杆菌噬菌体液加入10-4试管中摇匀。以此类推，稀释至10-6管。（2）噬菌体与菌液混合将12支无菌空试管分别标记为10-4、10-5、10-6和对照各3支。用无菌吸管吸分别吸取10-4、10-5、10-63种噬菌体稀释液各0.1mL加入相应标记的无菌空试管内，再加入0.1mL大肠杆菌于其中，对照管中只加0.1mL菌液和0.1mL无菌水，轻轻混合。（3）混合液与上层培养基混合将上层培养基溶化，分别标记10-3、10-4、10-5、10-6和对照字样各三支，使其冷却至55，并放入55水浴锅内保温。根据标号分别将混合管和对照管加入上层培养基，摇匀，再快速将试管中的所有培养基和菌液对号倒在含底层培养基的平板上，摇匀，是上层培养基铺满平板。凝固后，37培养24h。（4）统计噬菌斑形成单位（Pfu）数：仔细观察平板上形成的噬菌斑，记录结果，根据下列公式计算出样品中噬菌体的效价：（5）噬菌体效价/ml=Pfu数稀释倍数10.注：本实验为综合设计性实验，学生根据本组情况，自己设计实验方案、采样、分离纯化、测定效价，实验结果综合设计性实验报告形式提交，并准备实验答辩。实验十枯草芽胞杆菌的分离纯化、鉴定一、目的要求1、掌握分离枯草芽胞杆菌的方法。2、掌握纯化枯草芽胞杆菌的方法。3、掌握如何鉴别所得菌是否为枯草芽胞杆菌的方法。二、实验原理枯草芽胞杆菌是芽胞杆菌属的一种。单个细胞0.70.823微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽胞0.60.91.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽胞形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。枯草芽胞杆菌为需氧菌，可利用酵素，过氧化氢酶阳性，V.P.反应阳性，所产生的蛋白酶可以分解明胶，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。利用以上菌落形态和生理生化特征，就可以分离纯化，逐步鉴定出所得微生物是否为枯草芽胞杆菌。三、器材1、材料：花园土2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基3、溶液或试剂：染色液，进行生理生化鉴定的培养基4、器材和其他用具：显微镜，镜台测微尺，目镜测微尺，培养皿，试管，三角瓶，移液管，涂布棒，接种环，接种针，高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱等。四、实验步骤1、菌种的分离和纯化（1）土样的采集：取校园内的花园土。（2）取土样若干,放入装有无菌水的三角瓶中，摇动20min，然后加热至沸腾，维持1min，静置5min。采用平板划线或稀释涂布的方法进行分离纯化。2.菌种的鉴定（1）菌落形态鉴定菌落大小、菌落表面特征、菌落边缘特征、菌落透明度及菌落的颜色等。（2）个体形态鉴定革兰氏染色、芽胞染色及菌体大小的测定等（3）生理生化鉴定过氧化氢酶反应：取一干净载玻片，在上面滴加1滴310%过氧化氢，挑取一环培养的菌苔，在过氧化氢中涂抹，若有气泡出现，为过氧化氢酶阳性，或将过氧化氢液直接加在斜面上，观察气泡的产生。需氧性实验：枯草芽胞杆菌为需氧型。乙酰甲基甲醇实验：枯草芽胞杆菌发酵葡萄糖产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性环境中可被空气中的氧气氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中的精氨酸作用，生呈红色化合物，即表现为V.P.试验阳性。实验方法：将测试菌接种于上述培养液中，30恒温培养箱中47天。观察结果，在培养4天后，取培养液2mL和等量的40%氢氧化钠相互混匀，加少量肌酸（约0.5-1mg）充分振荡，2-5min后如培养液呈红色，即为V.P.试验阳性，符合枯草芽胞杆菌的特征，继续下一步实验。有时需放置更长的时间才能出现红色。在培养7天后，用精密pH试纸测试培养液pH值，记录结果。明胶水解实验：明胶是一种动物性蛋白质，枯草芽胞杆菌所产生的蛋白酶可分解明胶，明胶被分解后，其分子变小，虽然在低于20的温度下，也不再凝固。淀粉水解实验：枯草芽胞杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再变蓝。实验方法：在牛肉膏蛋白胨培养基中添加0.02%可溶性淀粉，分装三角瓶，0.1MPa20min灭菌，倒平板，凝固后取菌种点种于平板上，每皿点种2点，30恒温培养箱中24天，形成菌落后，在平板上滴加碘液，以铺满菌落为度，平板成蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，即符合枯草芽胞杆菌的特征，透明权的大小，可表明水解淀粉能力的大小。注：本实验为综合设计性实验，学生根据本组情况，自己设计实验方案、采样、分离纯化、测定效价，实验结果综合设计性实验报告形式提交，并准备实验答辩。A* Absorption 吸附* Acid-fast bacilli 抗酸杆菌Acquired immunity 获得性免疫* Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS 获得性免疫缺陷综合征* Actinomyces 放线菌属Acute infection 急性感染* Adenovirus 腺病毒* Anaerobic bacteria 厌氧性细菌Anaerobic medium 厌氧培养基* Antisepsis 防腐Antiviral protein,AVP 抗病毒蛋白Apoptosis 细胞凋亡* Apparent infection 显性感染* Artificial active immunization 人工主动免疫* Artificial passive immunization 人工被动免疫* Asepsis 无菌Aspergillus 曲霉属* Assembly and release 装备与释放Autotroph 自养菌* Attenuated vaccine 减毒疫苗B* Bacillus 芽胞杆菌属* Bacillus anthracis 炭疽芽胞杆菌Bacillus cereus 蜡样芽胞杆菌* Bacteremia 菌血症Bacterial infection 细菌感染* Bacterial L form 细菌L型* Bacteriocin 细菌素* Bacteriophage 噬菌体* Bacterium 细菌* Bacteriodes fragilis 脆弱类杆菌Bifidobacterium 双歧杆菌属* Binary fission 二分裂* Bioproduct 生物制品* Biosynthesis 生物合成Biotype 生物型Blastospore 芽生孢子* Botulin 肉毒毒素Bovine spongiform encephalopathy,BSE 牛海绵状脑病(疯牛病)* Bordetella pertussis 百日咳鲍特菌* Brucella 布鲁菌属C* Candida albicans 白假丝酵母菌* Capsid 衣壳Capsomere 壳粒* Capsule 荚膜* Carrier 带菌者* Carrier state 带菌状态* Clostridium 梭菌属* C.botulinum 肉毒梭菌Cell membrane 细胞膜Cellular microbiology 细胞微生物学Cell wall 细胞壁* Chlamydia 衣原体Chlamydospore 厚膜胞子* Chronic infection 慢性感染C.jejuni 空肠弯曲菌* Coagulase 凝固酶* Coccus 球菌* Colony 菌落Colonization 定植Complex symmetry 复合对称* Conditional pathogen 条件致病菌* Conjugation 接合Core polysaccharide 核心多糖Coronavirus 冠状病毒* Corynebacterium diphtheriae 白喉棒状杆菌* C.perfringens 产气荚膜梭菌* C.pneumoniae 肺炎衣原体* C.tetani 破伤风梭菌* C.trachomatis 沙眼衣原体* Culture medium 培养基Cytoplasme 细胞质D* Darkfeild microscope 暗视野显微镜Decline phase 衰亡期Defective interfering particles,DIP 缺陷干扰颗粒* Defective virus 缺陷病毒* Dengue virus 登革病毒* Dermatophytes 皮肤癣菌* Diplococcus 双球菌Differential medium 鉴别培养基* Disinfectant 消毒剂* Disinfection 消毒* Dysbacteriosis 菌群失调* Dysentery bacterium 痢疾杆菌EE.aerogenes 产气肠杆菌Electron microscope 电子显微镜elementary body 原体* Encephalitis B virus 乙型脑炎病毒Endospore 内芽胞* Endotoxin 内毒素* Enterotoxin 肠毒素* Enterovirus 肠道病毒* Envelope 包膜Epidermophyton 表皮癣菌* Escherichia coli 大肠埃希菌* Exogenous infection 外源性感染* Exotoxin 外毒素F* Facultative anaerobe 兼性厌氧菌* Fertility factor,F factor 致育因子Filamentous fungus 丝状菌Filter 滤菌器* Fimbriae 菌毛* Flagellum 鞭毛Fractional sterilization 间歇蒸气灭菌法* Fungus 真菌G* Generalized infection 全身感染Generalized transduction 普遍性转导* Gene transfer 基因转移* Gonococcus 淋球菌* Gram stain 革兰氏染色* Growth curve 生长曲线* Growth factor 生长因子H* Haemophilus influenzae 流感嗜血杆菌* H