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分子生物学与细胞生物学实验基本技术

2005-02

实验一 组织块培养法
一、目的
学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。
二、概述
组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法。可以采用剪切法，即将组织块剪切成小块后，接种于培养瓶，组织小块贴壁24h或更长时间后，细胞就从组织四周游出。但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理，如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。（本节以新生牛主动脉平滑肌培养为例）
三、材料
（一） 仪器
1. 净化工作台
2. 恒温水浴箱
3. 冰箱（4℃、-20℃）
4. 倒置相差显微镜
5. 培养箱
（二） 玻璃器皿
1. 培养皿（Φ100mm）
2. 吸管（弯头）
3. 烧杯（500ml、200ml、10ml）
4. 广口试剂瓶（500ml）
5. 玻璃瓶（250ml、100ml）
6. 培养瓶
7. 废液缸
（三） 塑料器皿
1. 吸头
2. 枪头
3. 胶塞
4. EP管
（四） 其他物品
1. 微量加样枪
2. 眼科组织剪（直尖、弯）
3. 眼科组织镊（直、弯）
4. 12.5cm组织镊（无钩、1×2钩）
5. 25cm敷料镊（无钩）
6. 止血钳（18cm直纹式、12.5cm直纹式、弯纹式）
7. 解剖剪
（五） 试剂
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. RPMI1640
4. 双抗（青霉素、链霉素）
5. 1N HCl
6. 7.4%NaHCO3
四、操作步骤
1. 取材：打开胸腔，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到预先配制好的含双抗（500u/ml青、链酶素）的D-Hanks液中漂洗。
2. 组织的冲洗、修剪：取出主动脉，用锋利的剪刀修剪除去周围组织，再用D-Hanks冲洗主动脉3次，除去血块及杂组织等。
3. 平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉，撕下主动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无血清RPMI1640漂洗3次。
4. 剪切：将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成1mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1～2滴培养液，以保持湿润。
5. 贴块：将剪切好的组织小块，用眼科镊送入培养瓶内，用弯头吸管将组织块均匀摆置，每小块间距0.5cm左右，组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入适量含10%牛血清培养液，盖好瓶盖。
6. 培养：将培养瓶瓶底朝上，37℃培养箱放置2～4h，待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。
7. 换液：原代培养3～5d，需换液一次，去除漂浮的组织块和残留的血细胞。
组织块培养法也可不用翻转法，即在摆放组织块后，向培养瓶内仅加入少量培养液，以能保持组织块湿润即可，盖好瓶盖，放置37℃培养箱24h再补加培养液。
注意事项
1. 取材的组织最好尽快培养。因故不能即时培养，可将组织浸泡于培养液内，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果组织块很大，应切成1cm3以下的小块再低温保存，但时间不能超过24h。
2. 从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材，可用含500～1000u/ml的青、链霉素BSS液漂洗5～10min，或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再作培养。
3. 组织块不易贴壁，可预先在瓶壁涂薄层血清、胎汁或鼠尾胶等。
4. 原代培养的1～2d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦发现，要及时清除。

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实验二 消化培养法
一、目的
学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养
二、概述
此法采用消化分离法（即结合生化和化学手段把已剪切成小体积的组织进一步分散的方法），将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，可直接进行培养。分散后细胞易于从外界吸收养分和排出代谢产物，容易生长，存活率高，可以很快得到大量活细胞，细胞在短时间内生长成片。由于各种消化试剂的作用机制各不相同，要根据组织类型和培养的具体要求选择消化方法和试剂。本方法适用于培养大量组织，原代细胞产量高，但步骤繁琐，易污染。（本节以乳鼠心肌细胞培养为例）
三、材料：
（一） 仪器
1. 净化工作台
2. 离心机
3. 恒温水浴箱
4. 摇床（37℃）
5. 冰箱（4℃、-20℃）
6. 倒置相差显微镜
7. 培养箱
（二） 玻璃器皿
1. 培养皿（Φ100mm）
2. 吸管（弯头、直头）
3. 烧杯（200ml、10ml）
4. 玻璃瓶（250ml、100ml）
5. 玻璃漏斗
6. 培养瓶
7. 废液缸
（三） 塑料器皿
1. 吸头
2. 枪头
3. 胶塞
4. 15ml离心管
5. EP管
（四） 其他物品
1. 微量加样枪
2. 眼科组织剪（直尖、弯）
3. 眼科组织镊（直、弯）
4. 12.5cm组织镊（无钩）
5. 红血球计数板
6. 泡沫板
7. 大头针
8. 尼龙网膜（140目）
（五） 试剂
1. D-Hanks液利益
2. 小牛血清
3. DMEM
4. 双抗（青霉素、链霉素）
5. 胰蛋白酶（0.08%）
6. 1NHCl
7. 7.4%NaHCO3
四、操作步骤
1. 取材：取新生1～3天的乳鼠，雌雄兼用，75%酒精消毒3次，用大头针将乳鼠固定在泡沫板上，无菌操作下打开胸腔，取出心脏，放入装有D—Hanks液的培养皿中。
2. 组织修剪、漂洗：修剪去除血管等杂组织，D—Hanks液中漂洗数次，以除去血块等。
3. 剪切：将心室肌用锋利的眼科剪反复剪切组织至剪成1～2mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1～2滴培养液，以保持湿润。
4. 消化：将组织小块转移至100ml的玻璃瓶中，再加入30～50倍组织量并预温37℃的0.08%胰酶消化液，37℃摇床消化6min左右。
5. 细胞分离：消化完毕，用吸管轻轻吸吹几下，使组织小块散开，静置2min后，吸取上面的混悬液（弃去第1次的混悬液），经140目尼龙网膜过滤至盛有终止液试管中，1000rpm，离心10分钟，弃去上清，加适量的培养液悬混。在装有组织小块的玻璃瓶中再加入30～50倍组织量并预温37℃的0.08%胰酶消化液，重复第4、5步骤，直至大部分组织小块消失。
6. 细胞计数：将上述获得的细胞悬液，吸出少许，适当稀释，加台盼蓝溶液染色，用红血球计数板计数活细胞和死细胞，计算细胞密度和存活率。
7. 细胞接种：将细胞接种至30ml的培养瓶中，每瓶6×105，用含15%小牛血清的DMEM培养液培养。
8. 培养：5%CO2、37℃培养箱培养12h，显微镜下可见细胞贴壁，呈多角形，培养24h，镜下见细胞已连结在一起，部分细胞开始搏动。
9. 换液：培养3～5d，细胞换液。

五、注意事项
1. 取材的组织最好尽快培养。因故不能即时培养，可将组织浸泡于培养液内，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果组织块很大，应切成1cm3以下的小块再低温保存，但时间不能超过24h。
2. 从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材，可用含500~1000u/ml的青、链霉素BSS液漂洗5~10min，或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再作培养。
3. 原代培养的1~2d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦发现，要及时清除。

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实验三 细胞传代
一、目的
学习细胞传代方法，扩增细胞，建立细胞系。
二、概述
培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。
三、材料
（一）仪器
1. 净化工作台
2. 离心机
3. 恒温水浴箱
4. 冰箱（4℃、-20℃）
5. 倒置相差显微镜
6. 培养箱
（二）玻璃器皿
1. 吸管（弯头、直头）
2. 玻璃瓶（250ml、100ml）
3. 培养瓶
4. 废液缸
（三） 塑料器皿
1. 吸头
2. 枪头
3. 胶塞
4. 15ml离心管
5. EP管
（四）其他物品
1. 微量加样枪
2. 红血球计数板
（五）试剂
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. RPMI1640
4. 双抗（青霉素、链霉素）
5. 胰蛋白酶（0.08%）或EDTA或两者混合液
6. 1NHCl
7. 4%NaHCO3
四、操作步骤
（一） 贴壁细胞的消化法传代：
1. 吸除或倒掉瓶内旧培养液。
2. D-Hanks液洗2～3次。
3. 向瓶内加入适量消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加适量新的消化液，轻轻摇动再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。也可不采用上述步骤直接加消化液进行消化。
4. 消化最好在37℃或室温25℃以上环境下进行。消化2～5min后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化。
5. 吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化。
6. 用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。
7. 计数，分别接种在新的培养瓶内。
（二） 悬浮细胞的传代
悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代，或直接传代。
离心传代法：
1. 将细胞连同培养液一并转移到15ml离心管内；
2. 离心800～1000rpm，5min；
3. 弃去上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液；
4. 计数，分别接种在新的培养瓶内。
直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1/2～2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。
(三)、部分贴壁细胞的传代
部分贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等，不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。对绝大部分贴壁生长的细胞，因直接吹打对细胞损伤较大，细胞常有较大数量的丢失，因而需消化后，才能吹打传代。

五、注意事项
1. 胰蛋白酶要预温，温度37℃左右为宜℃。
2. 离心转速要合适，转速过低，不能有效分离细胞，离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。
3. 要定时观察细胞，发现污染，应及时处理。

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实验四 细胞冻存和复苏
一、目的
学习细胞冻存和复苏的方法，掌握长期保存体外培养细胞的技术。
二、概述
细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
三、材料
（一）仪器
1. 净化工作台
2. 离心机
3. 恒温水浴箱
4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
5. 倒置相差显微镜
6. 培养箱
7. 液氮冰箱
（二）玻璃器皿
1. 吸管（弯头、直头）
2. 培养瓶
3. 玻璃瓶（250ml、100ml）
4. 废液缸
（三）塑料器皿
1. 吸头
2. 枪头
3. 胶塞
4. 移液管（10ml）
5. 15ml离心管
6. 冻存管（1～2ml）
（四）其他物品
1. 微量加样枪
2. 红血球计数板
3. 记号笔
4. 医用橡皮膏
5. 移液枪
（五）试剂
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. 培养液
4. 双抗（青霉素、链霉素）
5. 胰蛋白酶（0.08%）
6. 1NHCl
7. 7.4%NaHCO3
8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油
四、操作步骤
（一）细胞冻存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；
3. 离心1000rpm，5min；
4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
（二） 细胞复苏
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3. 离心， 1000rpm，5min；
4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
五、注意事项
1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；
2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。

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实验五 细胞生长曲线、四唑盐试验（MTT）比色试验
一 细胞生长曲线
（一）、目的
学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。
（二）、概述：
细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。
（三）、材料
（一）仪器
1. 净化工作台
2. 离心机
3. 恒温水浴箱
4. 冰箱（4℃、-20℃）临床
5. 倒置相差显微镜
6. 培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度）
（二）玻璃器皿
1. 吸管（弯头）
2. 培养瓶
3. 玻璃瓶（250ml、100ml）
4. 废液缸
（三）塑料器皿
1. 吸头
2. 枪头
3. 24培养板
4. 胶塞
（四）其他物品
1. 微量加样枪
2. 红血球计数板
（五）试剂
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. RPMI1640
4. 双抗（青霉素、链霉素）
5. 0.08%胰酶
（四）、操作步骤
1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液；
2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。
3. 每天或每隔一天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均值。培养3～5d常要给未计数的细胞换液。
4. 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。
（五）、注意事项
1． 细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有20～30%的误差，需结合其它指标进行分析。
2． 现在很多实验室利用培养板采用MTT法进行生长曲线测定，较为简便。
3． 标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的潜伏适应期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。
4． 在生长曲线上细胞数量增加1倍时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。

二、四唑盐试验（MTT）比色试验
（一）、目的
学习四唑盐比色试验，检测细胞存活和生长情况。
（二）、概述
四唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称MTT。活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
（三）、材料
（一）仪器
1. 净化工作台
2. 离心机
3. 恒温水浴箱
4. 冰箱（4℃）
5. 倒置相差显微镜
6. CO2培养箱
7. 振荡混合仪
8. 酶联免疫检测仪
9. 移液枪
10. 电磁力搅拌机
11. 微孔滤器
（二）玻璃器皿
1. 吸管
2. 小烧杯（100ml）
3. 废液缸
（三）塑料器皿
1. 吸头
2. 枪头
3. 96孔培养板
4. 15ml离心管
5. 50ml离心管
6. 胶塞
（四）其他物品
1. 微量加样枪
2. 红血球计数板
（五）试剂
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. RPMI1640
4. 双抗（青霉素、链霉素）
5. 0.08%胰酶实现泪水汗水
6. 二甲基亚砜（DMSO）
7. MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。
（四）、操作步骤
1. 接种细胞：用0.08%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。
2. 培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养。（培养时间取决于实验目的和要求）
3. 呈色：每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20ul，37℃孵箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮生长的细胞，需离心（1000rpm，5min），然后弃去孔内培养液。每孔加入150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。
4. 比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为终轴绘制细胞生长曲线。
（五）、注意事项
1． 选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。
2． 避免血清干扰，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。
3． 设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。

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实验六 台盼蓝（trypan blue）排斥实验
一、目的
学习台盼蓝排斥实验的原理和方法
二、概述
台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色。是最常用的检测细胞活率的方法。
细胞活力常用百分比表示，活力的大小对试验结果有很大影响。细胞活力的测定有许多方法，最简便常用的方法是台盼蓝（trypan blue）染色法。
三、材料
1. 显微镜、玻片、盖玻片、滴管
2. 试剂：0.4%台盼蓝染液：
1) 台盼蓝（Trypan blue） 0.4g
2) 生理盐水 100ml
四、操作步骤
1、将待染色细胞稀释至所需浓度。（方法及浓度范围与细胞计数相同）
2、每0.1ml细胞悬夜约加新鲜配置的染液一小滴，室温下染3～5min 。
3、染色过的细胞材料，取一滴细胞悬液置玻片上，加盖玻片后放在高倍镜下观察。
4、死亡的细胞着浅蓝色并膨大，无光泽；活细胞不着色并保持正常形态，有光泽。计数100～200个白细胞。
统计未染色细胞。可按公式计算出细胞活力。 细胞活力（%）=未染色的细胞数/观察的细胞总数 × 100
五、注意事项
1. 染色时间不能太长，否则活细胞也会逐渐积累染料而染成颜色，使检测结果偏低。
2. 另可结合细胞计数方法，同时进行细胞计数和活力检测。

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实验七 外周血细胞瑞氏（Wright）染色及计数
一、目的
掌握细胞瑞氏（Wright）染色及细胞计数方法
二、概述
瑞氏染料中有美蓝和伊红两种成分，前者为碱性，后者为酸性，它们与细胞内的各种物质具有不同的亲和力，使其显现出不同的色调。血细胞核由去氧核糖核酸和强碱性的组蛋白、精蛋白等形成核蛋白。这种强碱性的物质与瑞氏染料中的酸性染料伊红有亲和力，所以染成红色；核蛋白中还有少量的 弱酸性蛋白，它们又与染液中的碱性染料美蓝起作用而染成蓝色，但含量太少，蓝色反应极弱 ，故核染色呈现紫红色。较幼稚的细胞之胞浆和细胞核之核仁中含有酸性物质，它们与染料中的碱性染料美蓝有亲和力，故染成蓝色。
三、材料及试剂
（一）、瑞氏染料
1、 瑞氏染料（粉） 1g
2、 纯甲醇（二级以上） 600ml
（二）、缓冲液
1. 1%磷酸二氢钾 30ml
2. 1%磷酸氢二钠 20ml
3. 蒸馏水 加至1000ml
在没有缓冲液的情况下，可用蒸馏水代替，但着色不如缓冲液满意。
四、操作步骤
1. 制作血涂片
滴一小滴血（约5ul）于干净玻片上，推片与玻片应呈约30°角，用力均匀而较快，且不可复推。如血滴较小，推得较慢，角度小于30°，所制涂片较薄；如血滴较大，推得较快，角度比30°大时，则所制涂片较厚。
2. 将标本放平（最好置于一个固定架上），用滴管将染液滴于涂片上，可用滴管将染液驱散，使其布满整个涂片。染液布满整个涂片后，稍等片刻或立即加入缓冲液，并使缓冲液与染液混均匀。
3. 染液与缓冲液的比例：染液量要充足，否则染液很快蒸发，将染料沉淀于细胞上。染液与缓冲液的比例为1：2~4左右比较合适，稀释度越大，染色时间越长，细胞着色较好，反之则越差。
4. 染色时间：视具体情况而定，一般约需10~30分钟。
5. 冲洗：用自来水冲洗涂片上之染料。
6. 显微镜检查：待自然干燥后用光学显微镜检查.
五、正常血细胞形态
1. 成熟红细胞：正常红细胞为两面微 凹而呈盘状，染色后则呈中心浅染之桔红色细胞，平均直径7.6um。
2. 成熟中性粒细胞：PB中有两种，杆状核和分叶核。杆状核粒细胞形态：圆形或椭圆形，直径10~13um。胞核如杆状、带状，胞核之凹超过假设核圆径的3/4，而且两端的内外有相当一段的平行。染色质凝固成块状，着色不均匀，其间可有空白区。胞浆内已不含有嗜碱性物质，而满布中性颗粒。中性分叶核粒细胞：圆形，直径10~13um。核呈分叶状，少者分两叶，多者六、七叶以上，叶与叶之间有细丝相连或完全断开， 或互相重叠。染色质成细块状。胞浆内布满中性颗粒。
3．成熟淋巴细胞：圆形，直径5~18um。核圆形或拟蚕豆状，染色质致密成团块状。胞浆量少，蓝色，可有少许圆形、周边整齐的嗜天青颗粒。大淋巴细胞胞浆量多，呈淡蓝色
4. 单核细胞：圆形或不规则形，直径12~20um。胞核居中或偏一侧，其形不规则。染色质凝集如筛底状或粗线条网状，但无凝集的块状染色质。胞浆量多，灰蓝色，散布许多细小的粉红色颗粒，颗粒多者甚至使胞浆成为粉红色，可有空泡和外浆出现。
5. 血小板：正常血小板为星形、逗点状或不规则状，直径2~5um，呈淡蓝色，中央推聚 干淡紫红色的小颗粒。

审
实验八 核蛋白的免疫荧光定位
一、目的
学习免疫荧光定位技术，定位细胞核蛋白。
二、概述
免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的已知抗体(或抗原)作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原(或抗体)，形成的抗原抗体复合物带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原(或抗体)的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量，以达到对抗原物质定位、定性和定量测定的目的。
三、材料
1. 荧光显微镜
2. 22×22mm1.5号盖玻片
3. 载玻片
4. 100%甲醇
5. 1% normal goat serum (NGS) in PBS
6. 一抗：鼠抗人增殖细胞核抗原抗体（Proliferative cell nuclear antigen antibody, PCNA）
7. 二抗：FITC标记的羊抗鼠IgM
四、操作步骤
1. 在22×22mm的1.5号盖玻片上培养细胞。理想条件下细胞应长到50%-70%汇合。
2. 在-20℃用100%甲醇固定细胞3分钟。
3. 用PBS + 1% NGS洗三次，每次10分钟。
4. 在湿盒里以适当浓度的一抗室温温育1小时。如果用22×22mm盖玻片，则在盖玻片上加30ul稀释的抗体，并且将盖玻片倒置在玻璃载玻片上，然后将载玻片放到湿盒里，在室温温育。
5. 用PBS + 1% NGS洗三次，每次10分钟。
6. 在湿盒里与稀释为4ug/ml的荧光标记二抗室温温育1小时。
7. 用PBS洗四次，每次10分钟。
8. 用封片剂将盖玻片封在载波片上，用干净的指甲油将盖玻片封边，防止盖玻片滑动。
五、注意事项
1. 要在盖玻片一边角落做记号，以知道细胞在盖玻片的那一面。
2. 一抗的浓度需要经过实验摸索确定。

审
实验九 TOTAL RAN 提取
一、目的
掌握RNA的提取过程
二、概述
有亚硫氢胍及巯基乙醇时，制组织匀浆，可使内源的RNA酶失活，n-月桂肌氨酸将核蛋白复合物变性。用酸平衡的苯酚：氯仿：异戊醇抽提后，RNA脱离DNA及蛋白，从混合液中层析到水相。抽提后，用异丙醇将RNA沉淀浓缩
模板mRNA 的质量直接影响到cDNA 合成的效率。由于mRNA 分子的结构特点,容易受RNA 酶的攻击反应而降解,加上RNA 酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA 酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。
三、材料及试剂
1. Invitrogen TriZOLRNA 提取试剂盒
2. 异丙醇
3. 70％酒精
4. DEPC
5. 低温离心机
四、操作步骤
1. 全血细胞： 溶血：加300ul的肝素或EDTA二钠抗凝的全血到含RBC Lysis Solution 900ul 的1.5ml EP管, 室温静置1min,期间，轻轻颠倒混匀10次。13000 ～16000 rpm离心20秒。弃上清液，将管底的白色沉淀用枪头吹散，使白细胞在残留的液体中悬浮。
2. 组织细胞： 将冻存或新鲜的组织，加入液氮让组织块完全冷冻，充分碾磨。加入1ml的TriZOL，分混匀，室温静置5min。
3. 取106-7细胞加入1ml的TriZOL中，充分混匀，室温静置5min。
4. 再加入200ul的氯仿，充分混匀，室温静置5min。4℃，13000rpm离心15min。
5. 取上清液500ul，加入等量的异丙醇。充分混匀室温静置5min。4℃，13000rpm离心10min。
6. 弃上清液，加入75%的酒精500ul，4℃，13000 rpm离心10分钟 。
7. 弃上清液，加入20ul的DEPC水，混匀。
8. 紫外分光光度计测定OD260/280，比值大于1.8即可。

五、注意事项
所有的组织中均存在RNA 酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2 小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC 是RNA 酶的化学修饰剂,它和RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC 处理,加入DEPC 至0.1%浓度,然后剧烈振荡10 分钟,再煮沸15 分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC 也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA 活性。但DEPC 能与胺和巯基反应,因而含Tris 和DTT 的试剂不能用DEPC 处理。Tris 溶液可用DEPC 处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC 处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC 外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA 酶抑制蛋白等。此外,为了避免mRNA 或cDNA 吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。细胞内总RNA 制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA 提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA 可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA 流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA 被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA 被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA 在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

审
实验十 基因组DAN 提取
一、目的
掌握提取DNA原理及方法
二、概述
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。 DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。
苯酚/氯仿作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态，真核细胞DNA的分离通常是在EDTA及SDS一类去污剂存在下， 用蛋白酶K消化细胞获得。诸多生物试剂公司现已有各种类型DNA提取试剂盒出售。
三、材料及试剂
1. GENTRO DNA提取试剂盒
2. 异丙醇
3. 70％酒精
四、操作步骤
（一）、从全血中提取DNA
1. 溶血：加300ul的肝素或EDTA二钠抗凝的全血到含RBC Lysis Solution 900ul 的1.5ml EP管, 室温静置1min,期间，轻轻颠倒混匀10次。13000 ～16000 g离心20秒。
2. 弃上清液，将管底的白色沉淀用枪头吹散，使白细胞在残留的液体中悬浮。
3. 加300ul的Cell Lysis Solution于EP管中, 充分混匀。
4. 加100ul的Protein Precipitation Solution于 EP管中, 充分混匀。13000 ～16000 g离心3分钟 。
5. 取上清液，加300ul的异丙醇，充分混匀颠倒50次，可见白色絮状沉淀，13000 ～16000 g离心1分钟 。
6. 弃上清液，加入70%的酒精500ul，13000 ～16000 g离心1分钟 。
7. 弃上清液，加入DNA Hydration Solution 50ul, 充分混匀，65℃5分钟使DNA 完全溶解。
8. 紫外分光光度计测定OD260/280，比值大于1.8即可。
（二）、从组织中提取DNA
9. 取液氮冷冻的叶片2-3片， 在液氮冷冻下迅速研磨成粉末。
10. 将粉末放入到1.5 ml离心管中，然后加入缓冲液“S”750ul, 充分混匀。
11. 将离心管置于65℃水浴中1-2小时，水浴过程中温和混匀几次。
12. 取出离心管, 每管加入等体积的酚－氯仿(V/V=1:1)溶液600-700ul，混匀后离心，10000rpm, 10分钟。
13. 上清液移入另一离心管中，加入等体积的氯仿，混匀后，10000rpm, 6分钟。
14. 将上清液移入另一离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，静置一段时间，然后用枪头勾出DNA,并用70％乙醇冲洗2次。
15. 勾出的DNA，真空干燥后将其溶于500ul 1x TE中。
16. 加入3ul RNA 酶溶液，37℃保温1 小时。
17. 加入等体积的酚-氯仿溶液, 轻轻混匀后, 10000rpm离心6分钟。
18. 取上清液，加入等体积的氯仿，轻轻混匀后，10000rpm离心6分钟。
19. 取上清液，入1/10体积3M醋酸钠，混匀后，加入2倍体积冷的无水乙醇（或95％乙醇）。
20. 轻轻混匀静置一会儿后，用枪头勾出DNA, 用70％乙醇冲洗2次后，真空干燥。
21. 依所提DNA量加入20-50ul的1x TE溶解DNA。
22. 测定DNA 的浓度，取少量样品跑电泳, Agarose 胶的浓度为0.8%。
23. 样品在4℃下保存备用。
附: 提DNA 所用试剂配方：
1. 1. 1M Tris.Cl   (1L：800ml H2O中加121.1g Tris, 用HCl调pH 至8.5后定溶至1升， 灭菌)
2. 0.5M EDTA pH8 (1L: 800ml H2O中加186.1g EDTANa2 2H2O，用NaOH调 pH至8.0，定溶至 1 升)
3. 20% SDS    (2L: 在