脑膜炎奈瑟菌实验室检测操作规范.doc

附件7 脑膜炎奈瑟菌实验室检测操作规范
一、脑膜炎奈瑟菌鉴定程序和标准
1、 脑膜炎奈瑟菌细菌鉴定程序
脑膜炎奈瑟菌的鉴定通常是通过在CAP和BAP上生长物通过革兰染色镜检和生化反应检测以确定是否为脑膜炎奈瑟菌，在此基础上再通过脑膜炎奈瑟菌分群诊断血清进行血清分群。

BAP,CAP生长物
革兰氏染色为阴性双球菌
氧化酶反应
阳性，进行生化鉴定
阴性，非脑膜炎奈瑟菌
生化鉴定（糖氧化）

Glu Mal Lac Suc
＋ ＋ － －
阳性，为脑膜炎奈瑟菌
进行血清分群
阴性，非脑膜炎奈瑟菌
A、B、C、H、I、K、L、W135、X、Y、Z、Z´(29E)不同血清群

图xx 脑膜炎奈瑟菌鉴定程序
2、 脑膜炎奈瑟菌感染确诊实验室检测
疑似流脑病例具有以下实验室检测结果之一，即可确诊：
1. 培养：自脑脊液或血液标本中分离到脑膜炎奈瑟菌。
2. 乳胶凝集检测：采用乳胶凝集检测试剂盒，脑脊液标本乳胶凝集检测结果阳性，目前Bio-Rad乳胶凝集检测试剂盒能检测A群、B群、C群和W135/Y群脑膜炎奈瑟菌感染。
3. PCR检测：脑脊液标本或血液标本PCR扩增特异性脑膜炎奈瑟菌DNA片段阳性。 通过ctrA基因扩增，鉴定脑膜炎奈瑟菌，通过扩增orf-2、siaD(B)、siaD(C)、siaD(Y)、siaD（W135）等基因片段鉴别不同的血清群，或通过Real-time PCR检测出特异性基因片段阳性。
4. 血清IgG抗体滴度4倍增高：恢复期血清抗体滴度较急性期4倍增高。

二、脑膜炎奈瑟菌标本接种培养
（一）脑脊液标本
1．脑脊液标本预处理
脑脊液标本送到实验室后，应立即离心，2000rpm，20min，用巴斯德吸管吸取上清，进行乳胶凝集实验检测抗原。离心后的沉淀进行剧烈振荡或充分混合。取1滴沉淀准备革兰染色，1滴划线接种原始培养基。（注意:如果获得的脑脊液不足1mL则不进行离心，直接用其进行革兰染色和涂板培养）。
2. 脑脊液标本初代培养 脑膜炎奈瑟菌的初代接种培养基为巧克力琼脂平板。将离心后的脑脊液标本沉淀滴加至巧克力琼脂平板，取菌环划线接种。置5%的CO2孵箱或燃有蜡烛的烛缸中培养。也可将一些沉淀接种备用肉汤培养基（如脑心浸液肉汤培养基），进行孵育培养。如果用T-I培养基进行运输，在孵育24h后，用无菌的针或注射器转移100 µl T-I培养基的液体部分到BAP及CAP上，并划线分离。
3. 脑脊液标本革兰染色（Hucker 改进方法）
脑脊液标本离心沉淀物革兰染色或采用乳胶凝集方法检测CSF中特殊的抗原成分两种检测方法，可作为流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌引起的细菌性脑膜炎的初步诊断。即使标本培养阴性，革兰染色或乳胶凝集检测结果阳性或其中任何一个检测结果阳性即可以作为感染的证据。
（1） 脑脊液标本离心，2000rpm，20min。
（2） 酒精清洗并干燥的玻片，滴加1滴～2滴沉淀物，允许多滴汇集成一个大滴，不要铺开液体或使用过高浓度的沉淀物。可能的情况下，在生物安全柜中风干玻片。
（3） 将玻片三次快速通过火焰以固定涂片，不应该灼干。也可以使用异丙醇（95％-100％）固定。
（4） 草酸铵结晶紫染色玻片，1min。流水冲洗玻片1min，并去除多余的水分。
（5） 革兰氏碘液染色玻片，1min。流水冲洗玻片并干燥。
（6） 95%的乙醇脱色（5s-10s足够）。
（7） 番红精复染20s-30s或用酚红复染10s-15s。流水冲洗玻片并拭干玻片。显微镜观察染色的涂片，用亮视野的透镜和油镜。
脑膜炎奈瑟菌通常出现在多形核白细胞内或细胞外，革兰阴性、咖啡豆形双球菌。
（二）血液标本
1. 接种血培养瓶：采取血液标本后直接接种血培养瓶，应在培养前排气，放置在35℃，排气通常是在血培养瓶的橡胶部分插入一个塞有棉花的无菌针头来实现。
2.传代培养
（1）血培养瓶观察 血培养瓶在培养14h～17h后开始进行观察，以后每天都要进行观察，直至第7天。红血球发生任何混浊或溶解都可能是细菌生长的指示，应该立即进行传代培养。脑膜炎奈瑟菌很脆弱，因此不管血培养瓶的表象是否变化，培养14h～17h、48h和7天时都应进行传代。出现浑浊和细菌生长二者并不一定有相关性，不出现浑浊并不意味着细菌一定没有生长。在传代前应搅动瓶子混匀内容物。
（2）血培养瓶培养物转种 用乙醇和聚烯吡酮碘拭子消毒血培养瓶橡胶塞表面，用带针头的注射器从血培养瓶中吸取少量（0.5mL）液体，接种于巧克力琼脂平板（CAP）和血琼脂平板(BAP)。当只使用一种琼脂时，应该接种CAP，因为CAP含有流感嗜血杆菌生长所必需的因子，而BAP是没有的。划线方式接种琼脂平板，在CO2空气中培养至48h。当细菌的生长已经通过血琼脂传代而确定时，则不需要再继续培养血培养瓶。瓶子应该按照生物安全程序处理。
（三）、T-I培养基
T-I培养基接种标本后，培养24h，用无菌针头或注射器将100μl T-I培养基液体加至BAP和CAP上，划线，CO2空气中35℃培养至48h。可通过革兰染色检测生长物纯度。如果BAP或CAP琼脂上没有细菌生长，应分别在第3天和第7天再次进行传代培养。培养后的T-I培养瓶应该按照生物安全程序处理。
（四）、脑膜炎奈瑟菌形态学特征
BAP平板上的脑膜炎奈瑟菌新鲜菌落呈现圆形，光滑、湿润、光泽、中央凸起、有完整的边界，一些菌落与周围的菌落接合。培养物灰色，不产生色素，陈旧菌落变成灰色半透明，有时导致底部琼脂变暗。充分分开的菌落可以在18h生长成直径为1mm，几天后变为4mm，有时带波浪形的边界。

三、脑膜炎奈瑟菌生物化学特征和鉴定
生长一天的培养物检测结果会好一些。革兰染色检查生长物的纯度是最常进行的检测（脑膜炎奈瑟菌是一种革兰阴性、咖啡豆样的双球菌）。如果有必要，需要进行再次传代培养以保证纯度。取BAP培养基上的生长物，进行Kovac´s氧化酶实验，并鉴定血清群。最后，用碳水化合物（糖类）反应确认实验结果。
（一） Kovac´s氧化酶实验
氧化酶实验测定的是细胞色素氧化酶。含有细胞色素酶C（呼吸链上的一种成分）的微生物可以将四甲基-p-苯二胺氯化物转变为紫色化合物。
1． 制备1％的氧化酶试剂
为防止储存的粉状氧化酶试剂变质，应将其置于封闭干燥的瓶子中，存放于阴凉处。用蒸馏水制备10mL 1％的四甲基-p-苯二胺氯化物溶液，分装为1mL的等份体积，-20℃冻存。使用时，融化1管1mL试剂，并在无孔表面（如：Petri碟、玻璃平皿等）润湿尽可能多的滤纸条。自然风干滤纸条。等滤纸条完全干燥后，将其放入严密封盖的试管或瓶子中，4℃保存，随用随取。
注意：氧化酶试剂只能做体外诊断用。避免沾染皮肤和眼睛。它可引起刺痛。不慎沾染时，立即用大量清水冲洗眼睛或皮肤至少15min。
2.实验操作
用铂金接种环、一次性塑料环或木质面签，挑取一部分待测试的菌落，涂抹至制备好的滤纸条上。不要使用镍铬合金环，因为它可能导致假阳性反应。
3.实验结果的判读
脑膜炎奈瑟菌不太可能出现延迟反应，10秒钟之内呈紫色为阳性反应。这只是脑膜炎奈瑟菌的辅助识别实验，奈瑟菌属的其它细菌以及其他无关的菌种，也可能会出现阳性反应。
（二） 脑膜炎奈瑟菌碳水化合物利用检测（胱氨酸胰酶解酪蛋白琼脂法)
碳水化合物利用实验可用来进一步验证脑膜炎奈瑟菌菌株，不同的碳水化合物加到胱氨酸胰酶解酪蛋白琼脂中，终浓度为1％。确定一个菌株是否是脑膜炎奈瑟菌，可使用四种单糖糖管（葡萄糖、麦芽糖、半乳糖和蔗糖），奈瑟氏菌属细菌产酸是通过氧化碳水化合物而不是通过发酵碳水化合物。脑膜炎奈瑟菌能氧化葡萄糖和麦芽糖，不能氧化半乳糖和蔗糖。培养基中含有敏感的酚红指示剂，当有酸存在时（pH≤6.8）时显示黄色。
1.实验操作步骤
用接种针头从BAP或CAP过夜培养物中取少量菌培养物。几次穿刺接种物至培养基上部10mm。接种不同的待测碳水化合物培养基，要使用单独的针头或灼烧针头。旋紧管子的帽子，放入35℃孵箱（不需要CO2），至少培养72h，如果还是阴性就丢弃。
2.实验结果的读取
可见浊度加深并且培养基的上部变成黄色说明细菌生长并产酸，可以认为结果阳性。虽然反应有时可以在接种24h发生，但是一些反应延迟，培养72h之前不能轻易认定为阴性结果。
3.奈瑟氏菌属和摩拉克氏菌属的一些种碳水化合物的利用见表

菌种
产酸来源
葡萄糖 麦芽糖 半乳糖 蔗糖
脑膜炎奈瑟菌
淋球菌
干燥奈瑟氏菌
乳糖奈瑟氏菌
摩拉克氏菌
+ + - -
+ - - -
+ + - +
+ + + -
- - - -

四、脑膜炎奈瑟菌免疫学检测
（一）脑膜炎奈瑟菌血清学鉴定
1.脑膜炎奈瑟菌血清
目前，基于荚膜多糖已确定了13个不同的血清群：A、B、C、H、I、K、L、W135、X、Y、Z、Z´(29E)，D 血清群已不再检测。A、B、C、W135及Y是最常见的引起脑膜炎的血清群。A群是导致非洲和亚洲脑膜炎流行的最主要血清群，其次是C群，现在已有商业化的分群血清，包括美国Remal血清、BD脑膜炎奈瑟菌诊断血清、法国Bio-Mureux 诊断血清等。
2.血清学鉴定操作
（1）用乙醇擦净一块载玻片，用蜡笔或其它记号笔将载玻片分为三个部分，每个部分10mm×4mm。
（2）在每个部分的近底部处加10µl 0.5％的生理盐水，用无菌接种环、针、无菌涂棒或牙签从巧克力平板或血平板上采取细菌培养物，在生理盐水中，将培养物制成用于测试的略呈乳液状的悬液。
注意：出于安全考虑，推荐使用福尔马林灭活的脑膜炎奈瑟菌悬液，而不是活菌的生理盐水悬液。福尔马林是一种致癌物，在储存和使用时须高度小心，操作应在安全柜中进行操作。
（3）在每个部分的上部加上所选的血清各10µl以及10µl生理盐水或PBS。
（4）在亮光下或黑色背景下，将抗血清或生理盐水与各自的培养菌悬液混合，摇动玻片1min-2min（时间可能会因为血清的制造者不同而有所差异）。
3.实验结果的读取
（1）凝集应该只与一种血清凝集而与生理盐水不发生凝集。
（2）在生理盐水中凝集说明培养菌有自凝性。
（3）和几种抗血清凝集而无自凝现象，说明培养菌的粗糙的。
（4）和任何一种抗血清或生理盐水都不能发生凝集，说明菌株为不能分群菌株。这样的结果在新鲜分离株中很少发生，但确实会偶尔发生。
（二）脑膜炎奈瑟菌乳胶凝集检测
1.乳胶凝集试剂
现在有几种商品化的试剂盒可用，目前商业化的试剂盒包括Bio-Rad公司产品以及BD公司产品。当使用这些试剂盒时，应严格遵照制造商的操作说明进行，为了获得最佳的结果，CSF样本上清应尽快检测；如果不能立即检测，样本在几个h内应冷藏在2℃-8℃，或保存在-20℃，可以冻存更长的时间。试剂应该2℃-8℃保存，在较高的温度时，尤其是在热带地区，试剂会被破坏，即使在试剂盒的有效期内测试结果也可能会导致偏差结果。乳胶悬液试剂不应该冻存。
2.乳胶凝集监测操作步骤
（1) CSF上清在沸水浴中加热5min。
（2) 轻摇乳胶悬液直至均匀。
（3) 在环形玻片或一次性卡片上，每种乳胶悬液滴加1滴。
（4) 向每种悬液滴加30μl-50μl CSF。
（5) 用手摇动2min-10min，建议在可能的情况下100rpm机械摇动。见3.实验结果的读取
在亮光下读取，不需要扩大倍数。
（1) 阴性反应：悬液仍呈现均质状并出现肉眼可见轻微的牛奶状外观。
（2) 阳性反应：2min内，乳胶颗粒凝集（或可见团块）。
注意：逆向免疫电泳可能也可用于CSF中直接抗原的检测。

五、 脑膜炎奈瑟菌分子检测
1. 引物序列
（1） 脑膜炎奈瑟菌种属特异性引物
crgA 5’-GCTGGCGCCGCTGGCAACAAAATTC-3’
5’-CTTCTGCAGATTGCGGCGTGCCGT-3’
（2） A群脑膜炎奈瑟菌引物
orf-2(A) 5’-CGCAATAGGTGTATATATTCTTCC-3’
5’-CGTAATAGTTTCGTATGCCTTCTT-3’
（3） B群脑膜炎奈瑟菌引物
siaD(B) 5’-GGATCATTTCAGTGTTTTCCACCA-3’
5’-GCATGCTGGAGGAATAAGCATTAA-3’
（4） C群脑膜炎奈瑟菌引物
siaD(C) 5’-TCAAATGAGTTTGCGAATAGAAGGT-3’
5’-CAATCACGATTTGCCCAATTGAC-3’
（5） Y群脑膜炎奈瑟菌引物
siaD(Y) 5’-CTCAAAGCGAAGGCTTTGGTTA-3’
5’-CTGAAGCGTTTTCATTATAATTGCTAA-3’
（6） W135群脑膜炎奈瑟菌引物
siaD(W135) 5’-CAGAAAGTGAGGGATTTCCATA-3’
5’-CACAACCATTTTCATTATAGTTACTGT-3’
2. PCR扩增条件
94℃，3min；
94℃，30s，55℃，40s，72℃，30s，共30个循环；
72℃，10min。
3. 结果判断
PCR扩增结束后，1.5%-2%琼脂糖凝胶检测，电压6V/cm。脑膜炎奈瑟菌种属特异性crgA基因为230bp的条带，A群脑膜炎奈瑟菌orf-2基因为400bp条带， siaD基因扩增结果分别为：B群450bp、C群250bp、Y群120bp、W135群120bp条带。