临床微生物标本的送检与采样指南.doc

临床微生物标本的送检与采样指南
呼吸道标本采集及运输

一、 上呼吸道标本
1、送检指征 上呼吸道感染包括咽炎、喉炎、会厌炎等，凡具有以下情况任何一项者疑似患者。
1.1 病毒性普通感冒伴有明显咽痛时，怀疑为咽部链球菌感染，应做细菌培养。
1.2 细菌性咽-扁桃体炎：明显咽痛、咽部发红、畏寒、发热， 体温可达39°C以上。1.3 喉咙痛、咳嗽、喉部有脓样分泌物等临床症状。
1.4 上呼吸道感染易并发鼻窦炎、中耳炎、气管-支气管炎，需送相应部位分泌物或痰液进行细菌培养。
2、标本采集 上呼吸道标本包括鼻、鼻咽、咽拭子标本。应根据临床表现和感染部位的不同有选择性的采集标本，以便更好地分离出病原菌。采集时应选择无菌、不含抑制剂的棉拭子，预先用无菌生理盐水或营养肉汤蘸湿拭子，并直取感染部位，减少污染。2.1 鼻拭子的采集：最好使用扩鼻器，先用拭子拭去鼻黏膜表面的分泌物并丢弃，用第2个试子蘸取无菌生理盐水或营养肉汤，插入鼻孔采集病灶标本。
2.2 咽拭子的采集：采集标本时患者先用清水漱口，由检查者将舌向外拉，使腭垂尽可能向外牵引，用无菌的鼻咽拭子（一端弯曲的金属棉拭）由口腔进入，越过舌根到咽后壁或腭垂后侧，采集鼻咽红肿处标本，取材后小心将试子退出，立即放人无菌试管内。若咽部明显发红或有假膜存在时，应在局部擦拭取标本（最好拭子从膜底下擦拭）。采集标本可在咽部多点采集标本，以提高检出率。若无局部病变或做带菌者测试应于咽部或扁桃体上擦拭。
3、 采集时间及频率
3.1 检查时间：应于抗菌药物应用之前。时间上无严格限制，但咽部是呼吸和食物的通路，也应晨起后采集为佳。
3.2 采集频率：重复采集标本的频率一般每日最多1次。
4、标本的运输 标本采集后应立即送检，室温运送时间小于2小时，如果不能立即接种，必须装在无菌运送培养基中，避免由于干燥而使某些细菌死亡。检测淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌的拭子应放人含碳的转运培养基，采集后2小时内接种平板，以防细菌死亡。
5、注意事项
5.1应于抗菌药物治疗前采集鼻咽喉拭子标本。
5.2标本采集前数小时不得用消毒药物漱口或涂抹病灶局部。
5.3用拭子采集标本时应小心、准确地在采集部位采取，避免触及舌、口腔黏膜和唾液，以防污染。
5.4疑为白喉杆菌感染时，应在咽部深沉组织中采取标本，避免咽部表面正常菌群污染。5.5采集扁桃体标本时，应以晨起后采集为宜。
5.6采集标本时应戴口罩和手套，以防传染。
5.7咽部是呼吸和食物的通路，应以晨起后采集为宜。
5.8最好采集2份拭子，以方便直接涂片染色镜检和接种培养。
5.9采集标本用的拭子最好含藻酸钙或涤纶纤维的小头拭子采集。人造丝或棉拭子不能用，因为其所含的脂肪酸对病原菌有害。
二、下呼吸道标本
1、送检指征 凡是发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、黏稠或血性，并伴有胸痛、气急，肺部闻及湿啰音，外周血白细胞总数及中性粒细胞比例明显增高，X线检查提示有炎症性浸润或胸腔积液，甚至出现感染性休克和呼吸衰竭的患者，应采集痰液或下呼吸道的标本。
2、标本采集时间
2.1以晨痰为好。多数患者晨痰较多，即使对谈量少的患者，也以清晨采集最为容易。对支气管扩张症与支气管相通的患者，清晨起床后进行体位引流，可采集大量痰液。
2.2在应用抗菌药物之前采集标本。
3、采集方法 合格的标本采集是取得正确检验结果的关键，因此临床工作人员要教会患者如何采集或亲自去采集，取得深部的痰液而不是唾液。
3.1自然咳痰法：患者清晨起床后，用冷开水（无菌生理盐水）反复漱口（用湿牙刷刷口腔黏膜、舌头和牙龈5至10分钟，勿用牙膏）后用力自气管咳出第一口痰（戴假牙者取出假牙后漱口）。对于痰量少或无痰的患者可进行诱导咳痰，及采用雾化吸入加温至45°C的100g/LNaCl溶液，使痰液易于排出。将痰采集于无菌容器中尽快送检。
3.2支气管镜采集法：用支气管镜在肺内病灶附近用导管吸引或用支气管刷直接取得标本。此法患者常不愿接受。
3.3胃内采痰法：该方法于清晨空腹时，将胃管插入胃内，用注射器抽取胃液。适用于无自觉症状的肺结核患者尤其是婴幼儿不会咳嗽，常将痰吞入胃，可采集胃内容物做结核分支杆菌培养，其阳性率比咳痰高10%左右。
3.4 人工气道采痰法：通过气管切口插管，负压吸引取得痰液，可用于厌氧菌培养。
3.5小儿取痰法：用弯压舌板向后压舌，用棉拭子伸入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上，尽快送检。
4、标本的运送
4.1标本采集后尽快（小于2小时）送至实验室，不及时运送可导致肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌由于不适应外界环境和自溶现象而死亡。
4.2延迟送检或待处理标本应置于4°C冰箱保存（疑肺炎链球菌感染、流感嗜血杆菌等苛养菌感染标本不能冷藏），以免杂菌生长，但保存标本应在24小时内处理。
4.3对可疑烈性呼吸道传染病（如SARS、肺炭疽、肺鼠疫等）的患者检验标本，在采集、运输或保存过程中必须注意生物安全防护。
5、 注意事项
5.1采集标本以清晨为佳，采集前应先用冷开水充分漱口，以免口腔正常菌群污染标本。
5.2标本采集后应立即送检。
5.3结核分枝杆菌检查，痰量要多。
5.4肺部感染的患者可能患有菌血症，应同时做血液培养。
5.5一般不主张采用肉汤增菌或高选择性培养基来对标本进行增菌或分离培养。
5.6气管插管24h后会有定值菌，仅当出现临床肺炎症状（发热和浸润）时，否则切勿培养气管吸出物，因培养结果可能与疾病不符。
附注：Lentino and Lucks评价用于临床痰培养的标本有如下情况：
1. Bartlett和Murray及Washington的痰质量分级系统，48%的送往实验室的痰培养未通过质量分级，而较多的是口腔分泌物；
2. 26.5%的脓痰标本来自未显示出反射学和临床症状证据的病人；
3. 40%的痰标本来自未深入祛痰而较多的是口腔分泌物的病人;
4. 只有56.8%有症状的病人产生脓痰。
临床血液培养标本采集、运输、处理
血流感染的发生发展可以严重威胁患者的生命，其正确诊断不仅可以减少抗菌药物的误用和滥用，同时可以大大地改善患者的预后，降低患者的病死率，减少医疗花费。本指南详细介绍血培养标本采集时间、套数、血量要求、标本运输、皮肤消毒注意事项、导管相关性血流感染以及感染性心内膜炎诊断规范、快速鉴定血培养中的念珠菌、MRSA、葡萄球菌等新方法。提醒广大医务工作者严格执行血流感染的诊断规范，快速报告实验结果，强调实验室及时与临床沟通，提高血流感染诊断水平的重要意义。
1、 采血时间
研究表明，细菌大量入血的时间为患者寒颤发热前1小时，在此期间，应同时（或间隔30-60 min）采集2-3套血培养，只有在怀疑患者有感染性心内膜炎或其它血管内感染（如导管相关性感染）时，才有必要间隔较长时间多次采集血培养。
2、 血培养数量
在每次败血症期间，推荐采集2-3套血培养。对于****，不应仅做1套血培养，不仅因为采血量不足，而且1套血培养的结果较难解释。由于在开始抗菌治疗后，患者血液中的致病菌不会立即清除，2-5天内无须重复进行血培养。但对于感染性心内膜炎患者，应多次进行血培养以评估和指导治疗；由金葡球菌引起的败血症（非感染性心内膜炎），应在48-96 小时重复培养以判断其是否为复杂性金葡菌败血症。
3、 血培养采血量
采血量对于败血症的检测非常重要。对于****，采血量在2-30 ml时致病菌的检测与血量成正比，虽然采血量增长至40 ml（甚至更高）时血培养阳性率仍在提高，但已经不再与采血量成正比。对于婴幼儿，采血量不应超过患儿总血量的1%。
4、 血标本在需氧瓶和厌氧瓶间的分配
在常规血培养中，推荐成对使用需氧瓶和厌氧瓶。如果采血量低于推荐血量，应将血标本先注入需氧瓶，再将剩余血液注入厌氧瓶，因为大部分败血症是由需氧或兼性细菌及酵母菌引起的。如果仅做需氧培养，每套培养应使用2个需氧瓶并保证有足够的血量。5、 皮肤消毒以避免污染
为减少皮肤菌群对血培养的污染，应对静脉穿刺点进行消毒。研究表明碘酊、过氧化氯和葡萄糖酸洗必泰优于聚维酮碘，碘酊与葡萄糖酸洗必泰效果相近。碘酊应作用30 s，碘伏应作用1.5-2 min。葡萄糖酸洗必泰也应作用30 s，它较少引起过敏，因而在静脉穿刺后不需擦掉，但不能用于2个月以内的新生儿皮肤消毒。
6、 血培养采集和运输
血标本采集应严格遵守无菌操作，从静脉采血。留置导管血通常比静脉穿刺血培养污染率高。若分析导管相关性感染，应在采集导管血的同时，静脉穿刺采集外周血进行对比。如果从静脉管道采血，不需要弃去开始段的血液，也不需要使用生理盐水冲洗管道以消除抗凝剂，因为其抗菌作用通常可以被培养基有效稀释消除。
静脉穿刺点选定后，去除血培养瓶的瓶帽，然后再对静脉穿刺点消毒自然干燥后进行采样。采血人员除非佩戴无菌手套，在患者皮肤消毒后不得触碰其静脉。血液注入血培养瓶前更换针头对于污染率的减少作用甚微，且易引发针刺伤。血标本注入血培养瓶后应轻轻翻转数次，以免凝血。无论使用什么方法采集血培养，应尽量减低血培养的污染率至≤3%。
血培养瓶应在2小时内送至实验室，延迟上机会延缓甚至阻碍病原菌生长。培养瓶在室温仅能存放数小时。切忌将培养瓶冷藏或冷冻，冷藏或冷冻会导致部分病原菌死亡，冷冻可能导致培养瓶破裂。
7、 血培养标本拒收原则
标识错误或没有标识的培养瓶；破损或渗漏的培养瓶；凝血。
临床尿液标本采集
1、送检指征 尿路感染、肾结核、泌尿系结石、膀胱排空受损或前列腺增生等患者，出现尿频、尿急、尿痛等膀胱刺激症状，肉眼脓尿或血尿，尿常规检查有白细胞或亚硝酸盐阳性，不明原因的发热、尿道口有脓性分泌物等症状，以及泌尿系统疾病术前等情况应采集尿液标本送检。
2、标本采集
2.1采集时间：应选择在抗菌药物应用之前采集尿液。通常应采集晨起第1次尿液送检，确保尿液在膀胱内停留4小时以上。疑似沙门菌感染、钩端螺旋体感染时，一般在发病2周左右采集尿液培养。
2.2采集方法
2.2.1 清洁中段尿采集法：嘱患者留取标本前一天晚上少饮水，晨起女性用肥皂水清洗外阴部（男性翻转包皮，清洗尿道口），再以灭菌水冲洗尿道口，然后排尿弃去前段，留取中段尿10-15ml于灭菌容器内，立即加盖送检。
2.2.2膀胱穿刺采集法：严格无菌操作消毒耻骨联合上皮肤，用无菌注射器穿刺入膀胱抽取5-10ml尿液送检。此法有一定的痛苦，患者难以接受。主要用于厌氧菌培养或留取标本标本困难的婴儿尿标本采集。此法可避免尿液标本污染。
2.2.3导尿法：
直接导尿采集法：按常规方法做会阴局部消毒后，用导尿管直接经尿道插入膀胱，先弃去前段15ml，再留取10-15ml膀胱尿液于灭菌容器内送检。次法可减少尿液标本的污染，准确地反映感染情况。但有可能将下尿道细菌引入膀胱，导致继发感染，一般不提倡使用。
留置导尿采集法：可用碘酒消毒尿道口处的导尿管壁，用联空针筒的细针斜穿管壁抽吸尿液5-10ml，置于灭菌容器中送检；或消毒后解开接口，弃去导尿管前段尿，留无污染的膀胱内尿液数毫升送检，长期留置导尿管者，应在更换新导尿管后留取尿标本。
2.2.4 集尿法：怀疑结核分枝杆菌感染时，可用一清洁容器，留24小时尿取其沉渣10-15ml送检。
3、标本采集量 一般****最好采集10-15ml，婴幼儿不少于1ml，尿量不足，培养结果可能不可靠。
4、标本采集容器 容器应该采用不与尿液成分发生反应的惰性材料；容器应洁净、无菌、加盖、封闭、防渗漏，且不含防腐剂和抑制剂；容器应广口，具有较宽的底部，容器应在40ml左右，容器盖应易于开启。
5、标本运送 标本采集后应及时送检和接种，室温下存放时间不得超过2小时（夏季保存时间应适当缩短或冷藏保存），4-8°C冷藏保存时间不得超过24小时，但应注意冷藏保存的标本不能用于淋病奈瑟菌培养。
粪便标本采集
1、送检指征 当腹泻患者出现以下任何一种情况时建议采集粪便标本，进行细菌培养：腹泻、大便每日≥3次，粪便的性状异常，可为稀便、水样便、黏液便、脓血便及血便，可伴有恶心、呕吐、食欲不振、发热、腹痛及全身不适等；病情严重者，因大量丢失水分引起脱水、电解质紊乱甚至休克；粪便涂片镜检白细胞≥5个/HP；抗菌药物治疗后腹泻；来自疫区的患者等。
2、采集方法
2.1自然排便采集法 自然排便后，挑取有脓血或黏液部位的粪便，液状粪便取絮状物盛于无菌容器内或置于保存液或增菌液中送检，若不能及时送检，按1：10比例与pH7.0磷酸盐甘油缓冲液（0.03mol/L磷酸盐缓冲液与等体积甘油混匀）混合保存，或置于Cary-Blair运送培养基中，以防病原菌死亡而影响检出率。
2.2直肠拭子采集法 适于排便困难者或婴幼儿。可用肥皂水将肛门周围洗净，用无菌盐水、保存液或增菌液润湿的肛门采样拭子或玻璃采便器插入肛门，****约4-5cm。儿童约2-3cm，与直肠黏膜表面接触，轻轻旋转，将拭子置于Cary-Blair运送培养基中或pH7.0磷酸盐甘油缓冲液中送检。
3、 标本采集量
一般用拭子采集大于2g的标本送检，若标本为水样，采集大于2ml的标本置于无菌容器中送检。
4、采集时间及频率
4.1 采集时间 尽可能在发病早期（急性期（3日以内））和应用抗菌药物治疗之前，采集新鲜标本送检，以提高检出率。怀疑沙门菌感染时，应在发病2周以后采集标本送检。
4.2 采集频率 重复采集标本的频率每日最多1次。
5、 标本的运送
5.1粪便标本应尽快送检，室温条件下运送标本的时间不能超过2小时。如不能及时送检可加入pH7.0磷酸盐甘油缓冲保存液中或使用Cary-Blair运送培养基置于4°C冰箱保存，但保存时间不能超过24小时。
5.2 直肠拭子采集的标本必须置入Cary-Blair运送培养基或GN肉汤中送检，室温运送时间不超过2小时，4°C冰箱保存时间不超过24小时。
5.3高度怀疑霍乱弧菌感染的标本运送必须符合特殊标本的安全要求。
穿刺液标本采集
一、 脑脊液标本的采集、运送
1.送检指征：发热、头痛、恶心，呕吐、颈强直和反射增强等症状，怀疑为脑膜炎的患者。儿童：儿童和新生儿的临床表现不明显，因此对于婴儿不明原因发热，应怀疑为脑膜炎，采集脑脊液送检。
2.采集时间 当怀疑患者脑膜炎时应立即采集脑脊液，并尽量在应用抗生素之前采集脑脊液标本。
3.采集方法及采集量 脑脊液通常是经腰椎穿刺采集（注意严格无菌操作），如果用于检测细菌或病毒，脑脊液量应大于或等于1ml,如果用于检测真菌或抗酸杆菌，脑脊液量应大于或等于2ml。
4.标本的运送 标本采集后应在15分钟内送至实验室。若延误送检，标本应置于室温保存，但保存时间不超过24小时，但送检延迟可能对苛氧菌的检出有影响。脑脊液标本不可放冰箱保存，以防某些细菌死亡（如脑膜炎奈瑟菌，肺炎链球菌和嗜血杆菌）。
二、胸腹水标本的采集和运送
1.送检指征
1.1 胸水：患者多伴有胸痛，发热，若胸腔积液未浑浊，乳糜性，血性或脓性是应送检。
1.2 腹水：有腹胀，腹痛，呕吐，腹部压痛，肌紧张，肠鸣音减弱或消失等症状的患者，腹部积液增多且为渗出液时，应送腹水培养。
2.采集时间 怀疑感染存在，应尽早采集标本，一般在患者使用抗菌药物之前或停用药后1~2日采集。
3.采集方法
3.1 浆膜腔积液标本由临床医师行胸腔穿刺术，腹腔穿刺术或心包穿刺术分别采集，注意严格无菌操作。
3.2 送检标本最好留取中段液体于灭菌容器中，或直接接种于血培养瓶中，标本采集量1~5ml，不能用拭子蘸取标本送检；对于非卧床透析患者的腹膜炎诊断要采集最少50ml标本才有利于检出病原体。如查结核分枝杆菌则约需10ml。
3.3 标本采集后若注入无菌小瓶或无菌试管中，应在容器中先加入灭菌肝素然后再加入标本（或直接注入血培养瓶），以防止穿刺液凝固（0.5ml肝素可抗凝5ml标本，但抗凝剂可能影响苛氧菌的分离）。
4、标本的运送 一般胸腹水标本采集后15分钟内应送至微生物室，如不能及时送检室温保存不超过24小时。若做真菌培养需4°C保存。
脓液及创伤感染分泌物标本采集、运送及处理
1、送检指征
1.1局部症状：红、肿、热、痛和功能障碍时化脓性感染的五个典型特征。但随病程迟早、病变范围、位置深浅不同，五个症状不一定全部表现。病变范围小或位置较小时，局部症状可不明显。
1.2全身症状：轻重不一。感染较重者常有发热、头痛、全身不适、乏力食欲减退等，一般均有白细胞计数增加，核左移及CRP升高。病程较长时，可有水和电解质紊乱，血浆蛋白减少，肝糖原大量消耗，可出现营养不良、贫血、水肿等症状。全身性感染严重的患者可发生感染性休克。
1.3 疑为下列疾病时需送检
1.3.1 软组织的急性化脓性炎症：如疖、痈、急性蜂窝织炎、丹毒等。
1.3.2化脓性疾病：如甲沟炎、化脓性关节炎、化脓性骨髓炎、气性坏疽、细菌性结膜炎、鼻窦炎、化脓性扁桃体炎、急性化脓性中耳炎、急性化脓性乳突炎、急性***炎、急性胆囊炎、急性梗阻性化脓性胆管炎、心包炎、结核性腹膜炎。
1.3.3脓肿：扁桃体脓肿、咽部脓肿、咽旁脓肿、牙龈脓肿、脑脓肿、肺脓肿、肝脓肿、脓胸、腹腔脓肿、肾皮质化脓性感染、肾周围炎和肾周脓肿、直肠肛管周围脓肿。
1.3.4创伤感染：外伤感染、术后切口感染、导管感染、脐带残端感染。
2、采集方法
2.1开放性脓肿：开放性脓肿标本包括眼（结膜、角膜）、耳（外耳）、扁桃体、术后切口感染等脓性分泌物。首先用无菌生理盐水清洗病灶表面的污染杂菌，用无菌棉拭子先蘸少许无菌肉汤或生理盐水，然后采取靠近组织部分脓液及病灶深部的分泌物（最好从脓肿底部或脓肿壁取样）立即送检，至少要采集两个拭子标本，其中一个用于细菌培养，另一个用于革兰涂片染色。而瘘管则以无菌方法采取组织碎片，置于无菌试管中送检。2.2闭锁性脓肿：闭锁性脓肿标本是指有完整脓壁与体腔，与外界不相通的脓肿，如疥、痈、淋巴结脓肿、乳腺脓肿、肺脓肿、肝脓肿、脑脓肿、肾周脓肿、阑尾脓肿、胸腔脓肿、腹腔积液、心包积液、腹腔脓肿、关节腔积液、肛周脓肿等标本。闭锁性脓肿应采集渗出物和脓肿壁标本，注意不主张用拭子采集标本，在采集此类标本前对患者病灶局部的皮肤或黏膜表面，用2.5%~3%碘酊消毒、75%乙醇脱碘，用无菌注射器将脓肿内容物吸出，然后切开脓肿、引流、采集脓汁（大于1ml）用于检验，并取部分脓肿壁置于厌氧运送装置或接种于厌氧培养基中立刻送检，或无菌注射器抽取的脓肿内容物用于厌氧菌检验。
3、送检时间 怀疑感染存在，应尽早采集标本，一般在患者使用抗菌药物之前或停止用药后1~2日采集。
4、标本的运送 标本采集后应在室温2小时内送至微生物实验室进行处理，若不能及时送检，需氧培养的标本除对环境敏感的淋病奈瑟菌、脑膜炎双球菌和流感嗜血杆菌等标本外，可保存在4℃冰箱中，但保存时间不超过24小时。需做厌氧培养的标本若不能及时送检，需在厌氧条件下室温保存，或用厌氧运送培养基运送，但保存时间不超过24小时
微生物临床标本拒收原因
实验室遇到下列情况标本时应拒绝接收，并及时通知采集标本的医生或护士，说明拒收原因，同时登记备案。
1. 不准确的运送温度。
2. 不准确的运送工具。
3. 延长送检时间。
4. 标本容器上未贴标签或错贴标签。
5. 标本有泄漏。
6. 盛标本的容器被压碎或有破裂。
7. 标本有明显污染。
8. 标本量不足或已干。
9. 24小时内重复送检的标本（血培养除外）。
10. 对某种试验不适合的标本（如尿液做支原体培养等）。
11. 血培养的标本当使用不适当类型的培养瓶采集标本（如需氧瓶、厌氧瓶、真菌瓶），或用过期的培养瓶采集标本，或采血量不足，或血标本采集后放置12小时以上（手工法除外），或冷藏保存的标本，应视为不合格标本。
12. 对于被尿液、卫生纸等污染的便标本应拒绝接收。
13. 痰标本呈水样或唾液样，为口腔标本；光学显微镜细胞学检查发现口咽分泌物污染明显的标本。