血清总胆固醇(TC)测定操作规程.docx

血清总胆固醇(TC)测定操作规程
A1．2 原理
血清中的胆固醇酯(CE)被胆固醇酯水解酶(CEH)水解成游离胆固醇(Chol)，后者被胆固醇氧化酶(CHOD)氧化成△4—胆甾烯酮，并产生过氧化氢，再经过氧化物酶(POD)催化4—氨基安替比林与酚(三者合称PAP)，生成红色醌亚胺色素(Trinder反应)。醌亚胺的最大吸收在500nm左右，吸光度与标本中总胆固醇呈正比。反应式如下：
胆固醇酯+H2O CEH 胆固醇+游离脂肪酸
胆固醇+02 CHOD △4-胆甾烯酮十H202
2H202+4－氨基安替比林+酚 POD 昆亚胺+4H2O
A1．3 标本采集与处理
对于血脂分析，特别需要强调“分析前”各个环节的质量管理。
A1．3．1 受检者(体检对象或病人)的准备：除总胆固醇不一定用空腹血外，测定甘油三酯、脂蛋白与载脂蛋白的病人必须空腹12h，不饮酒24h后采集血样。对于体检对象抽血前应有2周时间保持平时的饮食习惯，近期内体重稳定，无急性病、外伤、手术等意外情况。妊娠后期各项血脂都会增高，应在产后或终止哺乳后3个月检验才能反映其基本血脂水平。注意有无应用影响血脂的药物，如降血脂药、避孕药、噻嗪类利尿剂、β受体阻滞剂、免疫抑制剂、某些降压剂、降糖药、胰岛素及其他激素制剂等，检验以前应根据所用药物的特性停止用药数天或数周，否则应记录用药情况。对体检对象及做前瞻性观察者，还应注意采血的季节，因为血脂水平有季节性变动，为了前后比较应在每年同一季节检验。应嘱体检对象在抽血前24h内不作剧烈运动。
A1．3．2 静脉采血：除非是卧床的病人，一般在采血时取坐位。体位影响水分在血管内外的分布，因此影响血脂水平。例如站立5 min可使血脂浓度提高5％，15 min提高16％，故在采血前至少应***5min。一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过1 min，穿刺成功后立即松开止血带。静脉阻滞5min可使甘油三酯增高10％～15％。
A1. 3．3 抗凝剂：我国多用血清作血脂检验。如用血浆，多主张用EDTANa2(1mg／mL)抗凝。抗凝血浆中的总胆固醇和甘油三酯水平比血清中约低3％，EDTA用量越多，血浆水平偏低越明显。但肝素抗凝不影响血浆中水平。
A1．3．4 标本处理：血标本应尽快送实验室。室温下放置30min～45min后离心分离血清或血浆，置洁净试管加盖保存。在室温中放置不超过3 h，4C保存可稳定4天。置-70'C可长期保存，但不可反复冻融。
A1．4 试剂
A1．4. 1 酶试剂：本科使用XX公司XX产品号试剂盒，为干粉试剂。临用前用水复溶即可使用。每瓶干粉用水XX ml复溶。复溶后试剂内各主要成分如下：
磷酸盐缓冲液pH7.7 0．4mol/L
假单胞菌胆固醇酯水解酶 ≥800 U/L
奴卡氏菌胆固醇氧化酶 ≥400U/L
辣根过氧化物酶 ≥1000U/L
胆酸钠 3mmol/L
4—氨基安替比林 0.5mmol/L
酚 3.5mmol/L
聚氧乙烯表面活性剂 3g/L
A1.4.2 总胆固醇校准血清：也由XX公司提供，产品号为XX。
A1.4.3 试剂与校准血清的稳定性：未开瓶的试剂于4℃保存，可稳定至有效期。复溶的试剂在2℃～8℃可稳定7天，15℃－25℃可稳定3天。如在稳定期内试剂出现明显的粉红色，弃去不用o
A1.5 仪器， XX型号光电比色计，具500nm～520nm滤光片。
A1.6 操作
标本为及时分离的空腹血清，以及肝素或EDTA抗凝血浆。本法为终点法。测定时标本管与标准管分别加入标本与标准血清各10uL，酶试剂1．00mL，混匀后在37℃放置5 min，或20℃～25℃放置10min后用比色计比色，以试剂空白调零，波长500nm或520nm，颜色至少稳定60min。
A.1．7 计算
A测定
C= ×C0 -------------------------(A1)
A标准
式中：C——测定血清总胆固醇浓度，mmol／L；
A测定——标本管吸光度；
A标准——标准管吸光度；
Co——校准血清中总胆固醇浓度，mmol／L；
A，1．8 操作性能
A1．8．1 精密度：批内CV<1.5％，批间CV<2.5％；
A1．8．2 准确度：以参考方法(ALBK法)定值的血清为校准品时，本法测定结果与ALBK法基本一致。
A1．8．3 灵敏度：以酚为显色剂，总胆固醇为5.2mmol／L时的显色吸光度A500nm 约0.30—0.35。
A1．8．4 可报告范围：血清与酶试剂用量之比为1：100时，测定上限为13 mmol／L。
A1．8．5 特异性：血清中多种非胆固醇甾醇会不同程度地与本试剂显色。一般人血清中非胆固醇甾醇约占总胆固醇的1％，在常规测定时这种影响可以不计。
A1．8．6 干扰：血红蛋白高于2g/L时会引起正干扰；胆红素>170umol/L时有明显负干扰。抗坏血酸与甲基多巴血中浓度高于治疗水平时也使结果偏低。高甘油三酯血症(血清混浊)在本法中(血清与试剂量1：100时)一般无明显影响。
注
1 本法为中华医学会检验学会推荐的总胆固醇测定常规方法(见中华医学检验杂志1995，18：185)。
2 试剂中两种酶－胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的质量十分重要。必须能有效地水解各种脂肪酸的胆固醇酯(有些微生物来源的酯酶不易水解花生四烯酸酯)，对胆固醇的氧化必须完全。选择试剂盒时应测试对血清标本总胆固醇的反应速度，好的试剂一般能在5min内(有的只要1min～2min)反应达到终点。反应不能在10min内完成的试剂不宜采用，其原因可能是原酶质量不好或酶用量太少，后者可使高胆固醇结果偏低。本法所用试剂，要求标本与酶试剂用量的比例为l：100，使可报告范围上限达13mmo1/L，过多地提高标本比例，会使测定上限降低。如果标本中总胆固醇浓度超过13mmol／L，可用生理盐水稀释后重新测定。现在临床很少要求做游离胆固醇测定，如需做游离胆固醇测定，最简便的也是酶法，即在上述总胆固醇试剂中省去酯水解酶；一般游离胆固醇约占胆固醇的30％左右。
3 总胆固醇测定要求标准化，与国际标准取得一致，必须有准确可靠的标准参考物质(SRM)。
1)酶法测定总胆固醇时，血清中大部分胆固醇是酯化的，而且血清基体对酶反应有明显影响，不可使用纯胆固醇溶液为标准。国际上由美国国家标准与技术研究院(NIST)提供代号为SRM909的人参考血清，作为总胆 固醇测定的一级标准；我国也已建立了国家一级标准GBW 09138“人血清胆固醇标准物质”。常规使用的试剂盒必须具有可追溯于以上参考血清的校准血清，方能保证检验结果准确可靠。
2)不可使用总胆固醇的定值控制品作标准。
3)本法使用的校准血清为液态，用前必须充分混匀。
A1. 9 参考值
人群血脂水平主要决定于生活因素，特别是饮食营养，所以各地区调查所得参考值高低不一，应根据冠心病流行病学研究及临床经验统．一制定高胆固醇划分标准。欧美国家制定的标准大致相同，40岁以上人群总胆固醇水平高低的划分大致可定为：
合适水平<5.17mm01/L(200mg/d1)；
边缘水平5.17mm01/L～6.46mmol/L(201mg/dl～219mg/dl)；
高胆固醇血症≥6.47mm01/L(≥220mg/dl)。
A1. 10 临床意义
影响总胆固醇水平的因素有：
A1．10．1 年龄与性别。总胆固醇水平往往随年龄上升，但到70岁或80岁后有所下降，中青年期女性低于男性，50岁以后女性高于男性；
A1．10．2 长期高胆固醇、高饱合脂肪酸和高热量饮食可使总胆固醇增高；
A1．10．3 遗传因素；
A1．10．4 其他。如缺少运动、脑力劳动、精神紧张等可使总胆固醇升高。
高胆固醇血症是冠心病的主要危险因素之一。病理状态下高胆固醇有原发与继发的两类。原发的如家属性高胆固醇血症(低密度脂蛋白受体缺陷)、家属性apo—B缺陷症、多源性(polygenic)高总胆固醇、混合性高脂蛋白血症。继发的见于肾病综合征、甲状腺机能减退、糖尿病、妊娠等。
低总胆固醇血症也有原发的与继发的，前者如家属性的无β或低脂蛋白血症；后者如甲亢、营养不良、慢性消耗性疾病等。低总胆固醇者容易发生脑出血，也可能易患癌症(未证实)。肝脏是胆固醇及卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)合成的器官，严重肝病病人血清总胆固醇不一定很低，但由于血清卵磷脂胆固醇酰基转移酶活力低下，血清胆固醇酯占总胆固醇的比例可低达50％以下。
A1．11 参考文献
中华人民共和国卫生部医政司编．全国临床检验操作规程(第二版).南京：东南大学出版社，1997．268