肿瘤细胞的分子生物学与抗肿瘤策略.doc

肿瘤细胞的部分分子生物学问题与抗肿瘤策略探索

张海鹏1，张 力2，李新兵1，李玉清1，刘庆梅1，张效云3，赵红珊4，杨子军1，杨明川5
（1. 涿鹿县医院神经外科，075600河北涿鹿；
2. 河北北方学院药学系，075000张家口；
3. 河北北方学院生物化学教研室，075000张家口；
4. 北京大学医学遗传学系人类疾病基因研究中心，100191北京；
5. 河北省涿鹿县中医院普外科，075600河北涿鹿）

[提要]本文提出机体细胞个体恶变为肿瘤细胞而“独立”于机体的细胞求生现象；多细胞真核生物起源于肿瘤细胞。提出激活有氧呼吸相关线粒体蛋白、调节因子基因之表达的抑制肿瘤甚至促进肿瘤细胞分化的治疗策略，应用维生素B1、辅酶Q10衍生物等等辅助治疗。
[关键词] 肿瘤；细胞，真核；进化；基因，线粒体；自噬；肌萎缩侧索硬化
肿瘤的细胞生物学、分子生物学对生命科学是十分重要的，也是临床抗肿瘤治疗的科学基础。本文从进化生物学角度，探讨肿瘤细胞的部分分子生物学问题与相应的抗肿瘤策略。
1.肿瘤细胞生物学在进化生物学上的意义
作为真核细胞的肿瘤（指恶性肿瘤）细胞却以糖酵解为主要供能方式[1,2]，这有力地提示高等动植物肿瘤细胞与原核细胞、生物的亲缘性（这也是肿瘤细胞与机体正常细胞的在细胞生物学上的主要区别，这一点虽然早在1956年就由Warburg提出[1]，但以此用于临床有效治疗的文献很少）。而实验研究已发现，在心肌急性梗死中，心室肌细胞（已高度分化的细胞）糖酵解的关键酶类上调（而有氧代谢的关键酶下调）[3]。这无疑是一种细胞求生的本能调节和适应。我们初步推测，肿瘤细胞在细胞生物学上可能是：当有毒物质尚未达到致死剂量时，其通过“独立”于（“叛逆”）机体而实现求生本能的现象（而多数有毒物质可能有潜在的致瘤性）。
也因此，既有偶然性（单基因突变尚不发生肿瘤）又有必然性（细胞求生的本能）的肿瘤细胞的发生，在进化生物学上具有十分重要的意义。机体细胞个体恶变为肿瘤细胞而“独立”于机体的细胞求生现象，说明肿瘤细胞要比一般真核细胞生命力强特别是增殖传代的能力强，这在真核生物起源、进化史上极其重要，因此我们初步推测多细胞的真核生物可能起源于肿瘤细胞！实验研究已发现，小鼠红白血病细胞株FBL-3（肿瘤细胞）约0.64%自然分化为正常的单核细胞[4]，此有力地支持上述假说；而经检索，植物机体同样存在肿瘤现象[5]，此更有力地支持多细胞的真核生物可能起源于对环境适应力更强的肿瘤细胞。真核生物的起源是进化生物学的基本问题。
2. 化学致癌：肿瘤发生的分子生物学过程
在非致死剂量的毒物的持久作用下，线粒体有氧呼吸由此障碍，激活了肿瘤代谢的关键调节因子——乏氧（低氧）诱导因子-1a（HIF-1a）[6]，HIF-1a可特异地阻断糖酵解的终产物转移到线粒体[6]；HIF1a进而激活端粒酶[6]，促使细胞增殖，开启了细胞逐步恶化的进程。同时，有氧代谢的障碍，一方面使细胞主要凋亡通路的线粒体通过其外膜蛋白FUNDC1发生线粒体自噬[7，8]而避免细胞凋亡，另一方面很可能使线粒体生成障碍，使细胞内资源集中于进一步加强的糖酵解。在这些互为因果的积累与自然选择的过程中，自由基对DNA的氧化损伤、基因修复功能障碍和线粒体基因向核内DNA的插入突变等等，最终促使DNA发
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河北省科教基金项目（20020221）
张海鹏，信箱：heapprenzcomhard@

生足够程度的突变（恶化为肿瘤细胞）——包括“持家基因”P53，后者作为最重要的抑癌基因之一，也通过调节有氧呼吸与线粒体通路的细胞凋亡而发挥抑癌、“持家”作用的[9]。
肿瘤细胞的发生，遵循了代谢-基因-代谢的循环演进过程。
3.肿瘤的治疗策略
在体外，无论以物理的、化学的还是生物学的手段杀死肿瘤细胞，都十分容易，而临床治疗肿瘤却十分困难，须对得失综合评估。应该说，除急性早幼性粒细胞白血病等血液肿瘤外，肿瘤治疗的效果难称理想。而近几年来很受重视的诱导凋亡，因肿瘤细胞比机体正常细胞更强的抗调亡的作用，前景并不乐观[10]。
路在何方？临床治疗肿瘤，首先应针对肿瘤细胞与正常细胞的主要区别（有氧呼吸障碍）；而从对微生物的化疗看，应该将杀灭肿瘤细胞与抑制肿瘤细胞相结合，实行包括手术在内的综合抗瘤策略——包括有效地抗瘤下的携瘤生存，包括促进肿瘤细胞的可能分化。
3.1抗原虫及真菌药物在抗瘤治疗的应用
从进化上肿瘤细胞与原虫、真菌有较近的亲缘关系。因此，可以说抗利什曼原虫的锑剂[11]、抗疟原虫的氯喹[12]、青蒿素等已用于肿瘤治疗是很有道理的。詹希美教授亦认为对寄生虫的研究有助于为肿瘤等其他疾病的发生机制、治疗提供参考依据[13]。
一种黏杆菌产生的抗真菌聚酮化合物 soraphen A，能优先杀死恶性细胞[4,14]。
3.2抑制线粒体自噬
在 40%～75%的乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌中存在自噬相关基因 Beclin 1 的单等位缺失；存在Beclin1 缺陷的小鼠更容易发生淋巴瘤、肺癌、肝细胞肝癌和乳腺癌前病变；从具有 Beclin 1缺陷的小鼠体内取出肾脏和乳腺上皮细胞植入实验动物体内后, 这些细胞比正常细胞更容易恶变在动物模型中, 其他的自噬相关基因( 如 Atg4c 等) 也具有肿瘤抑制作用[15]。这些提示，自噬作用似乎是一种肿瘤抑制机制，而Beclin 1 等被认为是新的抑癌基因。然而Amaravadi 等的实验显示，氯喹（自噬抑制剂）和烷化剂共同使用, 可以明显抑制实验鼠体内肿瘤的生长，其凋亡活性得到进一步增强[15,16]；文献[12]也显示自噬抑制剂氯喹良好的抗瘤效应，因此我们推测Beclin 1是细胞饥饿时通过哺乳动物-雷帕霉素靶子蛋白（m-TOR）[17]感受有氧代谢信息而通过大自噬[18]发挥作用的，而与肿瘤相关线粒体自噬关系不大。而自噬抑制剂氯喹很可能与抗线粒体自噬有密切关系；而已经知道，低氧诱导的线粒体自噬恰恰是不依赖Beclin1的[7，8]，而是通过线粒体外膜蛋白FUNDC1介导[7，8]，因此，FUNDC1的拮抗剂的开发可能是很有意义的。
建议将自噬从病理生理学上分为线粒体自噬与非线粒体自噬，作为大自噬，分子伴侣介导的自噬与小自噬分类的补充。而自噬性（所谓Ⅱ型）程序性细胞死亡可能是相对罕见的现象——特别是在体内时。
3.3 有氧代谢的辅酶在抗瘤中的应用
有氧代谢的辅酶在抗瘤中的应用尚未见文献提出。但理论上有助于恢复肿瘤细胞的有氧代谢，促进其凋亡甚至重新分化。
（1）维生素B1 建议每日给药100mg。肿瘤患者的恶液质营养状态甚至可出现脚气性心脏病[19-21]。
（2）MitoQ MitoQ系辅酶Q10（CoQ10）的衍生物[22]。
（3）研究还显示联用乙酰左旋肉毒碱与右旋a硫辛酸可改善老年大鼠呼吸链复合物1、4、5的下降[22]。此外，尚有Szeto-Schille肽、22R-羟基胆固醇稳定态类似物——Caprospinol[22]改善线粒体功能，均可能有潜在的抗瘤价值。
我们认为，理论上，针对阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化的线粒体有氧呼吸的治疗（包括上述），均可有抑制肿瘤作用。而对肌萎缩侧索硬化的治疗，以脊髓灰质炎病毒的假病毒为载体导入抗凋亡蛋白的目的基因可能有临床应用前景。此基础是中枢神经系统的神经元不发生肿瘤。已知，原癌基因src编码的酪氨酸激酶在神经元高度表达，在完全成熟的神经元依然维持高水平——是其他细胞的6-20倍，而且神经元内src酪氨酸激酶比其他细胞的多6个氨基酸[23]。此可能是上述神经元不发生肿瘤的重要基础。
3.4 线粒体调节蛋白、有氧呼吸酶基因的分子生物学激活
3.4.1二氯乙酸盐
肿瘤细胞的丙酮酸进入三羧酸循环受阻，与线粒体丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）活性过高有关：以二氯乙酸抑制线粒体PDK,似乎能够恢复受PDK抑制的丙酮酸脱氢酶（PDH）的活性，再激活肿瘤细胞的线粒体呼吸，诱导凋亡，因此， PDK的抑制可以被用于逆转癌细胞从糖酵解到糖氧化的不正常代谢。由于PDK 负调节PDH，二氯乙酸盐间接激活丙酮酸到乙酰辅酶 A 转化[4，24]。二氯乙酸盐被证实可以向下调节癌细胞异常升高的线粒体膜电位， 增加线粒体 ROS 生成和激活钾通道，而在正常细胞中无作用[4，25]。目前二氯乙酸盐作为单一药物治疗已经在一期临床中对于患有实体瘤的患者进行测试[4]。前景应非常喜人。
3.4.2 激活p53基因的表达——抗瘤应用的依据
P53“持家”途径：1.转录（活性）水平上的调控，表现为细胞生长周期的负性调节因子，包括诱导G1/2期之停滞；2.非转录活性依赖的线粒体途径[26]。
P53是通过调节SCO2调节有氧呼吸的。前者尚可直接激活SCO2的转录。以人类HCT116细胞为样本，研究发现：调节细胞色素C氧化酶复合体产生的SCO2，在P53非缺失的细胞中的含量，竟10倍于P53缺失的细胞中的SCO2 [27]。
3.4.3激活丙酮酸脱氢酶基因的表达——抗瘤应用的依据
丙酮酸在PDH多酶复合体催化下转化为乙酰辅酶A，该步骤是糖有氧氧化或转化为脂肪的必由之路。也是线粒体代谢与线粒体生物发生的连接之处。HIF-1与PDH激酶（PDK）-1的比值是低氧下调节PDH的开关[24]。
3.4.4激活细胞核编码的线粒体DNA转录之调控因子基因的表达——抗瘤应用的依据
调控线粒体DNA转录的主要调控因子包括：细胞核基因编码的线粒体转录活化因子，协同活化因子。前者包括核编码呼吸因子（NRF-1,2）、SP-1等；后者包括过氧化物酶体增值物激活受体共激活因子-1 （PGC1）及其相关活化因子 [28]。
NRF-1主要对细胞色素B和呼吸链中的5个复合体的表达、胚胎发育阶段的线粒体DNA（mtDNA）的维持和线粒体RNA的加工起作用。NRF-2主要对呼吸链中的复合体2、4的表达起调节作用。SP1主要对呼吸链中缺少NRF-1结合部位的细胞色素C1和不缺乏NRF-1结合部位的区域起作用。有新近研究提示，NRF位于mtTFB启动子区域内，与PGC-1和PRC结合提高转录效率[28]。mtTFA直接调节线粒体基因组的转录和复制，从而介导线粒体的生物发生；而PGC1与过氧化物酶体增值物激活受体（PPAR）同步结合靶子基因，诱导线粒体增值相关基因即mtTFA等（NRF-1,2）[24]。PGC1尚可激活线粒体融合之介导蛋白（Mfn2）启动子转录。Mfn2可能维持线粒体际管网结构，而且增强葡萄糖和脂肪的线粒体内氧化 [24]。
3.4.5线粒体调节蛋白、有氧呼吸酶基因的分子生物学激活的方法
上述3.4.2~3.4.4的基因表达激活，也可加强正常细胞的有氧呼吸功能。微RNA（miRNA）可激活靶基因的表达[29]，另一方面，miRNA在基因沉默上技术成熟、应用甚多，而在基因表达的激活上需进一步研究而设计特异性强的miRNA。
总之，线粒体调节蛋白、有氧呼吸酶基因的分子生物学激活，可能为抗瘤提供全新的模式。

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