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生物化学习题
第一章 蛋白质化学
1、向1升1mol/L的处于等电点的甘氨酸溶液加入0.3molHCl，问所得溶液的Ph是多少？如果加入0.3mol NaOH以代替HCl时，pH值将是多少？[pH:2.71；9.23]
2、将丙氨酸溶液（400毫升）调节到pH8.0，然后向该溶液加入过量的甲醛。当所得溶液用碱反滴定至pH8.0时，消耗0.2mol/L NaOH溶液250毫升。问起始溶液中丙氨酸的含量为多少克？[4.45g]
3、将含有天冬酸（pI=2.98），甘氨酸（pI=5.97），苏氨酸（pI=6.53），亮氨酸（pI=5.98）和赖氨酸（pI=9.74）的pH3.0柠檬酸缓冲液，加到预先用同样缓冲液平衡过的Dowex-50阳离子交换树脂中，随后用该缓冲液洗脱此柱，并分部地收集洗出液，这5种氨基酸将按什么次序洗脱下来？[Asp，Thr，Gly, Leu, Lys]
4、指出在正丁醇：醋酸：水的系统中进行纸层析时，下列混合物中氨基酸的相对迁移率（假定水相的pH为4.5）：（1）Ile, Lys; (2)Phe, Ser; (3)Ala, Val, Leu; (4)Pro, Val; (5)Glu, Asp; (6)Tyr, Ala, Ser, His。[Ile>Lys; Phe>Ser; Leu>Val>Ala; Val>Pro; Glu>Asp; Tyr>Ala>Ser≈His]
5、（1）当Ala、Ser、Phe、Leu、Arg、Asp和His的混合物在pH3.9进行纸电泳时，哪些氨基酸移向正极（+）？哪些氨基酸移向负极（-）？（2）纸电泳时，带有相同电荷的氨基酸常有少许分开，例如Gly可与Leu分开。试说明为什么？（3）设Ala、Val、Glu、Lys和Thr的混合物pH为6.0，试指出纸电泳后氨基酸的分离情况。[（1）Ala, Ser, Phe和Leu以及Arg和His移向负极；Asp移向正极。(2)电泳时，具有相同电荷的较大分子移动得慢，因为电荷/质量之比较小，因而引起每单位质量迁移的驱动力也较小。（3）Glu移向正极；Lys移向负极，Val, Ala和Thr留在原点。]
6、有一个A肽：经酸解分析得知由Lys、His、Asp、Glu2、Ala、以及Val、Tyr和两个NH3分子组成。当A肽与FDNB试剂反应后，得DNP-Asp；当用羧肽酶处理得游离缬氨酸。如果我们在实验中将A肽用胰蛋白酶降解时，得到二种肽，其中一种（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）在Ph6.4时，净电荷为零，另一种（His、Glu、以及Val）可给出DNP-His，在Ph6.4时，带正电荷。此外，A肽用糜蛋白酶降解时，也得到二种肽，其中一种（Asp、Ala、Tyr）在pH6.4时呈中性，另一种（Lys、His、Glu2、以及Val）在Ph6.4时，带正电荷。问A肽的氨基酸顺序如何？[Asn—Ala—Tyr—Glu—Lys—His—Gln—Val]
7、某多肽的氨基酸顺序如下：

。（1）如用胰蛋白酶处理，此多肽将产生几个肽？并解释原因（假设没有二硫键存在）；（2）在pH7.5时，此多肽的净电荷是多少单位？说明理由（假高pKa值：α-COOH4.0；α-NH3+6.0；Glu和Asp侧链基4.0；Lys和Arg侧链基11.0；His侧链基7.5；Cys侧链基9.0；Tyr侧链基11.0）；（3）如何判断此多肽是否含有二硫键？假如有二硫键存在，请设计实验确定5，17和23位上的Cys哪二个参与形成？[（1）4个肽；（2）-2.5单位；（3）如果多肽中无二硫键存在，经胰蛋白酶水解后应得四个肽段；如果存在一个二硫键应得三个肽段并且各肽段所带电荷不同，因此可用离子交换层析、电泳等方法将肽段分开，鉴定出含二硫键的肽段，测定其氨基酸顺序，便可确定二硫键的位置。]
8、今有一个七肽，经分析它的氨基酸组成是：Lys, Gly, Arg, Phe, Ala, Tyr和Ser。此肽未经糜蛋白酶处理时，与FDNB反应不产生α-DNP-氨基酸。经糜蛋白酶作用后，此肽断裂成两个肽段，其氨基酸组成分别为Ala, Tyr, Ser和Gly, Phe, Lys, Arg。这两个肽段分别与FDNB反应，可分别产生DNB—Ser和DNP—Lys。此肽与胰蛋白酶反应，同样能生成两个肽段，它们的氨基酸组成分别是Arg, Gly和Phe，Tyr, Lys, Ser, Ala。试问此七肽的一级结构是怎样的？[它是一个环肽，顺序为—Phe—Ser—Ala—Tyr—Lys—Gly—Arg—]
9、今有一种植物的毒素蛋白。直接用SDS凝胶电泳分析时，它的区带位于肌红蛋白（分子量为16 900）和β-乳球蛋白（分子量为37 100）两种标记蛋白之间。当这个毒素蛋白用巯基乙醇和碘乙酸处理后，在SDS凝胶电泳中仍得到一条区带，但其位置靠近标记蛋白细胞色素c（分子量为13 370）。进一步实验表明，该毒素蛋白与FDNB反应并酸水解后，释放出游离的DNP-Gly和DNP-Tyr。关于此蛋白质的结构，你能作出什么结论？[该毒素蛋白由二条不同的多肽链通过链间二硫键交联而成，每条多肽链的分子量各在13 000左右]
10、一种酶分子量为300 000，在酸性环境中可解离为二个不同成分，其中一个成分分子量为100 000，另一个为500 000。大的占总蛋白的三分之二，具有催化活性；小的无活性。用β-巯基乙醇（能还原二硫桥）处理时，大的颗粒即失去催化能力，并且它的沉降速度减小，但沉降图案上只呈现一个峰。关于该酶的结构可作出什么结论？[此酶含4个亚基，两个亚基的分子量为50 000，两个催化亚基分子量为100 000，每个催化亚基是由二条无活性的多肽链（分子量为50 000）组成，彼此间由二硫键联结在一起]
11、三肽Lys—Lys—Lys的pI值必定大于它的任何一个个别基团的pKa值。这种说法是否正确？为什么？[正确。因为此三肽处于等电点时，其解离基团所处的状态应是：C末端COO-(pKa=3.0)，N末端NH3+（pKa=8.95），三个侧链3（1/3ε-NH3+）(pKa=10.53)。因为pI时正电荷的总和必须等于负电荷的总和，所以三个ε-氨基的每一个都将是大约1/3电离。它们在1/3电离时的pH大于它们的pKa值（10.53）]
12、α-螺旋的稳定性不仅取决于肽键间的氢键形成，而且还取决于肽链的氨基酸侧链性质。试预测在室温下的溶液中下列多聚氨基酸哪些种将形成α-螺旋，哪些种形成其它的有序结构，哪些种不能形成有序结构，并说明理由。（1）多聚亮氨酸pH=7.0；（2）多聚异亮氨酸，pH=7.0；（3）多聚精氨酸，pH=7.0；（4）多聚精氨酸，pH=13；（5）多聚谷氨酸，pH=1.5；（6）多聚苏氨酸，pH=7.0。[（1），（4）和（5）能形成α-螺旋；（2），（3）和（6）不能形成有序结构]
13、多聚甘氨酸的右手或左手α-螺旋中，哪一个比较稳定？为什么？[因为甘氨酸是一种在α-碳原子上呈对称性的特殊氨基酸，因此可以预料多聚甘氨酸的左右手α-螺旋（它们是对映体）在能量上是相当的，因而也是同等稳定的]
14、测得一种血红素蛋白质含0.426%铁，计算其最低分子量。一种纯酶按重量算含亮氨酸1.65%和异亮氨酸2.48%，问其最低分子量为多少？[13 110；15 800]
15、简要说明为什么大多数球状蛋白质在溶液中具有如下性质：
（1）在低pH时沉淀。
（2）当离子强度从零增至高值时，先是溶解度增加，然后溶解降低，最后沉淀。
（3）在给定离子强度的溶液中，等电pH值时溶解度呈现最小。
（4）加热时沉淀。
（5）当介质的介电常数因加入与水混溶的非极性溶剂而下降时，溶解度降低。
（6）如果介电常数大幅度下降以至介质以非极性溶剂为主，则产生变性。
答案：（1）在低pH时氨基被质子化，使蛋白质带有大量的净正荷。这样造成的分子内的电荷捍斥引起了很多蛋白质的变性，并由于疏水内部暴露于水环境而变得不溶。
（2）增加盐浓度，开始时能稳定带电基团，但是当盐浓度进一步增加时，盐离子便与蛋白质竞争水分子，因此，降低了蛋白质的溶剂化，这样又促进蛋白质分子间的极性相互作用和疏水相互作用，从而导致沉淀。
（3）蛋白质在等电点时分子间的静电斥力最小。
（4）由于加热使蛋白质变性，因此，暴露出疏水内部，溶解度降低。
（5）非极性溶剂能降低表面极性基的溶剂化作用，因此，促进蛋白质之间的氢键形成以代替蛋白质与水之间形成的氢键。
（6）低介电常数能稳定暴露于溶剂中的非极性基团，因此，促进蛋白质的伸展。

16、已知某分子量为240000的蛋白质多肽链的一些节段是α-螺旋，而另一些节段是β-折叠，其分子长度为5.06×10-5cm，求分子α-螺旋和β-折叠的百分率。
解析：本题考点：多肽链中α-螺旋和β-折叠的计算。
一般来讲氨基酸残基的平均相对分子质量为120，此蛋白质的相对分子量为240000，所以氨基酸残基数为240000/120=2000个。
已知α-螺旋中，每个氨基酸残基上升的高度为0.15nm，β-折叠构象中，每个氨基酸残基上升的高度为0.36nm，设此链中α-螺旋的氨基酸残基数为x，而β-折叠的氨基酸残基数为2000-x，则有：
0.15x+0.36×(2000-x)=5.06×10-5×107
0.15x+7200-0.36x=560
求得x=1019
所以α-螺旋占的百分数为，则β-折叠的百分率为49.05%。

17、蛋白质二级结构的类型、特点及其在分子整体空间结构的作用。
答案：蛋白质的二级结构，主要是指蛋白质多肽链骨架的折叠和盘绕方式。天然蛋白质的二级结构主要有三种基本类型：α-螺旋、β-折叠和β-转角。
（1）α-螺旋 α-螺旋结构是Pauling和Corey在1951年提出来的，纤维状蛋白和球状蛋白中均存在α-螺旋结构，它是蛋白质主链的典型结构形式。
α-螺旋结构的特点是：
1）蛋白质多肽链主链像螺旋状盘曲，每隔3.6个氨基酸残基沿中心轴螺旋上升一圈，每上升一圈相当于向上平移0.54nm，即每个氨基酸残基向上升高0.15nm，每个氨基酸残基沿中心轴旋转达100°。
2）α-螺旋的稳定性是靠链内氢键维持的，相邻的螺圈之间形成键内氢键，氢键的取向几乎与中心轴平行，氢键是由每个氨基酸残基的N-H与前面隔3个氨基酸的C=O形成，肽链上所有的肽键都参与氢键的形成，因此α-螺旋相当稳定。
3）α-螺旋中氨基酸残基的侧键伸向外侧。Α-螺旋有左手螺旋和右手螺旋两种，但天然蛋白质α-螺旋，绝大多数都是右手螺旋。
（2）β-折叠结构，这种结构也是Pauling等人提出来的，它是蛋白质中第二种最常见的二级结构，β-折叠是两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，靠链间氢键连结为片层结构。Β-折叠结构的特点是：
1）β-折叠结构中两个氨基酸残基之间的轴心距为0.35nm（反平行式）及0.325nm（平行式）。
2）肽链按层排列，靠链间维持其结构的稳定性，β-折叠结构的氢键是由相邻肽键主链上的N-H和C=O之间形成的。
3）相邻肽链走向可以平行，也可以反平行，肽链的N端在同侧为平行式，不在同侧为反平行式，（即相邻肽链的N端一顺一倒地排列），从能量角度考虑，反平行式更为稳定。
4）肽链中氨基酸列基的R侧链交替分布在片层的上下。
（3）β-转角，在球状蛋白质中存在的一种二级结构。当蛋白多肽链以180°回折时，这种回折部分就是β-转角，它是由第一个氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H之间形成氢键，产生一种不很稳定的环形结构。由于β-转角结构，可使多肽链走向发生改变，目前发现的β-转角多数都处在球状蛋白质分子的表面，在这里改变多肽链的方向阻力比较小。

18、测定氨基酸的氨基态氮，使有NaOH标准溶液测定氨基酸的羧基，再直接求出氨基态氮的量。试问在NaOH滴定前为什么要加甲醛？
解析：本题考点：氨基酸的甲醛滴定。
氨基酸虽然是一种两性电解质，既是酸又是碱，但是它却不能直接用酸、碱滴定来进行定量测定。这是因为氨基酸的酸、碱滴定的等当点pH或过高（12-13）或过低（1-2），没有适当的指示剂可被选用。然而向氨基酸溶液中加入甲醛，可以降低氨基的碱性，甲醛与氨基酸的氨基反应如下图所示：

答案：先加入过量的甲醛，用标准氢氧化钠滴定时，由于甲醛与氨基酸的NH2作用形成-NH·CH2OH，-N（CH2OH）2等羟甲基衍生物，而降低了氨基的碱性，相对地增强了氨基的酸性解离，使pK减少2-3个pH单位。使滴定终止由pH12左右移至9附近，亦即达到酚酞指示剂的变色区域。

18、用lmol酸水解五肽，得2个Glu，1个Lys，用胰蛋白酶裂解成二个碎片，在pH=7时电泳，碎片之一移向阳极，另一向阴极；碎片之一用DNP水解得DNP一谷氨酸；用胰凝乳蛋白酶水解五肽产生两个二肽和一个游离的Glu，写出五肽顺序。
解析：
（1）lmol酸水解生成2个Glu，1个Lys，由于酸水解时，色氨酸，易遭到破坏，且天气酰胺和谷氨酰胺和谷按酰胺基常被水解，所以从回收的氨基酸情况可以推测该五肽的氨基酸组成为2Glx、2Trp、1Lys。
（2）用胰蛋白酶水解五肽，得到两个肽段，由于该酶专一性很强，它只断裂Lys或Arg的羧基参与形成的肽链，所以，Lys必定不是末端氨基酸，即…Lys…
（3）用胰凝乳蛋白酶水解原五肽生成两个肽段及游离的Glu，因为胰凝乳蛋白酶可水解Trp的羧基形成的肽键，所以可推知该肽的氨基酸序列为：X- Trp- Y-Trp-Glu。
（4）综合上面的推测可知该肽的序列为X- Trp-Lys-Trp-Glu。
（5）该肽与DNP作用水解生成DNP-Glu，而DNP一般来说是与N末端的-氨基发生反应的，所以说明该五肽为Glx-Trp-Lys-Trp-Glu。
（6）用胰蛋白酶水解五肽得两个肽段，即为Glx Trp Lys和Trp Glu，在pH7.0时电泳，Trp-Glu带负电荷，向阳极移动，根据题意Glx Trp Lys应向阴极移动，说明Glx是Gln而不是Glu。
综上所述，该五肽应为：Gln-Trp-Lys-Trp-Glu。

19、简述血红蛋白的结构及其结构与功能的关系。
答案：血红蛋白是一种寡聚蛋白质，由四个亚基组成，即2个α亚基和2个β亚基，每个亚基均有一个血红素，且有与氧结合的高亲和力，每个血红素都可以和一个氧分子结合。当四个亚基组成血红蛋白后，其结合氧的能力就会随着氧分压及其他因素的改变而改变。这种由于血红蛋白分子的构象可以生一定程度的变化，从而影响了血红蛋白与氧的结合能力。另外，血红蛋白分子上残基若发生变化，也会影响其功能的改变，如血红蛋白β-链中的N未端第六位上的谷氨酸若被缬氨酸取代，就会产生镰刀形红细胞贫血症，使红细胞不能正常携带氧。

20、列出蛋白质二级结构和超二级结构的基本类型。
答案：①天然蛋白质的二级结构主要有α-螺旋、β-折叠和β-转角；②超二级结构有三种基本组合形式：αα、βαβ和βββ。

21、根据蛋白质的理化性质，详细阐述蛋白质分离提纯的主要方法。
分离提纯某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级和细分级在三步。
第一步是前处理（pretreatment）。分离提纯某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。为此，应根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。组织细胞破碎以后，选择适当的介质（一般用缓冲液）把所要的蛋白质提取出来。
第二步是粗分级（rough fractionation）当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开业。一般这一步的分级用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。
第三步是细分级（rine fractionation），也就是样品的进一步提纯。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步提纯，一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的提纯步骤。用于细分级的一般规模较小，但分辨率高。
结晶是蛋白质分离提纯的最后步骤。蛋白质纯度越高，溶液越浓就越容易得到结晶。
答案：蛋白质由氨基酸构成，一部分性质与氨基酸相同，如两性游离和等电点，某些呈色反应等。但蛋白质是由氨基酸借肽键构成的高分子化合物，又有不同于氨基酸的性质，易沉降、不易透过半透膜、变性、沉淀凝固等。通常可利用蛋白质的理化性质和生物学性质来纯化蛋白质。而分离纯化蛋白质又是研究单个蛋白质结构与功能的先决条件。
①蛋白质分子颗粒表面多为亲水基团，因而通过吸水分子形成一层消化膜，这是蛋白质胶体稳定的重要因素之一。盐析就是利用（NH4）2SO4、NaCl等中性盐破坏蛋白质的水化膜，使之从溶液中析出，使不同性质的蛋白质初步得到分离。②蛋白质分子量较大，不易通过半透膜，故可利用透析的方法将其与小分子化合物分开。人们常用透析法去除蛋白质溶液中的盐等小分子为进一步纯化作准备。③凝胶过层析法是一种根据各种蛋白质分子量的差异进行分离纯化蛋白质的方法。含有各种分子量的蛋白质溶液，在通过带有小孔的葡聚糖颗粒所填充的长柱时，大分子量蛋白质不能进入葡聚糖颗粒而直接流出，分子量小的蛋白质则进入颗粒而流出滞后，这样就将蛋白质分成不同分子量的若干组分。④蛋白质具有两性游离的特性，在某一pH条件下，蛋白质颗粒表面带有电荷，可利用电泳法和离子交换层析法将蛋白质离纯化。蛋白质被分离纯化后，可用于作一级结构及空间结构的分析。

22、牛血清蛋白质含Trp0.58%（重量比），已知Trp Mr=204，求该蛋白质最低相对分子质量。
解析：
因为Trp残基/牛血清蛋白Mr=0.58%，则有：蛋白质Mr=Try残基/0.58%，而Try Mr=204，所以有：蛋白质Mr=(204-18)/0.58%=32069。

23、请例举三种蛋白质分子量的测定方法，并简过其原理。
答案：测定蛋白质分子量的方法很多，例如渗透、扩散速率，沉降分析等，我们这里简单地介绍几种分子量的测定方法。
（1）沉降法：又叫超速离心法，蛋白质溶液经高速离心时，由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉，沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，利用m=RTS/D(1-Vρ)即可求出其分子量m。
（2）凝胶过滤法：又称分子排阻层析或分子筛层析法，此法是在层析柱中装入葡聚糖凝胶，这种凝胶颗料中具有大量微孔，这些微孔只允许较小的分子进入胶粒，而大于胶粒微孔的分子则不能进入而被排阻。当用洗脱液洗脱时，被排阻的分子质量大的蛋白质先被洗脱下来，分子质量小的后下来，根据待测样品的洗脱体积可以求出其分子量。
（3）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳的速度取决于分子质量的大小，根据蛋白质分子在电泳中的相对迁移率和分子质量的对数成正比关系，可以求出蛋白质分子量。

24、凝胶过滤或分子筛层析是一种以蛋白质大小为基础的分离蛋白质的方法。蛋白质溶液放在填有高度水化的交联聚合材料（如Sephadex一交联葡聚糖）细珠的柱上。不同大小的蛋白质穿过水化细珠微孔的能力不同。较小的蛋白质要比较大的容易穿过微孔，因而较小的蛋白质过柱的速度要比较大的慢。
分离蛋白质的第二种技术是园盘电泳。它使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶支柱物中受到电场的作用。在变性剂十二烷基硫酸钠[SDS：[CH3（CH2）]11SO4Na2]存在下进行电泳时，蛋白质分子按大小被分离开来，较小的分子移动得最快。（SDS可使蛋白质变性，并与它们进行非特异性结合，给出一个恒定的电荷质量比）。
这两种方法都是根据大小对蛋白质进行分级分离的。并且都使用交联聚合物作为支持介质。为什么在凝胶过程中小分子比大分子更易滞留，而在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中情况恰是相反？
答案：凝胶过滤是利用多孔材料的分子筛。每一个交联葡聚糖珠的交联基质都把大的蛋白质排阻在外，而允许小的蛋白质进入。因此，大的蛋白质必须在这些珠之间通过，也就是通过柱体积减去珠体积（此差值称这为空柱体积），小的蛋白质则通过总的柱体积。蛋白质颗粒越大，它在珠内所耗的时间越少，因此，洗脱得越快。
电泳用的聚丙烯酰胺凝胶是以单体丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺（交联剂）为材料，在催化剂的作用下，聚合成含酰胺基侧链的脂肪族长链，在相邻长链之间通过甲撑桥连接成三维网状结构物质。此三维网状结构物质相当于一个大的珠；这里没有珠之间的空隙，所有蛋白质必须通过交联基质。蛋白质越小，它通过交联基质则越容易，因此移动得越迅速。

25、将赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酷氨酸和丙氨酸的混合物在高pH下放入阳离子交换树脂中，在用连续降低pH的洗脱剂洗脱，试预测它们的洗脱顺序。
查表可知，6种氨基酸pI的排列顺序是：
Asp<Glu<Tys<Ala<Lys<Arg
(2.98)(3.22)(5.66)(6.02)(9.74)(19.76)
它们△pH值的排列顺序为：
Asp>Glu>Tyr>Ala>Lys>Arg
故它们被洗脱的先后顺序为：
Asp Glu Tyr Ala Lys Arg

26、某一条肽经链酸水解组成分析含5种氨基酸，其N端非常容易环化。经CNBr处理后得一游离碱性氨基酸，Pauly反应阳性。若用胰蛋白酶作用则得两个肽段；其一为坂口反应阳性，另一个在280mm有强的光吸收，并呈Millon氏阳性反应。求此肽的氨基酸排列顺序，并指出它的等电点（pI）应该是大于、等于或小于pH7。
答案：其N端非常容易环化故是谷氨酸残基。因Pauly反应阳性，故表明有组氨酸或酪氨酸残基；而C端是个碱性残基，故这残基应是组氨酸。经CNBr处理后得一游离碱性氨基酸，因此，在C端的倒数第二位是一个甲硫氨酸残基。且胰蛋白酶作用得两个肽段：其一为坂口反应阳性，则说明肽链中间的一个碱性残基应是精氨酸残基；另一个肽段在280nm有强的光吸收，并呈Millon氏阳性反应，这提示了在精氨酸C端一侧的肽段中有酷氨酸。综上所述，这五肽的序列应是谷氨酰一精氨酰一酪氨酰一甲硫氨酰一组氨酸。这一肽段中有两个碱性残基，而酸性残基只有一个，因此，此肽段的等电点应大于7。

27、有人纯化了一个未知肽，其氨基酸组成为：Asp1，Ser1，Gly1，Ala1，Met1 Phel和lys2，又做了一系列分析，结果如下：
（1）FDNB与之反应再酸水解后得DNP-Ala
（2）胰凝乳蛋白酶（CT）消化后，从产物中分出一个纯四肽，其组成为：Asp1，
Gly1，Lys1，Met1，此四肽的FDNB反应降解产物为DNP-Gly。
（3）胰蛋白酶（T）消化八肽后又可得到组成分别为Lys1，Alal，Serl及Phel，Lys1，Gly1的两个三肽及一个二肽。此二肽被CNBr处理后游离出自由天冬氨酸。
请列出八肽全顺序并简示你推知的过程。
答案：由结果（1）可得知此肽的N端是Ala；由结果（2）可知C端四肽的序列是Gly-Lys-Met-Asp；由结果（3）可知N端的三肽序列为Ala-Ser-Lys，中间的肽段序列为Phe-Gly-Lys，二肽被CNBr处理后游离出自由天接着氨酸，这提示了这二肽的序列为Met-Asp，而且没有碱性残基，因此是整个肽链的C端二肽。完整的八肽序列为：Ala-Ser-Lys-Phe-Gly-Lys-Met-Asp.
T↓CT↓ T↓
Ala-Ser-Lys-Phe-Gly-Lys-Met-Asp
DNP-Ala DNP-Gly

28、蛋白质化学研究中常用的试剂有下列一些CNBr，尿素，β巯基乙醇，胰蛋白酶，过甲酸，丹磺酰氯，6mol/L HCL，茚三酮，异硫氰酸苯酯和胰凝乳蛋白酶等。为完成下列各项试验，请回答每一项的最适试剂是什么？
（1）一个小肽的氨基酸顺序的测定
（2）多肽链的氨基末端的确定
（3）一个没有二硫键的蛋白质的可逆变性
（4）芳香族氨基酸残基的羧基一侧肽键的水解
（5）甲硫氨酸的羧基一侧肽键的裂解
（6）通过氧化途径将二硫键打开
答案：一个小肽的氨基酸顺序的测定用异硫氰酸苯酯；多肽链的氨基末端的确定用丹磺酰氯；一个没有二硫链的蛋白质的可逆变性用尿素；芳香族氨基酸残基的羧基一侧肽键的水解用胰凝乳蛋白酶；甲硫氨酸的羧基一侧肽键的裂解用溴化氰；通过氧化途径将二硫键打开用过甲酸。

29、已知一个九肽的氨基酸顺序是：Ala-Pro-Lys-Arg-Val-Tyr-Glu-Pro-Gly，在实验室只有氨基酸分析仪，而没有氨基酸顺序测定仪的情况下，如何使用（1）羧肽酶A或B；（2）氨肽酶；（3）2，4二硝基氟苯（FDNB）；（4）胰蛋白酶；（5）胰凝乳蛋白酶，来验证上述肽段的氨基酸顺序。
答案：用两种羧肽酶和氨肽酶作用此九肽，都不能释放出氨基酸，证明了第2位和第8位的残基均为脯氨酸；用FDNB可以测得该肽的N末端为Ala，用胰蛋白酶作用可得到Ala，Pro，Lys组成的三肽，这表明了第3位的残基为Lys；同时得到一段五肽和游离的Arg，这提示了Arg是第4位残基，用凝胶乳蛋白酶作用后，可得到一段六肽和一段三肽，同时也确认了第6位残基是带芳香性侧链的Tyr，由六肽的氨基酸组成测得，确定其中含有Val，很自然地可认定这残基应是第五为的残基，用FDNB证明了酶解后所得到三肽的N端，即九肽的第7位残基，是Glu后，九肽的C末端也肯定是Gly.

30、比较肌红蛋白和血红蛋白的氧合曲线，并加以简单说明。
答案：肌红蛋白和血红蛋白的氧合曲线的差别是，前者是双曲线形式，后者是S性曲线，原因是肌红蛋白是单个亚基氧结合蛋白，不存在协同效应；而血红蛋白是含4个亚基的氧结合蛋白，彼此之间存在着协同效应。

31、大肠杆菌含有2000种以上的蛋白质，为了分离它所表达的一个外源基因的产物并保持它的活性，常有很大困难。但为了某种目的，请根据下列要求写出具体的方法。
（1）利用溶解度差别进行分离。
（2）利用蛋白质分子大小进行分离。
（3）根据不同电荷进行分离。
（4）已制备有该产物的抗体进行分离。
（5）产物的浓缩
（6）产物纯度的鉴定。
答案：首先要有一种或几种检测或鉴定外源基因表达产物的方法，然后，在每一次分离纯化后，检测表达产物存在那一个级分中。（1）用硫酸铵或酒精分级沉淀，可根据蛋白质的溶解度的差别进行分离。（2）SDS-PAGE、凝胶过滤、超离心，以及超滤可对分子量不同的蛋白质进行分离。（3）对带行为不同的蛋白质可用离子交换层析、等电聚焦、圆盘电泳、毛细血管电泳等方法进行分离，但是在使用这一类型的方法时选择溶液的pH至关重要，因为蛋白质的带电行为和溶液的pH密切相关。（4）如果具备表达产物的抗体，则可以使用亲和层析或免疫沉淀方法简捷地他离所需的表达产物。（5）使用叭附量较大的离子交换层析和亲和层析，以及对换饱和硫酸铵或聚乙二醇反透析，还有冷冻干燥等方法都可以达到浓缩样品的目的，然而这些方法使用时，都存在着脱盐或除去小分子化合物的问题，相比而言，选用合适截留分子量的超滤膜，进行超过滤，往往能同时达到浓缩样品和去盐（包括小分子）的目的。（6）要上述的（2）和（3）这两大类用于分离纯化产物的过程，实际上也有这样纯度鉴定的作用。此外，末端分析、质谱和反相的HPLC层析也都是有效的样品纯度鉴定的方法，但是应注意，样品的纯度是一个相对概念。

32、简介信号肽及识别信号肽的信号识别体的结构特征？
答案：目前通常所说的信号肽是指翻译产物，新生肽链N端引导新生肽链进入内质网的肽段。这种信号肽一般含有20个氨基酸残基，从其结构上看，中间集中了较多的疏水性残基，两端是一些极性残基，识别信号的识别体，也称为信号肽识别颗粒（SRP）。它是7SRNA和6条不同分子量的肽链组成的复合物，除了信号肽结合外，识别颗粒还可以和其他一些帮助新生肽穿越内质网膜的蛋白质（或复合物）结合，后者停靠蛋白和核糖体受体等。

33、用什么试剂可将胰岛素链间的二硫键打开与还原？如果要打开牛胰核糖核酸酶链内的二硫键，则在反应体系中还必须加入什么试剂？蛋白质变性时，为防止生成的-SH基重新被氧化，可加入什么试剂来保护？
答案：最常用的打开二硫键方法是使用巯基试剂，例如巯基乙醇，可使参与二硫键的2个半胱氨酸还原为带有游离巯基的半胱氨酸，为了使还原反应能顺利进行，通常加入一些变性剂，如高浓度尿素等，加入过量的还原剂可以防止还原所得的巯基被重新氧化，如果不准备使 肽链重氧化，而是进一步进行结构化学结构的研究，可以将巯基转化为其它的修饰形式，例如和羧甲基化等烷化剂反应。
34、免疫球蛋白质是属于
A、核蛋白 B、简单蛋白 C、脂蛋白 D、糖蛋白
答案：D
34、总复习：
氨基酸的分类（分别以R基团的不同或疏水性的强弱分）
必需氨基酸
氨基酸的紫外吸收特性，氨基酸与茚三酮的反应特征？
肽的结构通式
肽键、氨基酸残基、侧链
等电点和解离常数
蛋白质二、三和四级结构的主要作用力分别是什么？
二级结构的种类。
结构域的概念
亚基的概念
血红蛋白分子病
蛋白质的沉淀作用和变性作用的原理及其应用。
蛋白质分离纯化有哪些方法，简述各方法的原理。
测定蛋白质含量有哪些方法，主要原理是什么？

第二章 核酸的化学
1、比较DNA、RNA在化学组成上、大分子结构上、生物学功能上的特点。
2、DNA双螺旋结构模型有哪些基本要点？这些特点能解释哪些基本的生命现象？
3、如果人体有1014个细胞，每一细胞DNA含量为6.4×109bp，试计算一下人体DNA的总长度为多少米？它相当于地球到太阳的距离（2.2×109米）之几倍？（2.2×1011米，100倍）。
4、核酸有何紫外吸收特点？在实验室如何利用这一特点研究核酸？
5、核酸的热变性有何特点？Tm值表示什么？Cot值表示什么？（Cot值表示DNA复性反应的速度。）
6、核酸杂交技术的基础是什么？有哪些应用价值？Southern印迹法的基本步骤是什么？
7、比较DNA与RNA一级结构的异同点。
答案：不同点：DNA的一级结构中组成成分为脱氧核糖核苷酸，核苷酸残基的数目由几千到几千万个；而RNA的组成成分为核糖核苷酸，核苷酸残基的数目仅有几十到几千个。另外，在DNA分子中A=T，G=C；而在RNA分子中A≠U，G≠C。
二者的相同点在于，它们都是以单核苷酸作为基本组成单位，核苷酸残基之间都是由3′，5′-磷酸二酯键相连接的。

8、为什么Φ×174的DNA不符合Chargeff碱基定律。
解析：
Chargaff等在50年代应用纸层析及紫外分光光度计对各种生物DNA的碱基组成进行了定量测定，发现如下规律：
（1）所有DNA中腺嘌呤与胸腺嘧啶的摩尔含量相等，即A=T；鸟嘌呤与胞嘧啶的摩尔含量相等，即G=C。因此，嘌呤的总含量与嘧啶的总含量相等，即A+G=C+T。
（2）DNA的碱基组成具有种的特异性，即不同生物种的DNA具有自己独特的碱基组成。但DNA的碱基组成没有组织和器官司的特异性。生长发育阶段、营养状态和环境的改变都不影响DNA的碱基组成。
所有DNA中碱基组成必定是A=T，G=C。这一规律的发现，提示了A与T，G与C之间碱基互补的可能性，为以后DNA双螺旋结构的建立提供了重要根据。
答案：Chargaff碱基比定律主要是用来描述双螺旋DNA的碱基组成的，而Φ×174是单链环状的，所以它的DNA碱基组成不符合Chargaff碱基比定律。

9、简述B型DNA和Z型DNA的结构特点及两者之间的关系。
答案：B型DNA的结构特点：①两条多核苷酸链反向平行绕成一个右手螺旋。②碱基位于双螺旋内侧，与纵轴垂直糖磷酸骨架位于外侧与纵轴平行。③分子表面朋大沟和小沟。④双螺旋的平行直径为2nm，每10对碱基旋绕一周，每周螺距为3.4nm。⑤氢键与碱基堆积力为维持其结构的主要作用力。
Z型DNA的结构特点：①两条多核苷酸链反向平行绕成一个左手螺旋。②碱基对在分子轴外侧，并构成了分子的凸面。③糖磷酸骨架链的走向呈“Z”字型。④分子表面只有小沟。⑤DNA双螺旋体细长。
两者之间的关系：B型、Z型DNA为DNA的两种结构形式，都是反向平等的双螺旋结构，B型DNA与Z型DNA之间可以互相转变。

10、溶液A中含有浓度为1M的20个碱基对的DNA分子，溶液B中含有0.05M的400个碱基对的DNA分子，所以每种溶液含有的总的核苷酸残基数相等。假设DNA分子都有相同的碱基组成。
（a）当两种溶液的温度都缓慢上升时，哪个溶液首先得到完全变性的DNA？
（b）哪个溶液复性的速度更快些？
解析：
（a）溶液A中的DNA将首先被完全变性，因为在20个碱基对螺旋中的堆积作用力比在400个碱基对螺旋中的力小很多，在DNA双链的末端的DNA的碱基对只是部分堆积。在片段短的分子中这种“末端效应”更大。
（b）在溶液A中复性的速率更大。成核作用（第一个碱基对的形成）是一个限速步骤，单链分子的数目越大，重新形成碱基对的机率就越大，因而在溶液A中的DNA（含有2M单链DNA）将比溶液B中的DNA（含有0.1M）更快地复性。
答案：（a）溶液A；（b）溶液A。

11、假尿苷(pseudouridine)中的糖苷键是（ ）
（1）C-N连接
（2）C-C连接
（3）N-N连接
12、一tRNA的反密码子为IGC，它可识别的密码子为（ ）
（1）GCA （2）GGG （3）CCG （4）ACG

13、核酸分子杂交的概念及其意义。
概念：两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交。
意义：广泛应用在分子生物学和分子遗传学研究领域。利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的DNA或RNA片段。

14、印渍技术的类别及应用。
①DNA印渍技术：又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。
②RNA印渍技术：又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。
③蛋白质印渍技术：又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。

15、稀有核苷酸碱基主要是在哪类核酸中发现？
A、rRNA B、mRNA C、tRNA D、核仁DNA
答案：C。
16、绝大多数mRNA的5′端有
A、polyA B、帽子结构
C、起始密码子 D、终止密码子
答案：B
17、真核生物mRNA的帽子结构中，m7G与多核苷酸链通过三个磷酸基连接，连接方式是
A、2′-5′ B、3′-5′ C、3′-3′ D、5′-5′
答案：D
18、细胞质中主要有三种RNA：tRNA、mRNA和rRNA，其相对含量是
A、tRNA>mRNA>rRNA B、tRNA>rRNA>mRNA
C、rRNA>tRNA>mRNA
答案：C
19、热变性的DNA有哪一种特性
A、磷酸二酯键发生断裂
B、形成三股螺旋
C、同源DNA有较宽的变性范围
D、在波长260nm处光吸收减少
E、溶解温度直接随A-T对的含量改变而变化
答案：E
20、某双链DNA样品含15%的A，该样品含C为
A、35% B、15% C、30% D、20%
答案：A
21、根据Watson-Crick模型，求得每1m DNA双螺旋核苷酸对的平均数为
A、25400 B、2540 C、29411 D、2941