蛋白质的化学合成.pdf

c 曲t 础S o u t h P h a r m a c y】u 眦2 0 0 4，v 0 1 2 N o 3 中南药学2 0 0 4 年6 月第2 卷第3 期蛋白质的化学合成黄永东1，韩彦丽2，甘一如(1 天津大学化J 二学院，天津3 0 0 0 7 2；2 大连理工大学精细化工国家重点实验室，大连1 1 6 0 1 2)中图分类号：T Q 4 6 4 7文献标识码：A文章编号：1 6 7 22 9 8 1(2 0 0 4)0 30 1 6 40 4蛋白质是生物体中功能最重要的一类生物大分子，目前蛋白质的制备方法主要有3 种：生化提取法、基凶T 程法和化学合成法“。各种方法利弊并存”叫，没有一种方法能够完全适用于所有蛋白质的制备。生化提取法来源少，基因工程法翻译后难以修饰易形成包合体等不恰当的折叠构型；相比之下，化学合成法提供了一条快速、高效的蛋白质制备途径，同时它能方便地引入非天然氨基酸，政变碳链骨架以及其他化学修饰来提高蛋白质活性，构建新蛋白。经过3 0多年的发展，蛋白质的化学合成取得巨大的进步，逐步合成法、片段组合法、化学选择性连接作用、非共价定向拼接的依次出现大大推动了蛋白质化学合成向纵深方向发展。蛋白质的全合成不仅具有重要的理沦意义，而乍L 具有相当重要的应用价值。1两种氨基保护策略目前应用在化学合成上主要有两种方法：B o c(叔丁氧羰基)口一“传统固相法和F m o c(芴甲氧羰基)口”新型固相法。B o c 化学合成法是一种历史较长也较成熟的方法。相比之下，F m o c 法历史较短，但具有条件温和、副反应少、产率高、操作简便等优点，其优越性止在逐渐为人们所认识，已被广泛应用于柞种活性分了的合成。F m o c 法最大的优点是不需要采用剧毒的氢氟酸将日标蛋白从固相载体上裂解下来并脱除侧链保护基，而是采用三氟乙酸水苯酚二巯基乙烷苯甲硫醚(8 2 5：5：5：5：2 5)定量地从树脂上切除，避免了采用强酸如液态氟化氢可能产生的氨基酰化等副反应。2 蛋白质化学合成的基本方法2 1逐步合成法E 4,s-r 逐步合成法是最早发展起来的化学合成蛋白质的方法它的基本原理是根据目标蛋白的氨基酸序列(级结构)，从C 端(或N 端)依次逐个偶联各个氨基酸柬合成蛋白质。逐步合成最大的特点是简单明了，但是它合成蛋白质的能力高度依赖于各步的合成效率。最近4 年来，本实验室对胸腺素衄和扶素康的逐步化学合成进行了大量的研究“。特别是对胸腺素劬，系统研究了不同的缩台试剂，包括I x、c、D 1 C、H B T U、H A T U对合成速度和产物质量的影响，为胸腺素n，的进一步产业化提供了依据。数十年来，化学合成取得了可喜的进步，但是，合成速度一直是摆在人们面前的一个严峻挑战，特别是合成那些由上百个氨基酸组成的目标分子。一般地，根据保护方法和偶联策略的不同，每个氢基酸的偶联需要2 0 12 0r a i n，如果是“困难序列。-1 的合成，那就需要2 倍甚至3 倍的偶联时间，才能达到可以接受的酰化产率。快速合成法“”1 的出现，满足r 人们一直所追求的偶联1 0-1 5 个氨基酸h“的日标。固相载体卜的快速合成由脱保护、排空、冲洗偶联的重复循环过程组成(见罔1)。由图l 可见，整个循环时间不到5m i n，一直重复该循环直到合成完目标分子。成功地高产率合成“困难片段”A C P(1 0 1 5)，P n l A(A 1 0 L)和P R(8 1 9 9)，平均产率分别为9 9 2、9 9 4 和9 7 9 蹦”一，证明了该方法的快速性和有效性。总的米说，快速合戚法具有以下几方面的优点：快速鉴定目标分子的“困难序列”；快速台成小而复杂的肽；快速合成蛋f E _ i 质及其突变体，以便于短期内对结构功能关系进行更深入的研究；快速合成用于化学选择性连接构建目标蛋白的肽片段。茚三酮定性检【-，-_ 一。4 8 m i n 循环图l 快速合成法示意图尽管快速合成法的效果十分显著。但是仍有几个方面的问题限制了它的广泛应用：H A T U 价格昂贵；还无法有效将快速H A T U B o c 原位中和偶联应用到自动合成仪中。因此，将来很有必要进一步发展比H A T U 更加便宜有效的替代偶联试剂和研究设计适用于快速合成法的新一代自动合成仪。2 2片段组台法口7“1虽然固相多肽合成(s o l i dp h a s ep e p t i d es y n t h e s i s，S P P S)与经典的液相法相比具有许多优越性，但固相法也有其不可避免的问题存在，即延伸反应过程中形成的各种副产物住目标分子l：的累积，这就给目标分子的分离纯化带来作者简介：黄永东(1 9 7 9)，男，在读硕：牛E m a i l：h u a n g y o n g d s l n a e o m通信作者：甘一如。男，教授T e l：(0 2 2)2 7 4 0 9 5 9 8E-m a i l：y r g a n t j u e d ur 1 3 万方数据中南药学2 0 0 4 年6 月第2 卷第3 期C e n t r a ls o u t hP h a r m a c y J u n e2 0 0 4,i v。1 2N o 3了不少困难，从而限制J 7 固相法在合成长序列目标分子领域的应用。完全保护片段组合法综合应用固、液相合成法的优势。它的基本策略是，固相合成出来的几个小片段纯化以后，再在溶液中(或固相载体上)组合成需要的蛋白质。根据片段组合场所的不同，分别称为液相片段组台和固相片段组合(见图2)。片段组合的主要步骤为：片段的设汁与合成；片段组合。图2 完全保护片段周相组合2 2 1片段的设计与合成对于片段组合而言，可将整个目标序列分为大约由1 0 个氢基酸残基组成的片段，如果C端或N 端的氨慕酸需要和其他片段发生偶联反应，那就要选用特定的氨基酸。末端残幕的选择是十分必要的，正确的选择能保证反应的快速进行从而降低反应过程中的消旋作用和副产物的生成。经过理论推导千u 实验验证，S h u m p e iS a k a k i b a r a d L“一对末端氨基酸的选择作出r 富有参考价值的成果。在化学合成过程中，影响产物质量的幽素是多种多样的。偶联试剂是其中一个较为重要的影响因素。对于单一的偶联试剂F)(T C，反应过程中产生r 多种副产物，包括消旋化和过度活化等产生的不利后果。针对偶联试剂，改进的措施是加人辅助性亲和西刹。如l 羟基苯并三唑(H O B t)和N 羟基琥珀酰亚胺(H O N S u)这雌化合物易与过分活泼的中间体()乙酰基脲)反应，生成害处小、活性充分的酰化剂从而抑制消旋化和副产物的生成。但是这种趋势仍然依赖于片段的序列。评价一个氨基酸能否作为术端残基的关键在于它是否具有空间位阻结构。是否会发生B 消去反应。2 2 2片段组合片段的偶联既可以在液相中进行，也可在固相载体上进行，相应地分别称为液相片段组合和固相片段组合(见图2)。对于液相片段组合法而言，由于所用的肽片段是完全保护的，因而溶解性差就成为液相片段组合法中最为棘手的问题特别是随着片段的延伸问题就显得更加突出。为r 解决这恫题，就需要寻找比常规溶剂D M F、D M S O(二_ l 基亚砒)更有效的溶剂，或者采丌丁固相组合法。全氟醇如H F I P(六氟异丙醇)和T F E(二氟乙醇)便是溶解能力极强的溶剂但这又会J 托生新的问题，那就是难以控制该试剂的高亲核性。采用混台溶剂的形式跚，如C H I：T F E(氯仿三氟乙醇)或C H LH F l P(氯仿六氟异丙醇)，币仅性能比D M F、D M S O 优越得多，而且亲核性过高的问题也得到有效控制，并成功用于绿色荧光蛋白G F p L。、人类肝索结合性生长因子”等的化学合成。同时，也可以从另一个角度出发来解决完全保护片段溶解性差的问题，将片段的偶联从液相转移到固相载体上，采用固相组合的方法。两者相比，【司相组合法币仅减少了完全保护片段r r l 间产物的溶解性和聚集性问题，而且简化r 实验操作，比液相组合法更有实际应用价值，固相组合法已成功地用于淀粉蛋白、r 玉米蛋白N 端等的化学合成旷。片段组合法的优势是明显的，但是它所存在的问题也是不容忽视的。问题主要有眦r 儿点：片段需要完全保护，操作复杂，同时造成片段在液相色谱纯化的水溶剂和偶联反应盼有机溶剂中溶解性降低；片段偶联速率较低，需增加偶联时问来提高片段偶联率；片段C 端残基在偶联过程中可能广：生消旋。2 3化学选择性连接”7。川化学选择性连接的基本原理是，在p H 为7 的中性水溶液中，一个C 末端为旷硫脂和另个N 端为C y s 残基的两个(或多个)未保护的肽片段通过形成硫脂键连接的中间物，同时进行卜N 的酰基重排，存结合位点处形成天然肽键(见图3)。当前，化学选择性连接是最有前途的蛋白质化学合成路线，因为它充分利用了合成、纯化具有化学选择性功能的大约由5 0 个氨基酸组成的均一肽片段的能力。随着研究的深八，采用该法化学台咸蛋白质的数目也越来越多。由于参与反应的片段具有化学选择性，尤须采取保护措施，避开了保护片段溶解性差的问题，因此化学选择性连接合成速度比片段组合快，效率高，是直接从基因序列数据库快速合成具有天然活性、较小的、富含半胱氨酸的蛋白质的常用方法。它惟一的制约冈素在于连接位点只能选用特定的半胱氨酸残基。莲圉睡F a nr-z-qL 瓦寿司L 面意司圈团匝立固+巨直卫图3 化学选择性连接“表达蛋白质连接”(e x p r e s s e dp r o t e i nl i g a t i o n)口”的m现，扩大了化学选择性连接的应用领域。首先目标蛋白基因克隆到表达质粒载体并进行表达。然后一个硫醇分子参与发生在重组蛋白连接点的连接反应，形成旷硫脂重组蛋白。最后重组蛋白再与N 端为半胱氨酸残基的肽或蛋白进行连接。万方数据C e n t r a lS o u t h P h a m a a c y J u n o2 0 0 4，V 0 1 2 N o 3 中南药学2 0 0 4 年6 月第2 卷第3 期该法同样适用于将一个合成肽片段插人到两个重组蛋白之间。2 4非共价定向拼接口1非共价定向拼接是通过非共价方法连接未保护的肽片段来合成目标蛋白的一种方法。许多早期有关蛋白质折叠的研究集中于肽的自拼接和形成特定结构的能力。例如，S a k a k i b a r a d 等人研究发现合成序列(P r o-P r o-O l y)n(n 一1 0 或2 0 时)的肽片段能自拼接形成类似于胶原蛋白的3 个单环(h e l i c e s)。从此，肽的自拼接就开始用于构建具有r 螺旋和B _ 片层的蛋白质。但是肽的自拼接并不是一个容易控制的过程，拼接过程中经常会形成r 螺旋的二聚体、三聚体以及肽链聚集成未知序列的聚集体。常用的改善措施主要是在肽链的末端结合卜对接体(m o i e t i e s)，用它们来促使肽片段以特定的形式进行拼接(见浏4)。这种方法的优势在于：肽片段能正确地拼接，避免形成错误的聚集体；对接体本身可作为引发和稳定蛋白结构形成的模板。虽然非共价定向拼接具有不少潜在的优势，但是由于该项技术起步较晚，还有许多方面需要进一步完善，研究工作有待于深入。目前它的主要制约冈素有如下两点：该法还只适用于同型低聚体的自拼接，造成目标蛋白结构单元冗余；该法易导致极大的蛋白质聚集体的形成，造成目标生物分子的研究复杂化。综上所述，化学合成法是制备已有蛋白质、构建新蛋白质最有前途的方法之一。它能够方便地引人非天然结构单元，如n 氨基酸，以及实现碳链骨架的替换。同时它也能用于那些无法用基因工程法生产的毒素蛋白的合成。总的来说，有4 种适用于蛋白质化学合成的基本方法，它们各有利弊(见表1)。表1 各种蛋白质化学合成法的优缺点1。(。A。A。)。A。A。1(。A。A。)。a。A。A。-。R。a。i。nI1 田图d 非共价定向拼接由表1 可见，化学合成法具有很强的目标蛋白依赖性，应根据日标蛋白的大小、序列特性和蛋白结构来从中选取确实可行的化学合成方法。参考文献 1 M i r a n d aL P，A l e w o o dP KC h a l l e n g e sf o rp r o t e i nc h e m i c a ls y n t h e s i si nt h e8 1 s tc e n t u r y：b r i d g i n gg e n o n d c sa n dp r ot e o i T t i e s J B i o p o l y m e r s(P e p t i d eS c i e n c e)，2 0 0 0，5 5(3)：2 1 7 2 C u d i cM，B u l e tP，H o f f m a n nP，甜a lC h e m i c a ls y n t h e s i s，a n t i b a c t e r i a la c t i 而t ya n dc o n f o r m a t i o nO fd i p t e r l e i n，f l n8 2 一m e tp e p t i d eo r i g i n a l l yi s o l a t e df r o mi n s e c t s J B i o c h e m i s t r y，1 9 9 9 2 6 6(2)：5 4 9 3 N i s h i u c h iY，l n u iT，N i s b i oH，e ta lC h e m i c a ls y n t h e s i so ft h ep r e c u r s o rm o l e c u l eo ft h eA c q u o r c ag r e e nf l u o r e s c e n tp r ot c i n，s u b s e q u e n tf o l d i n g，a n dd e v e l o p m e n to ff l u o r e s c e n c e口 P r o cN a t lA c a dS c iU S A，1 9 9 8，9 5(2 3)：1 3 5 4 9 4 M i r a n d aL P，Y o n yT a o，A h mJ o n e s，矗a lT o t a l c h e m i c a ls y n t h e s i sa n dc h e m o t a c t i ca c t i v i t yo fh u m a nS 1 0 0 A 1 2 J F E B S L P 1 e r 5，2 0 0 1 4 8 8(1)：8 5I s 3 廖黔宁，罗静处，周培爱等虎纹捕鸟蛛毒煮I(H W T XI)2 8 肽类似物的化学合成与活性鉴定口 巾国牛物化学与分子生物学报，1 9 9 9，1 5(5)：7 5 6 6 W i l k e nJ，K c mS B H C h e m i c a lp r o t e i ns y n t h e s i s 门o r rO p i nC h P 埘B i o l，1 9 9 8，9(3)：4 1 2 7 B o r g i aJ A，F i e l d sG RC h e m i c a ls y n t h e s i so fp r o t e i n s J T i b e z hJ 删F，2 0 0 0，1 8(2)：2 4 3 8 刘杰，高晨吴，忖一如，等F M O C 新型周相法合成胸腺素a l及其反应途径 刀天津药学，2 0 0 1，1 3(3)：3 9 9 7 吴蕾。韩香，甘一如等胸腺索q 的F M C K；固相合成E J 万方数据中南药学2 0 0 4 年6 月第2 卷第3 期C e n t r a lS o u t hP h a r m a c y J u n e2 0 0 4-,V o l2N o3化学工业与工稃，2 0 0 1，1 8(6)：3 2 3 1 2 3l n u iT，B o d iJ，K u b ose ta lS o l u t i o ns y n t h e s i so fh u m a n 1 0 3L e sP M i r a n d a，P a u lI LA l e w o o&A c c e l e r a t e dC h e m i c a lm i d e k i n e，an o v e lh e p a r i r r b i n d i v _ gn c u r o t r o p h l c a c t o rc o n s i ss y n t h e s i so fp e p t i d e sa n ds m a l lp r o t e i n s J P r o c N a t l A c a dr i n go f1 2 1a m i n oa c i dr e s i d u e J JP e p tS c i，19 9 6，2S C i U S A 1 9 9 9，9 6(4)：1 1 8 l(1)：2 81 1 1 S h u m p e iS a k s k i h a r a C h c m i c a lS y n t h e s i so fP r o t e i n si nS o l u 1 3 K o e h e n d o e d e rG G，K e n tS B H C h e m i c a lp r o t e i ns y n t h e s i st i o n J B i o l l y m e r s(P e p t i d eS c i e n c e)，1 9 9 9 5 1(5)：口 C u r r O p i nC h i e mB i o l，1 9 9 9，3(6)：6 6 52 7 9白藜芦醇的抗肿瘤药理作用研究新进展巫志峰，赵瑞芝(广东省中医院中心实验室，广州5 1 0 2 1 0)中图分类号：R 9 7 9 1文献标识码：A文章编号：1 6 7 2-2 9 8 1(2 0 0 4)0 30 1 6 70 3白藜芦醇(3，4，5，一三羟基二苯乙烯；r e s v e r a t r o )是一种活性非黄酮多酚物质，广泛存在于葡萄、花生、虎杖等天然食物或药物中，一般认为其是一种植物抗毒索，在植物受到病原性进攻和环境恶化时产生的。白藜芦醇具有显著的抗炎、抗突变、抗氧化，抗自由基以及抑制血小板聚集的作用，可预防动脉硬化，防止冠心病；降低血清和肝脏的脂质，保护肝脏，被确定为虎杖等中药的有效成分和质控指标之一；存原料提供方面，目前研究者已经改进从葡萄提取方法，并在多种植物中发现了白藜芦醇可供制备提取，并将应用化学合成等方式进行生产，甚至对白藜芦醇及其同系物进行了合成工艺及生物活性评价“J。近年研究表明，白藜芦醇可抑制癌变过程中细胞和组织变异，成为预防、抑制和治疗组织癌变和肿瘤发生的研究热点。白藜芦醇可抑制肿瘤的起始、促进和发展3 个阶段，且体外实验表明其对多种肿瘤细胞具有抗肿瘤活性”，而近来其作用机制的研究更受到了广泛关注，以下将分别作一概括。1 抑制细胞D N A 合成D N A 的合成是细胞分裂增殖的必要条件，与R N A 还原酶活性、D N A 聚合酶活性以及D N A 产物浓度自反馈机制等有关。研究表明，白藜芦醇对鼠肥大细胞瘤细胞株p 8 1 5 和人髓性白血病细胞株K 5 6 2 都有很强的抑制D N A 合成的能力，其可能的机制是由于白藜芦醇有清除小蛋白R N A 还原酶的酪氨酰基来抑制R N A 还原酶的活性o 。白藜芦醇还能抑制D N A 聚合酶，对该酶的抑制既可以从根本上降低D N A 的合成能力，从【i f f 达到抑制细胞增殖的作用“一，又可涛导半胱氨酸蛋白酶c a s p a s e _ 3 的激活而分解D N A 修复酶(p o l y-A 聚合酶)口，这都提示抑制D N A 的合成是自藜芦醇抑制细胞增殖的重要机制之一。但亦有研究发现白藜芦醇对雄激素敏感的前列腺癌细胞株L N C a P 的D N A合成具有双重作用，即5 1 0m m o l I，_ 1 可增加2 3 倍的D N A 合成，而1 5r m n o l L-1 时则抑制D N A 合成，这种双重作用可F 拜其诱发细胞周期阻滞作用来解释口。2干扰相关信号传导通路C O X 能催化花生四烯酸转变成炎症介质如前列腺素等，而后者可刺激肿瘤细胞的生长并抑制免疫系统，且C O X 能活化具有基因损伤作用的致癌物。以往研究证实，白黎芦醇对C 3 X 的两种异构体结构型C O X(C O X-1)和诱导型C O X(c O X _ 2)均有抑制作用，白黎芦醇在人乳腺和口腔七皮细胞中对C O X2 的活性有直接的抑制作用，并能通过抑制蛋白激酶C(P K C)信号传导通路而抑制C O X-2 基因表达”，或在食管癌整体动物模型(N M B A 诱导大鼠食管癌)中，白藜芦醇使肿瘤组织中(X)X1m R N A 和C O X-2m R N A 的表达均有增加，前列腺素(P G F t)亦有明显增加，从而干预该模型食管癌的生成”-。A P-1 是一类由早基因编码的核转录因子，细胞可通过多种机制活化A P-1，参与细胞周期的调控，而A P1 信号传导通路的异常活化能使细胞增殖失控，因而A P-1 的活化状态与细胞的增殖密切相关。另一个多效转录因子是N F-K B，它在细胞增殖、凋亡等多种生物学过程中起关键作用。N FK B 与A P-1 又称为氧应激转录因子，其活性受细胞内氧化还原状态的调控。在很多实验中，活性氧可作为细胞对生长因子反应的第二信使，促进细胞生长。白藜芦醇是超氧阴离子自由基和羟自由基很强的捕获剂，同时它可以提高谷胱甘肽等的含量，以抑制细胞内的活性氧，影响细胞内氧化还原状态。白藜芦醇还可能通过阻滞R O I 的产生和脂质过氧化来抑制A P1、N F _ K B 及相关激酶M E K 和J N K 的活性，从而抑制细胞增殖o J。研究还发现白藜芦醇对向介素、E G F 以及V E G F 等相关产物的调节作用都与抑制A P1 或N F-K B 因子调控信号基金项目：广东省教育厅自然科学基金课题(Z 0 2 0 1 6)作者简介：砸志峰(1 9 7 7)，男，硕士，研究方向为天然活性产物(包括中药与海洋药物)药理学T e l：(0 2 0)3 3 0 6 8 8 0 9E-m a i l：f o r c e r 1 6 3(：o l n 万方数据蛋白质的化学合成蛋白质的化学合成作者：黄永东，韩彦丽，甘一如作者单位：黄永东,甘一如(天津大学化工学院,天津,300072)，韩彦丽(大连理工大学精细化工国家重点实验室,大连,116012)刊名：中南药学英文刊名：CENTRAL SOUTH PHARMACY年，卷(期)：2004,2(3)被引用次数：2次 参考文献(13条)参考文献(13条)1.Miranda LP;Alewood PF Challenges for protein chemical synthesis in the 21st century:bridginggenomics and proteomics外文期刊 2000(03)2.Cudic M;Bulet P;Hoffmann P Chemical synthesis,antibacterial activity and conformation ofdiptericin,an 82-mer peptide originally isolated from insects外文期刊 1999(02)3.Nishiuchi Y;Inui T;Nishio H Chemical 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