动脉粥样硬化大鼠实验模型的建立与评价.pdf

动脉粥样硬化大鼠实验模型的建立与评价周永刚，蓝晓红，李祥，许锐 摘要 目的建立动脉粥样硬化大鼠模型，通过4 项相关指标评价该模型的特征与临床应用价值。方法将 72 只雄性 SD 大鼠随机分成对照组(n=15)和高脂组(n=57)。高脂组在喂食开始时一次性腹腔注射维生素 D360 万 IU/kg，喂食高脂饲料8 周;对照组给予腹腔注射等体积生理氯化钠注射液，喂食基础饲料 8 周，通过体质量、血清生化指标、不同部位脂肪质量、主动脉及脏器病理变化来评价模型。结果给予高脂饲料5 周、8 周后，大鼠体质量明显下降;总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇明显升高，高密度脂蛋白胆固醇明显下降;炎症因子 TNF-升高，主动脉周围脂肪、脏器周围脂肪质量减少，高脂组大鼠造模 5 周病理改变不明显，造模8 周后大鼠主动脉出现硬化斑块、脂质浸润，心肌组织有少量脂质沉积;肝脏、肾脏冰冻切片油红 O 染色呈强阳性。结论该法制备动脉粥样硬化大鼠模型简便、快速，具备模型特征，适于动脉粥样硬化的相关研究。关键词 动脉粥样硬化;SD 大鼠;动物模型;病理切片;脂肪质量;血清生化指标;主动脉 网络出版时间 2011-08-24 15 50 网络出版地址 http:/www cnki net/kcms/detail/11 4227 R 20110824 1550 001 html 中图分类号 R965 文献标志码 A 文章编号 1008-9926(2011)05-0399-05 DOI 10 3969/j issn 1008-9926 2011 05 07Establishment and Evaluation of an Atherosclerosis Model in RatsZHOU Yong-gang，LAN Xiao-hong，LI Xiang，XU RuiDepartment of Pharmacy，Hospital 81 of PLA，Nanjing 210002，China Abstract Objective To establish an experimental model of atherosclerosis in rats and to evaluate its char-acteristics and clinical application by analyzing four parameters Methods Seventy-two male Sprague-Dawley ratswere randomly divided into control group(n=15)and high fat group(n=57)The rats in high fat group wereinjected with a single dose of vitamin D3(600 000 IU/kg)and loaded with high fat diet for 8 weeks while the con-trol group was given saline and basic food for 8 weeks The model was evaluated by analyzing body weight，serumparameters，adipose tisssue weights and pathological changes Results The body weight of rats as well as the serumlevel of high-density lipoprotein cholesterol were decreased after high fat diet，so was the weight of periaortic fat andvisceral fat The serum level of total cholesterol and low-denisty lipoprotein cholesterol was obviously increased Nochanges were observed in the aorta，heart，kidney and liver after 5 weeks，but after 8 weeks atherosclerotic plaqueswere seen in the aorta Lipid was found in the periaorta Deposition of a little lipid was seen in the myocardliumMany positive red pellets were found in the plasma of cells in the kidney and liver Conclusion The experimentalmodel of atherosclorosis in rats may be easily and quickly establishd by high fat diet to study atherosclerosisKey wordsatherosclerosis;Sprague-Dawley rats;animal model;pathological section;adipose tissueweight;serum parameters;aorta发生于大、中动脉的动脉粥样硬化(atheroscle-rosis，AS)是当今社会影响人类健康的“第一杀手”，也是心脑血管疾病的主要病理基础，其发病率和死亡率均呈显著上升趋势。但其发病原因和机制仍未完全阐明，因此建立一种经济、操作简便、快速的 AS 模型对于研究其确切作用机制及临床抗 AS作者简介:周永刚，主任药师。研究方向:临床药学和中药制剂。Tel:[phone];E-mail:gang1124 sina com作者单位:210002江苏南京，解放军 81 医院药剂科药物的药理作用尤其重要。目前已建立的 10 多种AS 动物模型1-3 包括喂养法、内膜损伤法、免疫刺激法等存在造模时间过长、方法复杂、不够经济、模型特征不够明确等不足。大鼠具有饲养方便、抵抗力强、食性与人相近等优点是较为理想的 AS 动物模型。鉴于上述情况，我们用大鼠建立了一种经济、简便、相对快捷的造模方法，并通过体质量变化、不同部位脂肪称重、血清生化指标、不同脏器及主动脉血993解放军药学学报 2011 年 10 月 20 日 第 27 卷 第 5 期Pharm J Chin PLA，Vol 27，No 5，Oct 20，2011管病理变化确定模型特征。1材料和方法1 1动物SD 大鼠，72 只，体质量(226 15)g 购于南京军区总医院实验动物中心，动物合格证号:SCXK(军)2007-004。清洁级大鼠实验饲养室，温度:21 25，日温差 1，湿度:50%70%，12 h 明暗交替，每日上午800 830 喂食，自由采食、饮水。1 2仪器7170 全自动生化分析仪(日立高科技贸易上海有限公司)，RM2235 切片机、Leica CM1900 冰冻切片机(均为德国莱卡公司)。13试药维生素 D3注射液(规格:1 ml 7 5 mg，上海通用药业股份有限公司，批号:090803);安定注射液(规格:2 ml 10 mg，天津药业焦作有限公司，批号:08102222);氯胺酮注射液(规格:2 ml 0 1g，福建古田药业有限公司，批号:081204)。胆固醇为分析纯，胆酸钠 国药集团化学试剂有限公司，生物级(BR)，批号:WSER20081014;丙基硫氧嘧啶(原料药，南通精华制药股份有限公司，批号:PTU-99-091001)。1 4AS 大鼠模型的制备将 SD 大鼠，随机分为对照组(15 只)与高脂饲料组(57 只)。对照组给予基础饲料喂食 8 周，高脂组给予高脂饲料喂食 8 周，即 3%胆固醇、0 5%胆酸钠、0 2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、81 3%的基础饲料。同时在给予饲料前，腹腔注射维生素 D3注射液 60 万 IU/kg，对照组给予同体积的生理氯化钠注射液，并每周记录体质量变化。1 5血清生化指标测定分别于造模 5 周、8 周将SD 大鼠禁食 12 h，腹腔注射安定注射液 5 mg/kg 加氯胺酮注射液 50 mg/kg 麻醉，心脏静脉采血。将静脉血离心后取血清置于 20待测。采用酶联免疫法测定血清生化指标，包括总胆固醇(total cholester-ol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high-denisty lipopro-tein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-denisty lipoprotein cholesterol，LDL-C)、甘油三酯(tri-glyceride，TG)、肿瘤坏死因子-(tumor necrosis fac-tor-，TNF-)。1 6不同部位组织及脂肪称重取不同部位组织称重，包括心脏、肾脏、主动脉、胃肠道及其周围脂肪。其中主动脉取主动脉弓至髂动脉分叉处。1 7病理切片17 1主动脉病变程度检测将主动脉纵向剖开，在 10%福尔马林溶液中固定，随后对主动脉血管条油红 O 染色。另外，为确定斑块面积及部位，取不同部位主动脉，包括主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉横切面，石蜡包埋，连续切片，HE 染色。1 7 2脏器的病理切片取心脏(距心尖 0 5 cm处)、肝脏、肾脏的横断面，作冰冻切片，并进行油红O 染色。上述病理切片制备完成后，采用 Image Tool图像分析仪采集病理图片。1 8统计学处理采用 SPSS11 5 软件处理，数据以 珋x s 表示，先采用方差分析，后采用非配对 t 检验进行组内、组间比较。2结果2 1AS 模型大鼠体质量变化SD 大鼠给予高脂饲料后，体质量增长缓慢，喂食饲料 7 d 后，高脂饲料组大鼠体质量较对照组明显下降(P 0 01);随后该趋势越来越明显，其中以给药 28 d 体质量下降最为明显，见图 1。注:与对照组比较，cP 001。图 1AS 造模 SD 大鼠体质量变化2 2不同部位组织及脂肪称重SD 大鼠 AS 造模8 周较造模 5 周，不同部位脂肪的绝对质量、相对质量下降更明显。且造模 8 周心脏、肾脏、肾周脂肪，主动脉、主动脉周围脂肪，高脂组胃肠道、胃肠道周围脂肪的绝对质量，较对照组明显下降(P 0 01);高脂组心脏、肾脏、胃肠道、胃肠道周围脂肪的相对质量，较对照组明显下降(P 0 01)，肾周脂肪、主动脉的相对质量，高脂组较对照组相比下降(P 0 05)，见表 1。2 3血清生化指标变化2 3 1血清血脂生化指标变化由图2 可见，SD 大鼠 AS 造模5 周，高脂组较对照组血清 TC、LDL-C 上升(P 005)，TG 有所下降，但无显著性差异;高脂组较对照组血清 HDL-C 有所升高，但无显著性差异。由图3 可见，SD 大鼠 AS 造模8 周，高脂组较对照组004解放军药学学报 2011 年 10 月 20 日 第 27 卷 第 5 期Pharm J Chin PLA，Vol 27，No 5，Oct 20，2011表 1SD 大鼠高脂饲料 AS 造模脂肪称重项目5 周对照组(n=3)高脂组(n=4)8 周对照组(n=3)高脂组(n=4)体质量420 87413275 19844668 745194 354c组织质量(g)心脏118 003045 004c121 0050 65 004c肾脏267 014128 009c276 0111 59 017c肾周脂肪148 004008 008c217 0280 53 001c主动脉015 001009 001c017 001009 0004c主动脉周围脂肪1 1 0 21025 005c177 0180 65 012c胃肠道802 021422 030c626 0274 39 015c胃肠道周围脂肪610 031101 031c932 0572 62 014c肝脏12 63 012671 096c1308 0511194 022组织质量与体质量比值(mg/g)心脏281 011345 022259 0089 76 216c肾脏636 025997 070c591 0181080 112c肾周脂肪352 003047 037c465 061964 2 28b主动脉037 003073 008b036 002046 0 02b主动脉周围脂肪262 053190 011378 0363 35 0 62胃肠道19 12 0833302 356b1343 0662265 076c胃肠道周围脂肪14 56 102723 109c1996 1141352 080c肝脏30 08 0515082 313c2797 0746159 131注:与对照组比较，bP 0 05，cP 0 01。血清 TC、LDL-C 明显上升(P 0 01)、HDL-C 明显下降(P 0 01)。从上述指标可见，SD 大鼠 AS 造模时间的延长，血清血脂水平恶化越来越明显。注:与对照组比较，bP 0 05。图 2AS 模型大鼠造模 5 周血清指标23 2血清炎症因子 TNF-的测定从图 4 可以看出，SD 大鼠 AS 造模 5 周，高脂组血清 TNF-浓度为(262 86 71 47)pg/ml 高 于 对 照 组(154 40 33 26)pg/ml，约为对照组的 1 7 倍;SD大鼠 AS 造模 8 周，高脂组血清 TNF-浓度为(100 16 34 41)pg/ml 高 于 对 照 组(47 86 42 38)pg/ml，约为对照组的 2 1 倍。随着造模时间的延长，高脂组 TNF-浓度也明显升高。注:与对照组比较，cP 001。图 3AS 模型大鼠造模 8 周血清指标2 4AS 模型病理切片2 4 1主动脉石蜡切片 HE 染色病变程度检测由图 5 图 7 可见，在造模 8 周后，主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉病变部位不同程度出现内膜增厚破104解放军药学学报 2011 年 10 月 20 日 第 27 卷 第 5 期Pharm J Chin PLA，Vol 27，No 5，Oct 20，2011坏，内皮细胞排列不完整，中膜平滑肌排列不规则，其中以主动脉弓变化最明显。2 4 2主动脉血管条油红 O 染色病变程度的检测由图 8 可见，AS 造模 5 周，高脂组主动脉血管条，轻微红染，脂质浸润斑块明显;由图 9 可见，AS 造模8 周，高脂质组主动脉血管肉眼可见斑块，明显红染，脂质浸润斑块增多明显。2 4 3脏器冰冻切片油红 O 染色图 10 表明，SD大鼠 AS 造模 8 周，高脂组肾脏组织内有大量红色脂质沉积，油红 O 染色阳性区呈片状;由图 11 可见，大鼠造模 8 周肝脏肝窦细胞质内出现大量红染脂质颗粒，表明肝脏存在脂质沉积;对照组未出现明显病理变化;由图 12 可见，大鼠造模 8 周，心肌组织存在脂质沉积，油红 O 染色呈阳性，从图 10 图 12可以看出，SD 大鼠 AS 造模 8 周，以肝脏、肾脏脂质浸润明显，心脏脂质浸润轻微。204解放军药学学报 2011 年 10 月 20 日 第 27 卷 第 5 期Pharm J Chin PLA，Vol 27，No 5，Oct 20，2011A:对照组;B:高脂组图 12SD 大鼠 AS 模型造模8 周心脏冰冻切片油红 O 染色3讨论本研究建立的一种简单、经济、造模周期短的AS 造模方法确定了模型特征。模型特征是本课题研究的目的。首先，造模动物选择 SD 大鼠具有一定的科学性，其具有饲养方便，抵抗力强，食性与人相近的优点，是较为理想的 AS 动物模型11。再者，造模前腹腔注射维生素 D3，能使血浆中钙浓度显著升高，破坏动脉的内皮，同时配合给予高脂饲料，加速了 AS 使脂质沉积于血管壁，避免了单纯给予高脂饲料造模周期过长、不经济的特点;最后，在高脂饲料中加入胆酸钠，能明显增加大鼠对胆固醇的吸收。加入丙基硫氧嘧啶，能够减少胆固醇的代谢，导致血清中总胆固醇含量升高。将造模 8 周与 5 周的AS 模型通过体质量、脂肪质量、血清生化指标、病理切片 4 项指标综合评价，最终将造模周期定为 8 周。AS 模型特征及评价体系的建立。(1)AS 造模5 周、8 周，高脂组 SD 大鼠体质量及不同部位脂肪质量均明显下降，且高脂组 SD 大鼠饮食量明显减少。因此，推测体质量、不同部位组织及脂肪质量变化可能与饮食量相关。(2)血清生化指标结果表明，AS 造模 5、8 周模型中，高脂组血清血脂指标TC、LDL-C 明显升高。造模 8 周血清 HDL-C 明显降低，这可能与高脂饲料喂食直接导致脂质代谢紊乱有关12，13，脂代谢异常血清中 TC 和 LDL-C 的升高是诱发 AS 的首发因素。同时，AS 大鼠 TNF-在明显升高。这可能与 LDL-C 的氧化产物 OX-LDL-C 在AS 这个炎症过程中起着关键作用有关，它可使平滑肌内活性氧簇增加，如超氧阴离子、过氧化氢等，可作为细胞内第二信使，介导促炎性细胞因子 TNF-的表达14-16。(3)病理检测结果显示，主动脉、肝脏、肾脏、心脏均不同程度的 AS 改变。AS 大鼠主动脉内皮损害，平滑肌紊乱、稀少，斑块基底钙化，甚至有血管外膜胶原，毛细血管增生，其中以主动脉弓变化最为明显。这与 AS 的发病机制有着密切的关系。AS 是血管壁、内皮细胞、脂质、单核-巨噬细胞、血管平滑肌细胞及血小板相互作用导致的慢性炎性反应。在正常情况下动脉壁的内皮细胞抵抗淋巴细胞浸润和纤维形成，但在腹腔注入维生素 D3，喂食高脂饲料的刺激下诱发疾病，激活并刺激内皮细胞表达 一 系 列 的 黏 附 分 子，通 过 诱 导 炎 症 因 子TNF-、血管紧张素、氧化脂质蛋白等相关危险调节因子，使血液中单核细胞和大多数的炎性细胞成群大量黏附激活内皮细胞，炎症蛋白进入内皮。在血管内皮单核细胞成熟转化为巨噬细胞，巨噬细胞表达受体侵蚀修饰脂蛋白颗粒，在其表面形成泡沫细胞导致动脉斑块形成17。总之，该 AS 模型的制备具有简便、经济、造模周期短、稳定、特征明确的特点，值得推广应用，对于研究 AS 分子生物学机制，抗 AS 药物的药理作用机制具有重要的意义。参考文献 1杨永宗 动脉粥样硬化性心血管病的基础与临床M 北京:科学出版社，2004139-163 2张军平，彭立，李良军，等 实验性兔主动脉粥样硬化易损斑块模型的建立与评价J 中国实验动物学报，2009，17(3):161-165 3方顺淼，张清华，蒋知新 液氮冻伤术建立动脉粥样硬化破裂斑块及血栓模型 J 中国比较医学杂志，2009，19(3):20-24 4杨鹏远，苪耀诚，焦亚斌 动脉粥样硬化大鼠实验模型的建立 J 第二军医大学学报，2003，24(7):802-804 5陈修，陈维洲，曾贵元，等 心血管药理学(第 2 版)M 北京:人民卫生出版社，2001516 6张军平，许颖智，李良军，等 实验性动脉粥样硬化复合建模的方法及评价J 中国比较医学杂志，2009，19(1):41-45 7傅琛，夏强，曹春梅，等 活性氧、NO 和线粒体 ATP 敏感钾通道在 TNF2A 预处理对缺血/再灌注心肌保护中的作用J 中国应用生理学杂志，2005，21(1):20-24 8李宏，卞茸文，娄青林，等 颈动脉内中膜增厚的危险因素及与相关炎症标记物水平的关系J 陕西医学杂志，2008，37(12):1614-1616 9候晓强，薛飞，袁建新，等 普罗布考对颈动脉硬化症的抗氧化和抗炎症作用 J 陕西医学杂志，2008，37(12):1614-1616 10Libby P，Okamoto Y，Rocha Vz，et al Inflammation in atheros-derosis:transition from theory to practiceJ Circulation J，2010，74(2):213-220(收稿日期:2011-03-20;修回日期:2011-05-04)(本文编辑金杨红)304解放军药学学报 2011 年 10 月 20 日 第 27 卷 第 5 期Pharm J Chin PLA，Vol 27，No 5，Oct 20，2011