母猪流产与高热综合征主要病原检测以及规模猪场猪繁殖与呼吸综合征血清学监测与分析.pdf

投稿信箱:p i g s t o d a y v i p.1 6 3.c o m2 0 0 7年第3期P I GS T OD A Y!2 0 0 6年5月起,一场从我国南方江西等省开始流行的严重疫病给我国养猪业造成巨大的损失。这种传播速度快、发病和死亡率高、猪体温升高、治疗效果差的疫病被称为猪无名高热病或猪无名高热综合征。进入2 0 0 6年年底,似乎寒冷的气温也无法阻止该病的流行,继续给我国北方地区猪群造成威胁,而且繁殖障碍问题尤其突出,母猪发生流产和产死胎非常严重,给猪场生产造成巨大损失。关于发病的原因还不完全清楚。在前期工作中,有研究机构发现变异的猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)病毒(P R R S V)在此次疫情发生中起重要作用,中国兽药监察所宁宜宝等从病死猪病料中分离到了P R R S V,病毒单独感染实验猪产生高热并死亡,但病死时间和病理变化与田间有差异。另外其它有关单位发现圆环病毒型(P C V-2)和巴氏杆菌等细菌也是检出率较高的病原。另有部分学者分离到了新的病毒,但是对其生物学特性和致病机理还有待于进一步深入的研究工作。猪繁殖与呼吸综合征(P R R S)是由P R R S V引起的以母猪繁殖障碍和呼吸道疫病为特征的严重传染病。自1 9 8 7年在北美首次报道发生以来,该病几乎席卷全球所有养猪的国家和地区,给全球养猪业造成巨大经济损失。我国在1 9 9 5年少数猪场爆发P R R S,随后迅速在全国流行,目前已是我国猪群的重要威胁性传染病,P R R S V一方面引起母猪流产、死胎、产木乃伊胎,同时也是猪呼吸道疾病综合征(P R D C)的重要原发性病原,还可造成猪体免疫抑制,目前尚无特别有效的防控手段。我们对2 0 0 6年底(1 1-1 2月)从河北、河南、浙江、江西、山西等5个省1 1个规模猪场发生母猪流产和(或)无名高热症病猪的样品进行了部分常见病原的检测。其中,用R T-P C R方法对所有样品进行了P R R S V病原检测,同时对2 0 0 6年国内部分地区P R R S V血清学流行情况进行了总结,一并报告如下。一、材料与方法1.检测样品来自河北、河南、浙江、江西、山西等5个省1 1家规模化养殖场2 6份发生母猪流产和高热综合征的流产胎儿或组织样品,发病时间为2 0 0 6年底。2.血清学样品来自北京、河北、天津、浙江、山东、江西、山西、河南、辽宁等地共5 2个规模猪场共5 9 7份样品,样品采集时间为2 0 0 6年1-1 2月。3.发病情况在这些发病场中,由于管理水平和隔离条件不同,流行特征、临床症状和病理变化存在一定差异。发生高热病的病例大部分猪场从保育猪开始,有些猪场发病先从生长育肥猪开始,部分猪场母猪流产与高热综合征主要病原检测以及规模猪场猪繁殖与呼吸综合征血清学监测与分析周绪斌西班牙海博莱生物大药厂北京代表处1 0 0 0 8 6倪娇焦连国刘明明许秀梅包爽赵亚荣大北农集团生物制品事业部北京海淀1 0 0 0 8 5摘要:2 0 0 6年发生于我国猪群的母猪流产与高热综合征对我国养猪业造成很大经济损失。我们对2 0 0 6年底1 1个发生母猪流产与高热综合征猪场常见病原进行了检测,结果2 6份流产胎儿或高热病组织样品经R T-P C R检测有2 5份P R R S V核酸为阳性。7个猪场中有3个场检测到猪瘟病毒抗原阳性,7个猪场中有5个猪场存在伪狂犬野毒抗体,河北某场检测到弓形体抗体呈阳性。这说明P R R S V感染很可能是母猪流产和高热综合征疫情的重要原因之一,但是真正的病因和发病机理还有待于进一步深入的研究工作。本研究利用E L I S A方法对2 0 0 6年全年部分省市5 2个规模猪场共5 9 7份样品进行了P R R S V血清学检测,发现8 0.8%猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(P R R S V)血清学阳性,样品阳性率为3 8.7%。说明P R R S V感染在我国已经很普遍,对于P R R S V的控制应采取综合措施,而不可仅仅依赖疫苗。关键词:母猪流产;猪无名高热综合征;猪繁殖与呼吸综合征病毒;R T-P C R猪场保健3 7N O.3,2 0 0 7网址:w w w.p i g s t o d a y.c o mP I GS T OD A Y!猪场P R R S VP R R S V抗体C S F V抗原C S F V抗体P R V野毒抗体乙脑抗体细小病毒抗体弓形体抗体P C V-2抗体河北A4/43/1 0N D1 0/1 00/1 0N DN DN DN D河北B1/1N DN DN DN DN DN D2/2N D河北C3/3N D0/2N D1/2N DN DN DN D浙江D1/1N D0/4N D0/4N DN DN DN D河南E5/5N DN DN DN DN DN DN DN D河北F4/4N D3/1 2N D2/1 25/1 2N DN DN D江西G1/1N D1/4N DN DN DN DN DN D河北H1/2N DN DN DN DN DN DN DN D河北I2/28/1 46/1 4N D2/1 25/1 05/1 0N DN D山西J2/2N D0/2N D3/3N DN DN DN D河北K1/1N D0/8N D2/8N DN DN D0/8则首先表现为严重的母猪繁殖障碍,另有部分猪场所有猪群同时发病,哺乳仔猪一般最后受影响。疫病传播速度极快,如不果断采取措施,最终都会发生所有猪大面积感染、发病和死亡,发病率1 0%5 0%,病死率很高,一般达3 0%5 0%,有的猪场甚至高达1 0 0%。临床主要症状是猪群突然发病,采食量下降或食欲废绝,发病猪体温升高至4 0 4 1.5,高烧不退,呼吸困难,精神沉郁。部分病猪流鼻涕、眼睑肿胀、眼睛有粘性分泌物,甚至造成双眼粘合。患猪皮肤发红,首先从耳部开始,后期四肢末梢、腹部出现紫斑,也有部分猪皮肤苍白。部分猪毛孔出现出血性渗出,皮肤呈铁锈样。少数猪出现神经症状,表现为步态失调,死前角弓反张或四肢乱划。部分猪便秘,也有部分猪出现严重腹泻。值得关注的是,在此次北方的疫情中,母猪的繁殖障碍表现非常明显,部分母猪在怀孕后期出现流产,产死胎、弱仔和木乃伊胎,繁殖障碍发病率超过5 0%,有的猪场在1 2个月内达到1 0 0%,同时伴有母猪发热。病理变化可能由于病程的长短、继发感染与混合感染的情况不同而存在差异。病猪主要表现为肺部病变,出现间质性肺炎,有的肺部有出血点,有的有一层纤维素样渗出物。肺肿胀、变硬、间质增宽,呈斑驳状黄褐色非萎陷性的橡皮状肺。有的病例中尖叶、心叶及膈叶下缘出现对称性肉样病变。气管内充满大量泡沫样分泌物,肺门淋巴结肿大出血明显。部分病猪胃部出血,溃疡,胃内空虚,充满黄色积液。肝脏呈紫黑色,部分猪脾肿大、梗死。肠系膜淋巴结肿大呈串珠状,少见出血。部分病猪喉头出血,部分猪膀胱有少量出血点。肾脏以肿大为主,被膜不易剥离,质地变脆,出血少见,个别病例有密布的点状出血。脑膜轻度充血。病程长的病猪关节肿涨,关节腔内充满大量浆液性或脓性积液。发热的病猪通常很难用常规药物控制,即使通过安乃近或氨基比林将体温降到正常,但很短的时间马上反弹,用各种抗菌药物治疗效果不佳。4.常见病原的检测猪瘟病毒(C S F V)抗原检测采用E L I S A方法,C S F V抗体检测采用阻断E L I S A方法或(和)间接血凝法,伪狂犬病毒(P R V)野毒检测采用g E-E L I S A方法,乙型脑炎病毒抗体检测采用乳胶凝集法,细小病毒、弓形体和P C V 2抗体检测采用E L I S A方法。5.R N A的提取采用T r i z o l(G I B C OB R L公司)提取组织总R N A,操作按说明书进行。6.P R R S VR T-P C R扩增上 下 游 引 物 分 别 为:5 -A T G C-C A A A T A A C A A C G G C A A G-3,5 -A C A G C A T C A C C C T C A GC A T G A-3,扩 增 目 标 片 段 为P R R S VO R F 7。1 0ml反转录体系包括:Mg C L22ml,1 0 R TB u f f e r 1ml,d d H2O3.7 5ml,d N T P1ml,R N a s eI n h i b i t o r 0.2 5ml,A MV反转录酶0.5ml,下游引物0.5ml,R N A1ml。反转录 程序:5 0 2 0 mi n,9 9 5 mi n,5 5 mi n。5 0ml P C R反应体系为:5 P C RB u f f e r 1 0ml,d d H2O2 9.2 5ml,T a K a R aE xT a qH S0.2 5ml,上游引物0.5ml,c D N A1 0ml。P C R反应程序为:9 4 3 mi n,9 4 3 0 s,6 5 4 0 s,7 2 4 0 s,3 0个循环,7 2 1 0 mi n,1%的琼脂糖凝胶检测P C R产物。7.P R R S V抗体检测采用间接E L I S A(武汉科前动物生物制品有限责任公司)方法,操作参照说明书进行。二、结果与分析1.常见病原实验室检测结果1 1个发生母猪流产与高热综合征猪场常见病原的检测结果见表1。利用R T-P C R方 法 对 所 有 样 品 进 行 了P R R S V核酸的检测,结果2 6份流产胎儿或高热病组织样品中有2 5份为阳性。从7个猪场中,有3个场检测到猪瘟病毒抗原呈阳性,7个猪场中有5个猪场流产母猪存在伪狂犬野毒抗体,河北B场检测弓形体抗体呈阳性,见表1。2.P R R S VR T-P C R扩增结果表1部分发生母猪流产与高热综合征猪场主要病原实验室检测结果备注:P R R S V检测采用R T-P C R方法,P R R S V抗体采用E L I S A方法,C S F V抗原检测采用E L I S A方法,抗体采用间接血凝法,P R V野毒抗体检测采用g E-E L I S A方法,乙脑抗体检测采用乳胶凝集法,细小病毒、弓形体和P C V-2抗体检测采用E L I S A方法。ND为未检测项目。猪场保健3 8投稿信箱:p i g s t o d a y v i p.1 6 3.c o m2 0 0 7年第3期P I GS T OD A Y!2 6份发生“猪无名高热综合征”病料经R T-P C R检测,扩增产物分子量大小与预期结果相符,为3 8 0b p,结果如图1 4所示。图1显示,河北A场4份、河北B场1份病料均为P R R S V阳性;图2显示,河北C场3份、浙江D场1份、河 南E场5份 病 料 均 为P R R S V阳性;图3显示,河北F场4份均为P R R S V阳性;图4显示,江西G场1份、河北H场2份、河北I场2份、山西J场2份、河北K场1份病料中只有河北H场有1份病料为阴性,其余均为P R R S V阳性。3.部分规模化猪场P R R S V血清学监测结果经E L I S A方法检测5 2个规模猪场共5 9 7份样品,8 0.8%猪场P R R S V血清学阳性,样品阳性率为3 8.7%,见表2。值得关注的是,除极个别猪场外,大部分猪场都未免疫P R R S V疫苗。三、讨论1.自从2 0 0 6年5月我国南方江西部分地区首先发生猪的无名高热病以来,该病迅速向我国其他地区蔓延,猪群发病率和死亡率很高。同时,在北方发生的疫情中,母猪流产问题尤其严重。关于致病的真正原因也众说纷纭,兽医诊断中心发现由于P R R S Vn s p 2基因的突变导致组织嗜性发生改变,同时病毒毒力增强,从而引发严重疫情,其他学者分析P R R S VO R F 5基因的突变也可能导致免疫原性发生改变使致病力增强。中国兽药监察所宁宜宝等从病死猪病料中分离到了P R R S V,病毒单独感染实验猪产生高热并死亡,但病死时间和病理变化与田间有差异,因此提示与猪场的一些激发因子或其他病原混合感染相关。经过对R T-P C R阳性样品同时应用特异性引物进行分析,证实部分病毒存在较明显的变异。我们在检测中也发现,部分猪场同时存在猪瘟病毒或(和)伪狂犬野毒感染,特别是在母猪伪狂犬野毒感染率高的猪场,母猪流产问题更加严重。北方部分猪场同时存在弓形体感染。另有部分学者从病料中分离出的新的病毒,但是这种新病毒在致病中的作用如何有待深入的研究,是否该新病毒 与P R R S V共 同 作 用?还 是 由 于P R R S V与P C V-2等共感染降低了其它病原的感染致病阈值,从而使猪群更易发病?P C V-2共感染可能进一步加重了疫情,因为二者都可引起免疫抑制。严重的免疫抑制状态一方面可能促进了强毒P R R S V的变异,另一方面在我国猪群卫生状况普遍不佳的情况下,病原细菌的继发与混合感染促使疫情突发,损失加重。因为我们在监测工作中发现,在发病的保育猪或生长猪中,样品来源检测样品数 阳性样品数 样品百分率猪场数阳性猪场数 猪场百分率北京1 0 85 34 9%1 297 5%河北1 4 68 65 8.9%1 41 28 5.7%天津1 564 0%331 0 0%浙江6 21 32 1%548 0%山东1 596 0%111 0 0%江西1 6 43 52 1.3%658 3.3%山西4 91 22 4.5%745 7.1%河南2 81 45 0%331 0 0%辽宁1 033 0%111 0 0%总计5 9 72 3 13 8.7%5 24 28 0.8%表2 2 0 0 6年部分规模猪场P R R S V血清学检测结果流产胎儿猪场保健3 9N O.3,2 0 0 7网址:w w w.p i g s t o d a y.c o mP I GS T OD A Y!猪瘟和其它病原抗体滴度都非常低。另外是否在同一个猪场或同一动物体内存在多个P R R S V毒株感染?我们从最近发生高热病同时引起严重繁殖障碍的1 1个猪场的2 6份病料中,有2 5份检测到了P R R S V,虽然目前尚不能完全肯定P R R S V是否就是此次高热病中的唯一致病因素,但如此高的检出率说明P R R S V感染确实在发病中起了非常重要的作用,而血清学监测结果显示,2 0 0 6年全国部分地区P R R S V血清学监测阳性率为3 8.7%。2.血清学分析表明,P R R S在我国猪群中普遍存在,在我们2 0 0 6年监测的5 2个规模化猪场中,有8 0.8%猪场血清学为阳性,3 8.7%送检血样呈阳性,这些猪场绝大部分都未注射P R R S V疫苗。这与国内其它单位的报道基本一致,卫秀余等2 0 0 5年用P C R方法对5 7个保育猪发生呼吸道疾病的猪场送检的2 5 4份样品进行了P R R S V抗原检测,从5 3个猪场检出阳性样品,占9 3%,样品阳性率为9 1.3%,分别比2 0 0 4年上升3%和6%。另外对6 0个猪场送检的2 2 6份死胎样品检测,1 3个猪场检出阳性,占2 1.7%,样品检出率占2 0.4%。宋云义等在河南省5个年产万头商品猪场中随机采集1 6 5头种猪及仔猪血清进行蓝耳病血清学调查,结果 旧 的 商 品 猪 场 种 猪 群 阳 性 率 为9 8.1 8%,仔猪群为7 8.6 5%,而新建商品猪场种猪群阳性率为6 3.6 4%,仔猪群为9.5 2%。3.由于高热病的病原和发病机理还在进一步研究之中,目前尚无特效的防制方法,也没有高效特异的疫苗。防制高热综合征,严格的生物安全措施是非常关键的环节,如果发现疫情,将样品送相关单位进行检测的同时坚决果断处理病原,封锁猪舍和猪场,采取严格的消毒和隔离措施,对发病猪进行掩埋和无害化处理,笔者在部分猪场紧急疫情处理中证明这是最有效的措施,同时对可疑猪群和发病猪群应用胺基维他饮水,缓解应激,添加适当的广谱抗菌素,而不要急于注射大剂量退烧药。加强对猪群的免疫,特别是猪瘟、伪狂犬病、喘气病、细小病毒病等,这些疫病都有非常有效的疫苗。4.关于猪繁殖与呼吸综合征的控制措施中,弱毒疫苗是有效的措施之一。但是首先要考虑的问题是目前可用的疫苗毒株能否对变异的P R R S V有免疫保护作用?同时P R R S V独特生物学特性决定在应用弱毒疫苗时考虑如下因素:首先疫苗病毒毒株能在猪体内存在较长时间,长达数周到数月,疫苗毒能从免疫猪传播给非免疫猪,疫苗毒株可通过胎盘引起先天性感染,疫苗毒能持续存在于公猪体内并通过精液传播,疫苗诱导的保护性免疫反应形成慢,因此,在发病阶段紧急免疫的效果如何有待于探讨?疫苗形成保护性免疫的时间可能与毒株有关,免疫接种后有些免疫的猪、后备母猪和经产母猪不能产生血清学阳转,成年母猪成功的免疫接种(依血清学转化判断)可能不保证完全没有经胎盘感染和强毒垂直传播。以上特性决定目前的P R R S V疫苗不可能像猪瘟兔化弱毒疫苗、伪狂犬基因缺失疫苗等效果那么确实。蓝耳病弱毒疫苗1 9 9 4年起就在北美得到应用,然而,P R R S仍然是当前美国猪群的头号传染病,据最新的报道,P R R S给美国猪业造成的经济损失为5.6亿美元,北美的实践表明,常规的疫苗和猪群流向控制措施并不能有效控制P R R S的流行。这也给我国养猪业很大的启示,我们不可能依靠现有的疫苗解决所有的问题,而且免疫方案和免疫程序也应因场而异,因地制宜,应根据监测结果制定本场的免疫方案。对于蓝耳病的控制需要采取综合措施。猪场的生产管理,猪只定向流动,培育后备母猪,适时保育猪清群,科学的营养,合适的用药计划,严格的免疫程序,定期的免疫监测才是控制P R R S和高热病的良方。同时国家有关部门也应进一步加强动物疫情的预警应急机制,开展对高热病病原和致病机理的研究,迅速组织包括相关农业院校、研究所、生产单位、猪业协会、学会以及部分企业的技术服务专家开展联合攻关,同时加强对兽药、疫苗混乱市场的监督与管理,以保证我国猪业健康持续发展。参考文献(略)气管内大量泡沫状粘性液体猪场保健4 0