第六章 农药构效关系研究.pdf

第六章农药构效关系研究自1962年Hansch和Fujita在Nature上首次报道了研 究结构与生物活性之间定量关系(Quantitative structureactivity relationships,QSAR)的方法以来，定量构效关系 研究已成为药物化学的中心内容之一，它主要是采用数理 统计的方法研究化合物的生物活性与化学结构之间的变化 规律，并用一定的数学模型来概括和表达构效关系的量变 规律。通过结构与生物活性之间定量关系的研究不仅有助 于了解药物在体内的作用情况，探索作用机制，描述受体 图像，预测同源物的生物活性，避免合成过多的化合物，从而提高合成效率，而且还可以帮助人们设计出具有更高 活性、高选择性的生物活性分子。与此同时，Free和Wilson也尝试用数学加和模型研究 定量构效关系获得成功。此外Kier等根据拓扑学原理用分子 连接性指数作为描述化学结构的参数，这些用物化参数、结 构参数和拓扑参数与生物活性进行相关性的研究，大多用多 重回归分析方法来求出描述构效关系的数学方程。定量构效 关系研究在药物设计中的重要意义是显而易见的。到目前为止，QSAR在研发农药中的应用获得了很大 的成功，这方面的成绩甚至超过了药物领域的创制研究。至今已有多种商品化农药是采用QSAR的方法研制出来的,其中如除草剂苯嗪草酮，澳丁酰草胺，杀虫剂联苯菊酯 及杀菌剂叶菌喳、种菌喳等。生物体外生理 活性物质的结合 与组织细胞外液II与蛋白质 及脂类结合解毒 代谢分解细胞 作用部位机能的变化 生理变化生物活性 的产生2相互作用3-生理生化活性的产生 _/I.输送过程-V由生理活性物质的物理化学性质所支配药物生物活性产生的过程药剂从处理点到作用点移动的难易，受药物透过细胞 壁难易，对组织内蛋白质及脂类亲和力大小，以及遭到代 谢分解的难易等因素支配。药物在生物体内传送时，如果 其亲脂性越大，则在脂肪层中越容易滞留；反之，若其亲 水性越大，则在水中越容易滞留。药剂到达作用部位后，药物与作用点相互作用的难易 程度与有机反应的情况相类似，必须考虑到药物分子的电 性及空间立体大小的影响，作用点可看做是核酸、酶、蛋 白质及细胞膜等生物体大分子的一部分，所以也应考虑到 药物的亲脂性要有利于它与作用点的相互作用。因此药物 分子亲脂性（即疏水性）、结构中的电性及立体大小与其 生物活性密切相关。由于药物分子与受体的相互结合具有一定三维空间 要求，为了更准确表达药物受体之间的相互作用，有必 要从三维空间上来探讨药物分子结构与活性关系，以建 立更加合理的作用模型。在药物定量构效关系研究中，陆续出现了几种考虑 生物活性分子与受体结合时三维结构性质的研究方法，如分子形状分析方法、距离几何学方法以及比较分子力 场分析方法等，这些方法统称为三维定量构效关系(3D-QSAR)方法。3D-QSAR与Hansch-Fujita方法的最大不同就在于，它 们都考虑了生物活性分子的三维构象性质，引入了与生物 活性分子的三维结构信息有关的量作为变元。这些方法能 够比较精确地反映生物活性分子与受体作用的真实图像，更深刻地揭示药物受体相互作用的机理。其中以Crammer 等提出的比较分子力场分析方法(Comparative molecular field analysis,CoMFA)最引人注目，发展也最迅速。Crammer等认为，药物分子与受体之间的可逆性相互 作用，主要是通过非共价键作用如范德华力、静电相互作 用以及氢键来加以实现的，作用于同一受体的一系列药物 分子与受体之间的上述三种作用力场应该有一定的相似性。这样，在不了解受体三维结构的情况下，研究这些药物分 子周围三种作用力场的分布，把它们与药物分子的生物活 性定量地联系起来，应该可以推测受体的某些性质，同时 可依此建立一个模型来设计新的化合物，并定量地预测分 子的药效强度，这就是CoMFA的物理本质。(1)确定药效构象 确定研究化合物的药效构象，依据合理的叠加原则把一系列化合物叠加到一个包含全部 化合物分子的空间网格上。药效构象就是指药物分子在与 受体相结合时所采取的空间构象。当药物与受体作用时其 与受体生物大分子活性部位结合时的构象，不一定是全局 极小构象，只是某一低能构象，如果受体大分子三维结构 不清楚时要确定柔性分子的药效构象是比较困难的，目前 确定药效构象常用的方法有以下2种：如果已知某些药物分子与受体结合的X射线衍射数 据，就把药物分子此时所取的构象作为药效构象，其他没 有晶体结构数据的同类药物分子，选取与这一分子构象相 似的低能构象作为药效构象。绝大多数情况下，由于实验手段所限，药物与受体 结合时的晶体结构是不知道的。这时，我们可以选取研究 对象中生物活性高柔性又小的两三个分子，对它们进行分 子力学或量子化学计算。从这些分子的低能构象中，排除 彼此相差大的构象，得到一个它们所共有的低能构象，这 一构象就作为该类药物分子的活性构象。然后再用分子力 学或量子化学方法寻找其他化合物与这一活性构象相似的 低能构象，即认为是它们各自的药效构象。药效构象确定之后，在进行三维定量构效关系分析之 前，为了提取研究对象系列化合物中共同的结构信息，还 要把这些分子依一定的规则重叠起来，若已知该类化合 物的药效团，直接把这些基团在空间上重叠起来是比较理 想的方法，如果不知道它们的药效团，可以依据已有的知 识和经验，分析化合物中哪些官能团或原子的变化对其生 物活性影响较大，重叠相应的基团和主要的共同结构特征,如苯环、重要的含杂原子基团等。分子的其他部分就取药 效构象下的结构，在空间相应分布。利用分子图形工具，有助于作出合理的重叠假设。(2)根据研究对象及生物活性的特性，选择合适的探 针基团(如计算静电场可用H+探针、范德华作用场可 用C/探针、氢键和疏水性质用H2O探针等)，计算探 针基团位于每个空间网格点上与各个药物分子的相互作用 能量。它们与各化合物的生物活性共同构成CoMFA的QSAR表格。空间网格点分布CoMFA方法示意(3)使用偏最小二乘法可以把变元与因变量之间的关系转化为相应的潜变量之间的关系，这样就可以克服多 元回归的缺陷，再通过交叉验证过程，即可建立一个预 测能力很强的QSAR模型。(4)作CoMFA系数图，并依此设计新化合物。由于 CoMFA-QSAR变元数目庞大，QSAR关系式的系数也有 相应的数量。从这些系数上不易看出它们与生物活性之间 的关系，故CoMFA-QSAR结果是用QSAR系数图。图中 实线表示该处作用场对提高活性有利，虚线表示该处作用 场对提高活性不利。从图中可以清楚地看出某一区域场的 强弱对生物活性的影响最大，据此我们可以设计新化合 物使它具有更强的生物活性。谦宏 HVSO-VHW。QS AR研究在农药创制中的成功实例新型除草剂澳丁酰草胺的设计F ujinami等对氯代乙酰胺类化合物对水稻和稗草的除 草活性进行了QSAR研究,发现邻位取代基的大小对两者活 性都有重要的影响，邻位取代基愈大对活性愈有利。一般来 说，立体效应大，应难于与作用点的匹配，但在这里却显示 出活性高，这可能要通过作物的解毒机制来解释，也许是由 于解毒酶中的琉基难于与立体基 C（）CII（.团大的药物作用，从而防止了药/=Xp/物在生物体内的代谢所至。，x穴一H2c QE t1L烯丙菊酯Al l eth rin12.千联菊酯 Resmeth rinCHS13.年醛菊酯 Ph en o t h r inCl(C)、Cl oX16问题 定量构效关系研究的概念及意义？3D-QSAR与常规方法的最大不同?CoMFA的物理本质?第七章分子生物学技术 在新农药研发中的应用农药的研究通常可分为三个阶段，即农药的筛选与发 现、农药的开发与产业化及作用机理等的研究。农药在防治 农作物病虫害方面的作用也需要分子生物学的研究来阐明其 作用机理，即使在早期的化学农药筛选过程中，也已引进了 乙酰胆碱酯酶、海藻糖酶抑制剂等离体酶筛选方法。生物农药的研究和开发更是与分子生物学技术密不可 分，同时，通过分子生物学的方法和技术，寻求新的害物 靶标或解释现有农药的作用机理，也为新合成农药的设计 和开发提供了必不可少的信息。因此，分子生物学已渗透 到了农药开发的整个过程，在当今农药研究和发展过程中 已经成了不可或缺的一个部分。分子生物学技术在生物农药研发中的应用L分子生物学技术在重组杆状病毒中的应用昆虫病毒种类很多，但重要的病源病毒可分为杆状病 毒、质型多角体病毒、昆虫痘病毒、脓核症病毒、虹彩病 毒和果蝇西格玛病毒等。这些病毒中的杆状病毒已广泛用 于生物防治，包括核型多角体病毒（NPV）和颗粒（GV）体病毒。杆状病毒对昆虫捕食者和鳞翅目以外的益虫或其他非 靶标生物不具有感染性，杆状病毒作为害虫控制制剂是安 全的。目前，国内外已有多种杆状病毒作为生物农药登记,但它们的商业化应用较为困难，部分原因是相对于常规合 成的化学杀虫剂，它们的杀虫速度较慢。另外，与化学农药相比，杆状病毒存在着杀虫谱窄，对高龄害虫需加大用量等缺点，故随着基因工程技术的发 展，从20世纪）80年代末起，科学家开始尝试对杆状病毒 的遗传性状进行各种分子生物学改造，以期获得更优良的 病毒杀虫剂。重组杆状病毒是从病毒最基本的遗传物质DNA的操作 入手，包括基因组DAN的分离、DNA序列的测定、引物的 设计、结构与功能的确定、聚合酶链式反应PCR技术的应 用、质粒的构造、同源重组技术的应用等。另外还包括昆 虫细胞培养技术等，是以基因工程技术为依托来改变野生 型杆状病毒的遗传性状来构建高效快速重组病毒杀虫剂。重组病毒主要从外源基因的插入和缺失这两个方面入手。1.1插入基因(1)插入激素基因的表达通过采用杆状病毒作为一种蛋白质表达载体大量表达一 种昆虫激素，造成昆虫的生长发育紊乱，从而起到快速杀死 昆虫的作用。马铃薯天蛾毛虫的利尿激素基因表达后使重组 的杆状病毒杀死昆虫的速度比野生型病毒提高了 20%。(2)昆虫选择性毒素的表达在野生型的杆状病毒基因重组中，插入昆虫选择性毒 素基因并在昆虫体内表达，以加速被感染昆虫的死亡速度，这也是人们在研究的方法之一。这些毒素有苏云金杆菌的内 毒素、钳蝎毒素和阿尔及尔蝎毒素以及其他昆虫选择性毒 素，如蝎毒素和蜘蛛、海葵和螭的毒素等。这些毒素基因被 分别插入到杆状病毒基因组中，并在昆虫体内得以表达。1.2缺失基因缺失一个内源性的蜕皮几丁质尿著二磷酸葡萄糖转移 酶(egt)的杆状病毒，其杀虫效果显著增强。由egt基因缺 失病毒引起的幼虫早熟或不恰当蜕皮可能导致摄食的停止 或早熟死亡。egt基因缺失的杆状病毒可能是第一代能被 商品化的重组病毒杀虫剂。杆状病毒基因插入与缺失对杀虫速度的影响基因插入与缺失病毒杀死时间的影响egt基因缺失Ac PV22%减少利尿激素基因插入BmXPV20%减少保幼激素酯酸基因插入Ac XPV仅在1龄幼虫保幼激素酯酶基因插入+-G基因获失Ac XPV同单一基因缺失修饰的保幼激素酯酶基因插入Ac XPV20%35%减少羽化激素基因插入+-G基因缺失Ac XPV同单一 基因跳失促前胸腹激素基因插入Ac XPV没有作用几丁质酶基因插入（多角体基因缺失）Ac XPV20%减少（注射）苏云金杆菌内毒素基因插入Ac XPV没有作用钳蝎毒素基因插入Ac XPV没有麻痹活性蝎毒素AaHl T（八基因插入c XPV25%30%减少BmXPV38%减少蝎毒素AaHl T（DA26）基因插入Ac XPV40%减少薄蜻毒素Tx尸1（Pye motes）基因插入Ac XPV41%减少蒲蜻毒素Txp-1（synthetic prom）基因插入Ac PV35%减少蒲蜻毒素丁xp 1基因插入一 egt基因缺失Ac PV40%减少蝶蛛毒素（Diguetia）基因插入Ac XPV10%33%减少蝎毒素Iqh l Tl和2基因插入Ac PV25%30%减少重组杆状病毒表达插入的基因而产生的各种活性成分,并没有完全达到在重组前所预期的效果，这要从昆虫体内 的代谢、生长调节和虫体内的酶系统等方面进行思考，也 需要从杆状病毒在昆虫体内复制繁殖等过程进行考虑。如 保幼激素酯酶在昆虫体内特别短的半衰期，杆状病毒在中 肠细胞复制极慢而使内毒素难以快速地在中肠发挥杀虫作 用等。病毒杀虫剂需要一个较长的时间才能起到杀虫效果，这一问题仍未得到解决。随着分子生物学技术的不断深入,相信在提高杀虫速度，扩大宿主范围和减低病毒感染剂量 等方面必将有所提高。2.分子生物学技术在提高微生物杀虫效率上的应用2.1 苏云金杆菌的研究1953年Hannay首先发现苏云金杆菌(Bacillus thuringiesis,Bt)的杀虫活性与伴抱晶体(Insecticidal crystal proteins,ICPs)有关，并证实伴孑包晶体是一种蛋白质。在 之后的半个多世纪中，以伴抱晶体为中心进行了微生物学、生物化学、形态结构、致病机理等一系列的研究。这些ICPs中含有一种或多种蛋白毒素，所以又称6内 毒素(6endotoxin),6内毒素中又主要以晶体蛋白(Crystal toxins,简称Cry)和细胞裂解蛋白(Cytolitic toxins,简称 Cyt)为主，也是Bt毒素主要的杀虫蛋白成分。5y和Cyt毒 素都属于孔道形成蛋白(pore-forming toxins,PFT),是一 类分泌型水溶性蛋白，经过结构修饰后就可以插入，甚至 穿过寄主的细胞膜。6-内毒素通过昆虫的肠胃作用于消化 系统使昆虫致死，是一种典型的消化道毒剂。Oy毒素有200多种分属于50多个亚群，对鳞翅目、鞘翅目、膜翅目和双翅目等的多种害虫都具有毒性。Cyt 毒素包含Cytl和Cyt2两类，只具有溶血性且目前发现只对 双翅目昆虫有效。Hofte等根据毒素的基因序列与杀虫谱 将Bt毒素分为鳞翅目专一型、鳞翅目与双翅目专一型、鞘 翅目专一型和双翅目专一型4类，以后发现的新基因类型都可以与此标准对照进行归类。Cryl Aa Cryl Ab Cryl Ac Cry IB Cry IC Cry ID Cryl E、Cryl F、Cryl G Cry IX.Cry2B鳞翅目与双翅目Cry2A鞘翅目Cry3A、Cry3B、Cry3B2 Cry3C、Cry3D、Cry6鞘翅目与鳞翅目Cry5双翅目Cry4A、Cry4B、Cry4C、Cry4D、CytA、CytBBt毒素进入昆虫体内后，首先是在昆虫中肠碱性环境 下打开肽链间的二硫键和分子间的盐键，成为原毒素(protoxin)o原毒素再经中肠蛋白酶水解释放出单毒素，对 CrylA毒素来说，从一个130kD的原毒素被剪切成大约6 0kD 的成熟毒素。然后毒素与中肠上皮细胞刷状缘膜囊(brushborder membrane vesicles BBMV)上的受体结合，在 鳞翅目昆虫中，OylA毒素是与一种120kD的APN和210kD 或175kD的钙调素型蛋白结合。紧接着受体钙调素使毒性蛋 白原毒素孔道法内毒素蛋白发生寡聚化，进一步插入膜内形 成一个阳离子选择性离子通道，引起中肠上皮细胞的离子渗 漏，电解质平衡受到破坏，胞外的水进入细胞，导致细胞溶 胀破裂，昆虫由于失水和得不到营养供给而死亡。图20 Bt毒素杀虫作用机理示意图从毒素进入昆虫体内到形成孔洞这个过程中，6-内毒素 要经过两步结构改造才能释放出成熟蛋白。众所周知，人类 的消化液是酸性的，因此Bt毒素在人体内不能被活化，这也 是其在昆虫和人类间产生选择性的原因之一。而对昆虫本身 而言，也存在种类和个体的差异，不同昆虫中肠液的性质和 蛋白酶的种类与组成都各不相同。如鳞翅目幼虫中肠液呈碱 性(pH 8.0-10.5),其主要的蛋白酶是以胰蛋白酶为主的丝氨 酸蛋白酶；大多数的鞘翅目幼虫中肠液为中性或略偏酸性(pH6.57.0),其主要蛋白酶为半胱氨酸蛋白酶；双翅目的幼 虫中肠液呈弱碱性，也是以胰蛋白酶为主。这些差异造成昆 虫对6-内毒素的结构改造也不尽相同，因而对昆虫表现数不 同的敏感性差异和种类特异性。英美等国科学家在研究中发现苏云金杆菌的毒素蛋白 有决定寄主范围和杀虫活性两个功能区。应用分子生物学 技术，目前已发现超过25个基因，其编码的蛋白质产物、昆虫寄主范围以及晶体大小都已报道。目前通过质粒修饰与交换技术或基因体外重组技术，已有对毒素蛋白基因重组而获得活性更强、杀虫范围更广 的苏云金杆菌杀虫剂的报道和产品，如美国Sandoz公司通 过略加改变苏云金杆菌的武汉亚种基因毒蛋白的氨基酸组 成，使其的杀虫毒性提高了2-3倍，然后又将此基因克隆 并经穿梭质粒导入kurstaki亚种，这种具有复合毒素基因 工程菌对多种鳞翅目害虫均有优异的防治效果。该工程菌 除使毒力增强和杀虫谱扩大外，其他特性与原来的菌株并 无差别。目前已经被克隆的Oy基因有10多个，微生物载体包 括病毒、细菌、藻类等的一些种类。利用修饰、改造等部 分合成或全人工合成的Oy基因转化植物，获得的抗虫转 基因植物已有50多种。转基因的马铃薯、棉花和玉米等在 田间大面积种植，取得良好的抗虫效果。球形芽把杆菌Bs的研究球形芽施杆菌是另一种广泛存在于自然界，与苏云金 杆菌相似，是土壤或水域中的一种产芽施杆菌，其中部分 菌株具有杀虫性质，其杀虫谱比苏云金杆菌窄。库蚊对它 最敏感!按蚊次之，多数伊蚊对它不敏感。利用基因工程 技术，将球形芽施杆菌的产毒基因克隆，并在蓝藻中表达,是解决球形芽把杆菌短效的途径之一。农用抗生素产生菌的研究由于抗生素是由微生物产生的次级代谢产物，发酵单位的提高往往涉及到微生物整个代谢过程。根据以往的经 验，为了提高抗生素产生菌的菌种单位，通常使用的有紫 外射线、快中子等物理方法以及加入诱变剂等化学方法，这些方法在过去几十年的生产实践中不断地完善。研究发现抗生素是由微生物体内一系列酶反应进行生 物合成产生的，这些酶同样是由遗传物质DNA的序列决 定的。因此，改变DNA的序列或序列中的某些结构，同 样会对微生物产生抗生素造成影响。人们对阿维菌素的产 生菌和毗咯杀真菌素的产生菌等，其合成抗生素的途径研 究的较为清楚，而且通过基因工程技术，使产生菌改变这 些合成途径中所需的酶而获得目标组分，或提高目标组分 的发酵单位，这方面取得了较大的成功。分子生物学技术对农药发展的影响在对农药的影响上，基因工程技术的最大成果之一是 转基因植物的产生，它从诞生起就迅速发展并将成为21世 纪的重要技术之一。而转基因抗病、抗虫和耐除草剂作物 的大量开发和使用将对农药的生产和应用产生重大影响。转基因作物是农药概念的延伸转基因作物在全球范围内的发展速度及其带来的变化十 分惊人。虽然转基因植物是从20世纪80年代中后期发展的，但已有35科120多种植物转基因成功。转基因作物大部分种 植在发达国家，其中美国种植面积最大，占全球的70%。转基因作物主要从两个方向发展，一是把外源的抗虫 和抗病基因转入到相应的作物中，使其具有抗虫抗病性能 而抵御病虫害的侵袭，这实际上是一种农药概念的延伸。二是将抗除草剂基因转移到作物中。转基因耐除草剂植物对农药的影响通过对除草剂作用机理的研究，从分子水平上了解除草剂作用的原理，通过转基因技术使作物获得或增强对除草剂的抗性遗传性!从而解决除草剂选择性差的问题。抗草甘麟的植物基因工程主要采用三种策略：一促使植物过量产生莽草酸羟基乙烯转移酶E PSPs；二是利用除草剂靶蛋白基因发生的点突变产生对除草 剂的抗性；三是将草甘麟快速代谢成无毒产物。目前已有300种左右的植物先后培育出抗除草剂品种，涉及的除草剂主要有草甘麻、草钱麻、磺酰腺类、咪喳淋 酮类、澳苯脂、2,4-滴等。抗除草剂基因的种类，按其作用机理的不同，主要有 三种：一是产生靶标酶或靶标蛋白质，使作物吸收除草剂后,仍能进行正常代谢；二是产生除草剂原靶标的异构酶或异构蛋白，使其对 除草剂不敏感，如磺酰腺类除草剂和咪喳琳酮类除草剂；三是产生能修饰除草剂的酶或酶系统，在除草剂发生 作用前将其降解或解毒。目前转基因的方法常用的有三种：一是根瘤农杆菌介导的基因转移，根瘤农杆菌原质粒 上有一段DNA称之为T-DNA,在农杆菌侵入细胞时，T-DNA能够插入植物细胞的基因组并稳定遗传给子代细胞；二是基因枪转化法，基因枪是1987年美国康奈尔大学 Sanford等人首先发明的，借高速运动的金属微粒将其表面 的核酸分子引入到受体细胞中的一种遗传物质转化技术；三是借助某些化学品如聚二乙醇PE G等将质粒DNA转入植物细胞。还有一些方法：如电击穿孔转化法、激光微束转化法、显微注射转化法、超声波转化法、花粉管介导转化法以及 萌动种子剥胚法等方法，利用这些方法已经在一些植物中 获得了瞬间或稳定的基因表达。问题转基因作物的发展方向及其应用?抗草甘瞬的植物基因工程策略?第八章农药活性分子的生物合理设计1.生物合理设计的思路及特点生物合理设计(biorational design)是利用靶标生物 体生命过程中某个特定的关键生理生化作用机理作为研究 模型，设计和合成能影响该机理的化合物，从中筛选先导 化合物，然后优化结构来开发新药的一条研究开发途径。生物合理设计是以阐明的药用作用机理为基础的，也 就是应在对作用部位产生的活性作用的微观表现充分理解 的基础上选择靶标进行分子设计。分子生物学研究表明，药物在生物体内的作用靶标通常都是一些生物大分子，蛋 白质、酶、核酸等，它们的三维结构在很大程度上决定了 一个有效药物分子在化学结构上的要求。运用生物合理设计的方法来进行新农药分子的从头设 计时，最理想的情况是研究者所选择的靶标是一个已知其 三维结构与功能信息的蛋白质。这样就有可能从空间结构、电性及疏水性等方面出发，在分子水平上探索药物与靶标 的相互作用及构效关系的基础上进行全新药物的分子设计。目前主要从以下三个层次开展农药活性分子的生物合理 的设计：其一，基于酶或受体的功能与生化反应研究的干扰剂的 设计与开发。其二，基于代谢机理研究的前体农药或先导体的设计与 开发。其三，基于靶标蛋白质结构的农药活性分子合理设计。生物合理设计方法具有以下与其他三种方法显著不同 的特点：其一，前三种传统的分子设计方法是先合成化合物或 先从有机体中提取活性有效成分，通过筛选先从体内发现 活性，再了解其作用机理。而生物合理设计是强调首先从 分子水平上来理解自然生态环境中微生物、动植物等有害 生物的生理生化现象，研究生物体内的生长发育机理，有 的放矢的合理设计抑制有害生物生长发育的物质，发现和 创制农药先导体分子，具有逆向思维的特点。其二，传统的分子设计方法偏重化学的合理设计，只 注重化合物的实际效果，仅在较宏观的生理水平上对化合 物进行研究，因而发现农药的过程简单。而生物合理设计 注重理解活性物质的作用方式，探索发现可以选择调控生 物大分子的小分子化合物，除了合理的化学设计及必需的 合成基础之外，还需选择适当的体外酶或受体活性测定的 方法，正确的评价化合物本质的活性，合理的阐明其活性 的生物化学基础以及化合物的作用机理，因此生物合理设 计需建立在生物化学以及分子生物学的最新研究成果之上,具有研究起点高、知识新等特点。其三，基于随机筛选和类同合成的传统分子设计方法 所需的知识结构单一。在学科上主要是由合成化学与农业 生物科学结合，没有生物化学的介入，其研究队伍仅由合 成化学家和农业生物学家组成，并且研究手段常规化，而 生物合理设计则要求深入到微观的生物化学和分子生物学 的水平进行研究，因而需要合成化学、生物化学、分子生 物学、生物物理学、计算机科学、农业生物学等多学科在 更高层次上的交叉结合。需要有先进的研究手段和一个由 多学科的科学家组成的团队来合作完成，具有多学科交叉 协作的特点。采用生物合理设计方法不仅可以避免随机合成筛选所 产生的盲目性，而且又克服了类同合成法往往只能获得作 用机制相同的活性化合物的缺点，特别是有利于克服和减 缓由于应用多种靶标相同的农药品种而使抗性日益严重的 问题。由于利用生物合理设计的方法十分有助于有的放矢 的获得作用机制不同而具有独特生物活性的新型化合物。因此利用生物合理设计的方法来探索、发现和开发不仅具 有新结构，而且具有新靶标的农药品种已成为国际上新农 药创制的前沿课题和方向。2.生物合理设计的研究方法与作用靶标的选择应用生物合理设计方法进行分子设计通常采用下列程序：(1)首先选择并确定一个单个的酶或受体作为合适的靶标。(2)由理论化学和有机化学家设计和合成可以抑制靶蛋白的 化合物。(3)根据选定的靶标机理，建立离体的酶活性测试或代谢测 试的筛选模型，以及活性筛选体系。在此基础上进行定向筛选,最后通过体内筛选体系来评价化合物的生物活性。为了实施这一研究步骤，需要对期待的生物活性相关 的分子性状，如靶蛋白的三维结构，化合物对靶标酶的作 用位点、相关的生化反应等具有全面而深入的了解。如果 我们不懂得在不同组织内的生命过程和易受攻击点内所包 含的酶系统，那么合理开发具有特定靶标的农药将是几乎 不可能，只有在充分了解上述情况后，我们才有可能开始 设计出干扰活的酶系统的活性化合物，如果又能很好的解 决化合物在生物体内的稳定性和传导性问题，那么便可成 功的获得高效、特效的农药。由于靶标生物种类繁多，生命过程又极其的复杂，可 供选择的作用机理和靶标几乎是无穷的，因而如何选择合 适的靶标成为生物合理设计的一个重要策略问题，在目前 农药研究的实际过程中可以通过下列途径作为选择有效靶标或发现新靶标的来源o(1)选择已在生物化学或分子生物学水平上得到阐明 和解释的作用机理作为研究对象，可以选择这一作用过程 中的关键酶为作用靶标，在这类已知的靶标中，有些已是 商品化农药的作用靶标，但也有一些靶标目前尚未开发成 为商品化农药的靶标。(2)选择已确定了农药活性但作用机制未知的植物保 护剂的作用机制为研究对象，探明其作用靶标，这一途径 可能会为我们提供的新的作用靶标。(3)从具有农药活性的天然产物中寻找新的作用机制,发现新的作用靶标。为了获得高效、高选择性的植物保护剂，在选择靶标 时，还应考虑以下几个原则：其一，选择靶标生物特有的作用机理，可使开发的新 药具独特的选择性，而不影响非靶标生物。其二，选择对有害生物的生长过程中有致命影响或易 受攻击的作用部位为靶标。其三，考虑靶标生物的代表性和经济的重要性，这样 就可能从数以万计的作用靶标中，选出具有实用价值和经 济意义的作用靶标。生物信息学，功能基因组学等用于阐明作用部位的新 技术使新农药发现的研究策略和方法产生了质的飞跃，为 新的作用靶标发现及有效靶标的确定与研究，提供了强有力的技术支持。3.基于酶或受体的功能与生化 反应研究的干扰剂的设计与开发3.1 运用酶化学机制的靶标酶抑制剂的设计与研究从目前对多种农药的作用机理阐明的结果表明，除少 数农药的作用机理是物理作用外，大多数农药都是与某种 特定的酶或受体结合，发生化学反应而表现活性作用的。因此我们可以根据特定酶的化学反应机制来设计能干扰其 活性的酶抑制剂，从而获得新的农药先导体。为了获得高效的靶标酶抑制剂，我们可以采用下列研 究策略来设计合成抑制剂：其一，根据靶标酶的底物或靶标酶底物过渡态的化学 结构特点，包括分子的大小、形状、官能团等，来设计合 成结构的类似物。其二，使所设计的化合物能够与酶的活性中心以非共 价或共价的方式形成比较稳定的复合物或结合体。3.1.1 根据靶标酶的特点设计酶抑制剂丙酮酸脱氢酶系抑制剂的设计与研究催化植物体中由丙酮酸氧化脱蔑转化为乙酰辅酶1的关键代谢过程。R=OCH-CH口O O，II I rKhqqpoDo-1o o在丙酮脱氢酶系催化下，丙酮酸与化合物1与TPP反应的比较取得的研究结果证实了我们试图通过抑制丙酮酸脱氢 酶系来获得具有商品化潜力的除草活性化合物的研究设想,支持了运用酶化学机制设计除草剂靶标酶抑制剂的观点，鼓舞我们对丙酮酸脱氢酶抑制剂的生物合理设计进行新的探索和更深入的研究。丙酮酸脱氢酶系是一个十分复杂的多酶复合物，目前 尚无完整的植物体丙酮酸脱氢酶系的三维结构的数据，还 不可能在蛋白质的三维结构的水平上进行分子设计，但我 们可以考虑其他的研究策略。上述研究表明，从靶标酶的 生物化学反应机制入手，根据其底物的结构特点来合理设计抑制剂，发现先导体是一个值得积极探索的有效途径。3.1.2酶催化过渡态理论及酶抑制剂的设计酶催化过渡态理论，Pauling在对酶催化机制的阐述 中，曾提出酶催化的过渡态理论，他认为酶通过某种方式 与高能、短寿命的过渡态结合而起催化作用，在这个处于 反应底物和产物之间的过渡态构型中，某些键正在形成，另一些键正在断裂。Jenks认为在结构和电荷排列方面，酶分子与它催化 反应的过渡态是互补的，即酶分子充当化学反应的模板，使底物分子转变成新的构型过渡态，随着反应的进行，能 量平衡转向有利于能量较低的产物分子一边，而过渡态不会回到底物分子。在空间结构、疏水性匹配和电子等因素上能够模拟一 个酶催化反应过渡态的稳定化合物被称为过渡态类似物。在酶催化的反应中，一个很重要的特点是酶与反应过渡态 的亲和能力远大于酶与底物或产物的亲和能力，可以设想,底物的过渡态类似物必然是一种很强的竞争性抑制剂，分 析和模拟酶催化反应过渡态的结构是设计获得靶标酶专一 性抑制剂的有效途径因此过渡态理论的提出和运用，对于 靶标酶的三维结构尚不清楚的情况下的生物合理设计，提 供了另一个有效的研究策略。随着分子生物学的发展，越来越多的生化反应机理被 人们阐明，酶催化过渡态理论在药物分子设计中已有较广 泛的应用，许多研究表明凡底物反应的过渡态类似物往往 在与酶的结合上比仅与底物相似的经典的抑制剂作用更强、更持久。进行这类抑制剂的设计，首先要选择合适的酶作 为靶标酶，随后需确定所选择靶标酶的反应机理和可能的 过渡态结构，最后需测试过渡态类似物的化学稳定性。从化学结构的特点来看，目前所报道的过渡态类似物 抑制剂的结构主要可分为：负碳离子类的过渡态类似物、正碳离子类的过渡态类似物、磷酸基转移的过渡态类似物、以及四面体过渡态类似物。在酶催化过渡态理论的指导下,通过设计合成各类过渡态类似物来获得农药靶标酶抑制剂的研究也取得了显著的成效。酶活性M心厂结合中心：酶与底物结合的部位，决定酶的专一性口催化中心：催化底物发生反应的部位，决定酶的催化效率、反映性质。amino ftad side chjiiniunfol ded pMinfol ded pcoCHCOOHI，(X HOOH P氧化作用-ACH?2甲4氯丁酸（无活性）2甲4氯（有活性）苯氧丁酸的代谢活化过程某些有机磷酸酯杀虫剂在昆虫或植物体内被代谢激活 而提高了杀虫活性。最常见的是氧化代谢和水解代谢。例 如某些硫逐磷酸酯和二硫代磷酸酯的P=S键被氧化成P=O 键，如对硫磷转化成为对氧磷。另一些侧链上有硫酿键 CS-C的有机磷化合物其硫原子被氧化变成亚砒或砒，例 如倍硫磷的苯环上甲硫基可被氧化成甲基亚砒或甲砒基。上述被氧化的代谢物均提高了杀虫活性。N()2c2ho对硫磷3-NC2HQ/J/对氧磷NO24SI对硫磷氧化代谢过程A(CH,O)2P倍硫磷实际毒物倍硫磷的氧化活化作用上述通过随机合成或类同合成法开发的农药品种的代 谢机理研究的结果表明：它们都属于前体农药。这些研究 结果给我们带来了很有意义的启示：利用代谢机理的差异 开发前体农药。利用代谢机理的差异来开发前体农药已有 成功的范例，例如在氨基甲酸酯杀虫剂的研究中，利用这 一设计思路和研究策略已很好的解决了灭多威和克百威的 毒性高、不安全的问题。例如，硫双灭多威、丁硫克百威、丙硫克百威等等。这些被称为低毒化的氨基甲酸酯都在生 物体内被代谢，硫桥断开变成老品种而起杀虫作用。这是 利用代谢机理差异开发前体农药最成功的例子。4.2 通过代谢机理的研究发现新的先导化合物代谢机理的研究也给我们提供了另一个有意义的启示:通过代谢机理的研究来发现新的先导化合物，进行新品种 的创制。在现有品种代谢机理研究的基础上，开发前体农 药的例子已有不少，但真正通过代谢机理的研究来发现先 导化合物，由此而成功开发农药的实例却很少。OCH?三邻甲茉基磷酸酯（T（）CP）杀菌剂MTBO LD5o 0.09ng/fly 0MAD 4-8mg/kg 神经者剂，无杀虫活性salio xo n非神经毒剂杀虫活性LDso O O4pg/f lysalithio n（蔬果磷）非神经毒剂LD5（）O.O5gg/fly杀虫剂蔬果磷的发现异恶喋草酮在玉米内迅速*国展薪康建A异恶喳草酮在植物体内的活化与降解过程【4.羟苯基丙酮酸双氧化酶（HPPD）抑制剂】5.基于靶标分子结构的农药分子合理设计在目前众多的新药研究方法中，依据药物作用的靶标 分子结构进行新药设计(Structure Based Drug Design)最受 瞩目，极具发展潜力。有人预言，世纪的药物将从基于 靶标分子结构的新药设计和组合化学的相结合中产生。同 样，这一方法的运用也将为全新农药分子的合理设计及发 现带来新的机遇。基于靶标分子结构的药物分子设计是一种利用在分子 水平上获得的药物靶标分子的结构信息来设计靶标分子的 竞争性抑制剂或拮抗剂的方法。该过程必然涉及靶标蛋白 质的分离纯化；确定靶标分子的三维结构，并依据相关理 论或经验提出的一系列假定的配位基与靶标分子复合物的 三维结构；然后依据这些结构信息，利用相关的计算机程 序和法则模拟出最佳的配位基结构模型；根据模拟结构进 行合成，并进行活性测试和药效评价，进一步优化设计，直至获得满意结果为止。5.1 靶标分子三维结构及配位基-靶标分子复合物三 维结构的测定农药活性分子生物合理设计的方法提出了对蛋白质结 构信息与知识了解的迫切需求，这是了解小配体或抑制剂 与蛋白质间相互作用以及在定量分析与预测可能的结合方 式中必不可少的前提。由于每种功能蛋白在生物体中是以 特定的空间构型来完成生物分子间的相互识别与作用，对 蛋白质空间结构的研究可以了解分子间的识别机制和生化 反应的原理!使我们可以预测蛋白质可能具有的功能，也可 以提示抑制剂应具有的结构特点，为生物合理设计提供思 路，因此三维结构的测定是基于靶标分子结构的农药分子 设计的基础。目前获得三维结构的方法主要有三种：一是通过X射线结晶衍射法获得蛋白质的能量最低构型 的三维结构信息，这是现今最重要的确定生物大分子三维结 构的方法，但此法需要纯净的性质均一的蛋白质结晶体，目 前对那些不易溶解、不易结晶的蛋白质还无法适用；二是通过NMR光谱技术获得易变的蛋白质结构信息，许多蛋白质结构可以用二维核磁共振技术测定，此法无需晶 体，可直接测量溶于水的分子结构和分子的动态改变，获得 蛋白质分子中结构易变的结构特点，并可选择蛋白中某一特 定的区域做检测；三是通过分子模型的计算来获得相关的结构信息。上述三种方法所获的结构信息也是相互补充的。目前 在已有的蛋白质数据库中，大约有400多种已知其三维结 构的蛋白质，其中许多结构可作为药物设计的靶点。随着 人类基因组的破译等重大生物技术方面的突破，这方面的 数据将会以惊人的速度上升。在过去的几十年中，可以为农药生物合理设计直接提 供结构信息的蛋白质三维晶体结构报道几乎没有，随着科 学技术的进步和发展，目前已有乙酰胆碱酯酶以及ALS 酶的晶体结构报道；这些研究结果为农药科学家进一步开 展对靶生物合理设计提供了极其有价值的结构依据。5.2 研究方法与研究策略521计算机辅助分子设计计算机辅助分子设计的结构衍化有两种方法：一是基于靶标蛋白酶三维结构的分子设计；另一方法是不基于靶标酶三维结构的分子设计：第一类是在已知受 体蛋白的三维结构的情况下进行有针对性的分子设计，这种设计方法 被称作全新药物设计(de novo drug design)或合理药物设计(rational drug design)o其前提是靶标酶已被纯化，获得了单晶，并用X射线衍 射技术确定了其三维结构。在已知靶标酶或某些复合物的三维结构的 基础上就可以获得关于配体/药物和受体/酶之间在空间适配性、结合位 点的知识，便可以用计算机图形学的方法观察其大小、形状、构象、取向是否合适；其疏水区是否和疏水口袋相吻合；在结合位点