膜片钳技术及应用专家讲座.pptx

膜片钳技术 向细胞内注射恒定或改变电流刺激，纪录由此引发膜电位改变，这叫做电流钳技术。在详细试验中，可经过给予细胞一系列电流脉冲刺激，诱发细胞产生动作电位。膜片钳技术及应用专家讲座第1页 电压钳技术是经过向细胞内注射一定电流，抵消离子通道开放时所产生离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。因为注射电流大小与离子流大小相等、方向相反。所以它能够反应离子流大小和方向。膜片钳技术及应用专家讲座第2页膜片钳技术 膜片钳技术与电流钳、电压钳技术在命名上并不完全一致，后二者是从电学概念角度命名，而“膜片钳”主要是从机械物理学角度命名。膜片钳技术及应用专家讲座第3页膜片钳技术从字面上了解，膜片钳技术钳制是“膜片”，是指采取尖端经处理微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱电流得以分辨出来。膜片钳技术及应用专家讲座第4页膜片钳技术 所以，膜片钳技术是一个经过微电极与细胞膜之间形成紧密接触方法，采取电压钳或电流钳技术对生物膜上离子通道电活动进行统计微电极技术。膜片钳技术是一个特殊电压钳/电流钳技术。膜片钳技术及应用专家讲座第5页膜片钳技术用特制玻璃微吸管吸附于细胞表面，使之形成10100G密封，被孤立小膜片面积为m2量级，内中仅有少数离子通道。然后对该膜片实施电压钳位，可测量单个离子通道开放产生pA量级电流，这种通道开放是一个随机过程。经过观察单个通道开放和关闭电流改变，可直接得到各种离子通道开放电流幅值分布，并分析膜电位与离子浓度等之间关系。膜片钳技术及应用专家讲座第6页 膜片钳试验系统即使可因研究目标不一样而有所区分，但其基本组成是相同，包含膜片钳放大器和接口，显微镜和视频监视器以及防震台和屏蔽罩等。膜片钳技术及应用专家讲座第7页倒置显微镜、防震台、屏蔽罩、三维操纵仪三维操纵仪倒置显微镜膜片钳技术及应用专家讲座第8页膜片钳放大器膜片钳技术及应用专家讲座第9页膜片钳试验流程膜片钳试验方法包含：制备玻璃微电极；制备细胞标本；建立高阻封接；电流统计。膜片钳技术及应用专家讲座第10页制备玻璃微电极拉制微电极材料：硼硅酸盐毛细玻璃管。要求：玻璃毛胚外径1.31.7，内径1.01.2，壁厚度在0.2以上。管壁越厚，拉制出电极尖端管壁也越厚，电极跨壁电容就越小，噪声也就越低。膜片钳技术及应用专家讲座第11页玻璃微电极及膜片几何形状膜片钳技术及应用专家讲座第12页电极拉制仪膜片钳技术及应用专家讲座第13页拉制方法：两步拉制法。第一步：使玻璃软化，并拉开一个距离，形成一个细管，即拉制电极颈部；第二步：使用较低热度，拉断细管部，成为两个基本相同玻璃微电极，此步控制电极尖端。普通拉制出玻璃微电极尖端直径为15m。膜片钳技术及应用专家讲座第14页涂胶和抛光对玻璃微电极进行涂胶和抛光。涂胶（疏水性涂料，如硅酮树脂）主要是为了减小电极跨壁电容。膜片钳技术及应用专家讲座第15页抛光仪抛光是指将玻璃微电极靠近加热铂丝，从而使电极尖端变光滑过程。抛光主要目标是。预防电极尖端刺破细胞，利于高阻封接。膜片钳技术及应用专家讲座第16页电极液充灌 对于尖端较细玻璃微电极，膜片钳试验中惯用方法是：在微电极尾部施加负压使尖端充灌电极内液，然后用注射器在微电极尾部充灌电极内液，最终轻弹微电极杆步使其内气泡排出。充灌长度为电极1/3。膜片钳技术及应用专家讲座第17页制备细胞标本 从理论上来讲，膜片钳试验用细胞标本可来自体内各种组织细胞，只要细胞表面光滑，能与微电极尖端形成高阻封接即可。但在标本制备上，不一样组织细胞间联接牢靠程度不一样，采取分离方法也不完全相同。大致上包含冲洗、酶解消化或机械分离以及清洗等步骤。膜片钳技术及应用专家讲座第18页建立高阻封接 在显微镜下找到微电极，移动三维操纵仪，使电极尖端接触细胞，形成高阻封接。膜片钳技术及应用专家讲座第19页建立高阻封接 高阻封接形成是进行膜片钳试验关键一步。微电极尖端与细胞膜形成封接过程，能够采取软件发出1mV脉冲电压作用于微电极，造成膜两侧电位差发生改变，产生电极电流，再经过显示器，观察电极电流幅度改变来确定封接程度。在电极未入溶液之前，在显示器上可见一直线。膜片钳技术及应用专家讲座第20页高阻封接形成电流图膜片钳技术及应用专家讲座第21页膜片钳技术四种基本统计模式细胞吸附膜片(cell-attachedpatch)将两次拉制后经加热抛光微管电极置于清洁细胞膜表面上，形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，既而经过微管电极对膜片进行电压钳制，高分辨测量膜电流，称为细胞贴附膜片。因为不破坏细胞完整性，膜片钳技术及应用专家讲座第22页全细胞统计法(Whole-cellrecording)在高阻抗封接做好后，再给一个很小负压，将电极覆盖膜吸破，使电极内与整个细胞内相通，用这个方法可统计进出整个细胞电流。膜片钳技术及应用专家讲座第23页内面向外膜片(inside-outpatch)高阻封接形成后，在将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中就得到“内面向外”膜片。膜片钳技术及应用专家讲座第24页外面向外膜片（Outside-outpatch）在全胞统计式基础上，拉开电极使之与胞体脱离，这是附在电极尖端膜片又可自动地将电极尖端口封住。此膜片外侧面向外其是在全细胞统计基础上改进而成。膜片钳技术及应用专家讲座第25页膜片钳技术应用年，第二军医大学基础部生物物理研究所研究人员采取膜片钳和激光扫描共聚焦显微镜，同时实时系统观察心肌细胞钙离子释放。膜片钳技术及应用专家讲座第26页基本原理 膜片钳能取得膜上钙离子通道离子电流，但不能对离子移动进行实时定位，不能定量分析离子浓度。激光扫描共聚焦显微镜能够对钙离子移动进行实时定位,但无法对单个离子通道离子移动信号(如单通道电流)进行分析。膜片钳技术及应用专家讲座第27页大鼠心室肌细胞 L2型钙通道电流(ICa,L)膜片钳技术及应用专家讲座第28页 采取膜片钳-激光扫描共聚焦显微镜同时实时控制系统可同时统计心肌细胞 L2型钙离子电流信号及胞浆内 Ca2+浓度改变，这么才能处理显微形态与功效分析同时实时分析问题，有利于深入了解膜上钙离子通道内部机制。膜片钳技术及应用专家讲座第29页膜片钳技术及应用专家讲座第30页