草鱼miR-218鉴定及其对鱼淋巴囊肿病毒中国株感染的调控作用.pdf
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1、广东海洋大学学报Journal of Guangdong Ocean University第 43 卷第 4 期2023 年 7 月Vol.43 No.4Jul.2023黄鉴涛,胡海浩,马嘉霖,等.草鱼miR-218鉴定及其对鱼淋巴囊肿病毒中国株感染的调控作用J.广东海洋大学学报,2023,43(4):52-61.收稿日期:2023-03-28基金项目:广东省科技特派员专项(GDKTP2021029800);国家自然科学基金(31602199)第一作者:黄鉴涛(1998),男,硕士生,主要从事水生动物病害防控。E-mail:通信作者:闫秀英(1978),女,副教授,主要从事水生动物病害防控。E
2、-mail:草鱼miR-218鉴定及其对鱼淋巴囊肿病毒中国株感染的调控作用黄鉴涛,胡海浩,马嘉霖,战盈瑾,闫秀英,简纪常(广东海洋大学水产学院/广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室/水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室,广东 湛江 524088)摘要:【目的】鉴定草鱼(Ctenopharyngodon idella)miR-218(cid-miR-218)家族成员,分析cid-miR-218在鱼淋巴囊肿病毒中国株(LCDV-cn)感染草鱼卵巢细胞系(Grass carp ovary cells,GCO)过程中的表达特性,探索cid-miR-218-5p对LCDV-cn感染的调控作用
3、。【方法】从LCDV-cn感染的GCO细胞中,通过茎环RT-PCR获取cid-miR-218家族成员,并进行测序验证和生物信息学分析;用定量PCR分析cid-miR-218家族在LCDV-cn感染GCO过程中的表达;用生物信息学方法预测cid-miR-218家族的靶基因,并利用双荧光素酶报告基因系统验证cid-miR-218-5p的靶基因;通过转染cid-miR-218-5p mimic和cid-miR-218-5p inhibitor上调和下调cid-miR-218-5p的表达,用定量PCR分析cid-miR-218-5p、靶基因il-10和LCDV-cn mcp基因的表达情况;应用GO和K
4、EGG数据库,对cid-miR-218家族可能参与调控的信号通路进行富集分析。【结果】在LCDV-cn感染GCO过程中,鉴定到cid-miR-218-5p、cid-miR-218a、cid-miR-218b、cid-miR-218b-1和cid-miR-218b-2等5个cid-miR-218家族成员,其中cid-miR-218-5p的表达呈先升后降再上升的变化趋势,且差异表达最显著(P 0.05);经生物信息学分析预测,cid-miR-218家族成员有较多共同的潜在靶基因,il-10是共有的靶基因。经验证,pmirGLO-il-10重组质粒与家族成员代表cid-miR-218-5p结合后,其
5、荧光素酶活性降低(P 0.05),证明 il-10 是 cid-miR-218-5p 的靶基因。cid-miR-218-5p 过表达后,il-10 与LCDV-cn mcp表达均显著下降(P 0.05),而抑制 cid-miR-218-5p表达后,il-10与 LCDV-cn mcp表达则显著上升(P 0.05)。预测表明cid-miR-218家族参与调控病毒感染致瘤相关信号通路。【结论】在LCDV-cn感染GCO过程中,cid-miR-218家族中 cid-miR-218-5p起重要调控作用;cid-miR-218-5p负调控其靶基因 il-10的表达,并负调控LCDV-cn mcp基因的表
6、达;cid-miR-218-5p和IL-10对鱼淋巴囊肿病诊断和防控有潜在的临床应用价值。关键词:草鱼卵巢细胞系;cid-miR-218家族;鱼淋巴囊肿病毒中国株;靶基因;白介素10中图分类号:S943.112;Q78文献标志码:A文章编号:1673-9159(2023)04-0052-10doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2023.04.007Identification of Ctenopharyngodon idella miR-218 Family and ItsRegulation in Infection of Lymphocystis Disease Vi
7、rus ChinaHUANG Jian-tao,HU Hai-hao,MA Jia-lin,ZHAN Ying-jin,YAN Xiu-ying,JIAN Ji-chang(Fisheries College of Guangdong Ocean University/Guangdong Provincial Key Laboratory ofAquatic Animal Disease Control and Healthy Culture/Key Laboratory of Control for Diseases ofAquatic Economic Animals of Guangdo
8、ng Higher Education Institutes,Zhanjiang 524088,China)第4期黄鉴涛等:草鱼miR-218鉴定及其对鱼淋巴囊肿病毒中国株感染的调控作用Abstract:【Objective】To identify the members of the Ctenopharyngodon idella miR-218(cid-miR-218)family,and analyze their expression characteristics,and explore the regulation of cid-miR-218-5pin grass carp ov
9、ary cells(GCO)challenged with lymphocystis disease virus China(LCDV-cn).【Method】By the method of stem-loop RT-PCR,the members of the cid-miR-218 family wereobtained from GCO cells challenged with LCDV-cn,and were performed by sequencing andbioinformatics analysis.Real-time quantitative PCR(qRT-PCR)w
10、as used to acquire the expression ofthe cid-miR-218 family in GCO cells challenged with LCDV-cn.Bioinformatics methods were used topredict the target genes of the cid-miR-218 family,and dual luciferase reporter gene system was used toverify the target gene of cid-miR-218-5p.Cid-miR-218-5p mimic and
11、cid-miR-218-5p inhibitor weretransfected into GCO cells to up-regulate and down-regulate the expression of cid-miR-218-5p.qRT-PCR was used to detect the expression of cid-miR-218-5p,the target gene il-10 and the LCDV-cn mcpgene.GO and KEGG databases were used to enrich the signal pathways that the c
12、id-miR-218 familymight be involved in regulation.【Result】In GCO cells challenged with LCDV-cn,five members ofthe cid-miR-218 family were identified,i.e.cid-miR-218-5p,cid-miR-218a,cid-miR-218b,cid-miR218b-1 and cid-miR-218b-2.The expression of cid-miR-218-5p increased firstly,then decreasedand incre
13、ased,and the difference was significant(P 0.05).Various bioinformatics analysis predictedthat the cid-miR-218 family had many potentially common target genes,and il-10 was a common targetgene.Results of dual luciferase reporter gene experiment showed that the luciferase activity decreased(P 0.05)aft
14、er targeting of the family member representative cid-miR-218-5p with the PmirGLO-il-10recombinant plasmid,which indicated that il-10 was the target gene of cid-miR-218-5p.After up-regulation of cid-miR-218-5p,the expression of its target gene il-10 and the LCDV-cn mcp gene weredecreased significantl
15、y(P 0.05).After down-regulation of cid-miR-218-5p,the expression of itstarget gene il-10 and the LCDV-cn mcp gene was significantly increased(P 0.05).Moreover,it waspredicted that the cid-miR-218 family was involved in regulation of tumorigenesis signaling pathwaysof viral infection.【Conclusion】In G
16、CO cells challenged with LCDV-cn,cid-miR-218-5p of the cid-miR-218 family played important regulatory roles.Cid-miR-218-5p negatively regulated the expressionof its target gene il-10,and negatively regulated the expression of the LCDV-cn mcp gene,too.Thisstudy indicated that cid-miR-218-5p and IL-10
17、 have potentially clinical application value in thediagnosis,prevention and control of lymphocystis disease.Key words:Grass carp ovary cells;cid-miR-218 family;lymphocystis disease virus China;target gene;interleukin 10微小RNA(miRNA)可调节细胞周期、细胞迁移和血管生成等相关基因的表达,进而调控肿瘤发生发展1,其中,miR-218在动物肿瘤疾病中一般具有潜在抑瘤作用,可抑
18、制肿瘤的发展、转移和扩散2-3,但其在不同肿瘤疾病中的调控机制不尽相同4-5。miR-218还与肿瘤治疗预后有关,已成为多种肿瘤治疗和预后的靶标位点6。在病毒感染致病过程中,miR-218 起着调控作用。如,在猪繁殖与呼吸综 合 征 病 毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus,PRRSV)感染过程中,miR-218-5p可抑制 PRRSV的复制7;miR-218通过抑制干扰素的产生促进水泡性口炎病毒的免疫逃避8;在高危人类乳突病毒(Human papillomavirus,HPV)感染中,miR-218的表达降低,miR-218
19、与高危HPV感染和女性宫颈上皮内瘤变有关9;miR-218介导调控卡波氏肉瘤病毒(Kaposis sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)编码的病毒干扰素调节因子,从而诱导内皮细胞迁移侵袭、调控致瘤效应10。鱼淋巴囊肿病是一种皮肤瘤,病鱼皮肤、鳍等多处长有囊肿,由淋巴囊肿病毒(Lymphocystis diseasevirus,LCDV)感染导致11,LCDV可感染140多种鱼类11。牙鲆(Paralichthys olivaceus)淋巴囊肿病病原53第43卷广东海洋大学学报是鱼淋巴囊肿病毒中国株(LCDV-cn)11,LCDV-cn的致病机制和鱼类淋巴囊肿病
20、的防治有待深入研究,从 miRNA 层面解析 LCDV 的致病机制将为鱼类淋巴囊肿病防控提供新的思路。miR-218在不同物种间有明显的保守性,在人(Homo sapiens)、鼠(Rattus norvegicus)、牛(Bos taurus)、泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)等动物中,miR-218序列一致度较高12-13。目前,对LCDV-cn感染草鱼(Ctenopharyngodonidella)卵巢细胞系(Grass carp ovary cells,GCO)的生物学特性已有研究14,本研究制备LCDV-cn感染GCO的样品,鉴定LCDV-cn感染GCO过程
21、中编码的草鱼miR-218(Ctenopharyngodon idella miR-218,cid-miR-218)家族成员,分析cid-miR-218家族在LCDV-cn 感染 GCO 过程中的表达特性,探索 cid-miR-218-5p对LCDV-cn感染GCO的调控作用,为在miRNA层面阐明LCDV-cn的致病机制奠定基础。1 材料与方法1.1 材料和试剂从患淋巴囊肿病的牙鲆囊肿中分离LCDV-cn,保存于广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室14;GCO细胞购自深圳检验检疫局;pmirGLO双荧光素酶报告基因载体购于武汉淼灵生物科技有限公司;pMD-18T载体和大肠埃希菌Esch
22、erichia coliDH5购自宝日医生物技术有限公司(Takara)。所用引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。主要试剂包括胎牛血清(FBS,Gibco)、MEM培养基(Gibco)、HERPS(Gibco)、PrimeScriptTMRTreagentKit with gDNA Eraser 反转录试剂盒(Takara)、TBGreenPremix Ex Taq II定量试剂盒(Takara)、共转染试剂盒Lipofectamine RNAiMAX(Thermofisher-Scientific公司)、Dual-Lumi II双荧光素酶报告基因检测试剂盒(碧云天生物技术有限
23、公司)。1.2 GCO细胞培养和LCDV-cn感染GCO 细胞培养、LCDV-cn 感染 GCO 细胞具体操作以及所产生的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)参见文献14。1.3 cid-miR-218家族成员的鉴定待 LCDV-cn 感染 GCO 至 72 h 时,取已感染的GCO细胞1106个,室温下以800 r/min离心5 min,取细胞沉淀,加入 1 mL Trizol,按照 TRIzol LS 试剂盒说明书提取细胞总RNA,用琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取结果。用所提取的合格RNA和茎环反转录引物(表 1),依据 PrimeScript RT reagent K
24、itwith gDNA Eraser反转录试剂盒说明书,进行茎环特异性反转录,制备茎环RT-PCR特异性反转录模板cDNA,保存于-80 备用。用上述制备的茎环反转录 cDNA 及表 1 中的相应茎环 RT-PCR 引物,进行茎环 RT-PCR 扩增cid-miR-218 家族成员。茎环 RT-PCR 扩增体系为50 L,包含 EX-Taq 25 L,100 g/mL cDNA 3 L,10 mol/L 上下游引物各 2 L,ddH2O 18 L。PCR条件为95 30 s、60 30 s、72 60 s,35个循环。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。茎环 RT-PCR 扩增获得 cid-miR-
25、218 家族成员长度约 60 bp 的目的片段,包括上游序列 4 bp(5-GCGC-3)、cid-miR-218 家族成员序列、茎环序列33 bp(5-GTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATCGAC-3)。将cid-miR-218家族成员分别插入pMD18-T 载体,转化至 E.coli DH5,于 37 下培养。挑选阳性菌落14,送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。1.4 cid-miR-218家族成员的表达定量分析依据 LCDV-cn 感染 GCO 细胞的 CPE 特点14,收集 LCDV-cn感染 GCO 细胞后 0、4、8、16、24、48、72、144
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