草地早熟禾蛋白激酶CIPK32基因克隆及非生物胁迫响应分析.pdf
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1、华北农学报():收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目()黑龙江省自然科学基金项目()黑龙江省普通高等学校青年创新人才培养计划项目()齐齐哈尔大学教育科学研究项目()作者简介:陈 阳()女黑龙江齐齐哈尔人副教授博士主要从事草坪草逆境研究通信作者:金一锋()男黑龙江鹤岗人副教授在读博士主要从事草坪草逆境分子生物学研究草地早熟禾蛋白激酶 基因克隆及非生物胁迫响应分析陈 阳王 琦高岩松尤 学熊 毅金一锋(.齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院黑龙江 齐齐哈尔.抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室黑龙江 齐齐哈尔)摘要:为深入研究 基因家族在应对非生物胁迫应答等过程中的分子机制探究非生物胁
2、迫下草地早熟禾 基因的作用 以草地早熟禾午夜号为试验材料应用 技术克隆 基因分析该基因在不同组织部位及不同非生物胁迫条件下的表达规律 并通过、等在线软件对编码氨基酸序列进行蛋白结构、同源比对等生物信息学分析 结果表明:草地早熟禾 基因序列 为 共编码 个氨基酸 预测 蛋白相对分子质量为.等电点.蛋白质分子式为 属于不稳定亲水性蛋白 草地早熟禾 含有典型 和 结构域与山羊草(.)、黑麦草(.)、大麦(.)编码氨基酸同源性较高并含有酰胺化位置、糖基化位点、肉豆蔻酰化位点等多个结合位点 草地早熟禾 基因的表达水平呈现组织特异性叶部 茎部 根部 干旱胁迫下该基因呈现先上调后下降的趋势 处理 为最高值是
3、 的.倍随着 浓度的升高显著促进该基因的表达/是 /的.倍低浓度 及低浓度(./)环境均可促进 基因的表达 综上所述草地早熟禾 基因具有组织特异性干旱、盐、氮素和磷素胁迫均能诱导 基因的表达 基因家族在非生物胁迫中具有潜在的作用关键词:草地早熟禾蛋白激酶基因克隆表达分析中图分类号:文献标识码:文章编号:():./.(.):.(.)华 北 农 学 报 卷(.)(.)././.(./).:.蛋白激酶()具有添加磷酸基调节靶蛋白的活性定位、蛋白蛋白相互作用等特性其在植物对逆境胁迫中发挥重要作用 蔗糖非发酵()蛋白激酶()属于丝氨酸/苏氨酸蛋白 激 酶 类 包 含 个 家 族:、和该蛋白的磷酸化途径在
4、被激活的条件下调节下游基因表达从而调节不同的应激反应和生理过程 其中植物 激酶亚家族中的结构包含 端激酶区和 端调控区可与钙传感器钙调神经磷酸酶 样蛋白()相互作用形成一个复杂的网络介导钙信号和一系列复杂的环境刺激 所以 又被称为()研究发现 家族基因参与多种应对非生物胁迫(环境胁迫、营养缺乏和植物激素)、信号传导以及植物生长发育相关的过程 等研究发现水稻(.)和 等多个 成员在干旱处理中转录上调 过表达水稻、和 可增强幼苗期的耐寒性、耐旱性和耐盐性 过表达玉米(.)提高了植株的耐旱性 大麦(.)会通过维持/稳态来调节耐盐性 等研究发现 在低氮胁迫下的硝酸盐低亲和力反应中起着积极调节作用 油菜
5、(.)可参与植物对低磷胁迫的反应在低磷条件下油菜 的表达上调过表达 的拟南芥()表现出比野生型更多的生物量积累 研究发现拟南芥 的过度表达增加了发芽种子对 抑制作用的敏感性 和 也与低 应激有关 和 的过表达表现出类似的低敏感性表型 综上可见 基因家族对生物应对非生物胁迫有重要作用草地早熟禾(.)属于禾本科多年生草本具有质地纤细、观赏性良好、成坪速度较快、抗寒性强等优良性状可用于绿地、公园以及园林绿化中 但是在面对非生物胁迫时经常会造成植株出苗难、生长慢、绿期短、秋季早衰甚至死亡等现象的发生 因此在草坪草应用领域中应注重提高草地早熟禾抗逆境胁迫能力对草地早熟禾抗逆境胁迫基因的研究也至关重要 本
6、研究拟克隆获得草地早熟禾 基因并进行生物信息学分析利用实时荧光定量 检测 基因不同组织及干旱、盐、氮素和磷素胁迫下的表达模式 本研究结果不仅有助于理解 基因的结构特征也为进一步探索 基因在逆境胁迫应答等过程中的作用机制提供了基础 材料和方法.试验材料及处理方法草地早熟禾午夜 号为供试材料将种子均匀的播撒在营养土内放置于光照培养箱中等待萌发培养条件为:白天/夜晚温度 /相对湿度 光/暗为/光照强度/()培育个月后进行非生物胁迫处理选择生长健康、长势一致的草地早熟禾植株将根部清洗干净转移至/水培液中进行预培养培养 后进行不同胁迫处理 处理方式为:对/水培液中生长 的草地早熟禾植株分别进行 模拟干旱
7、处理、盐处理(/)、氮处理(./)、磷处理(./)配置 种不同浓度的、溶液分别作为氮源、磷源 每 个处理作为一个生物学重复处理 后取样取根、茎、叶后迅速置于液氮中保存.基因克隆利用.软件设计 基因克隆 期陈 阳等:草地早熟禾蛋白激酶 基因克隆及非生物胁迫响应分析 引物上游引物:下游引物:以草地早熟禾叶片提取的 反转录获得的 为模板通过 得到 基因的序列 反应总体系为 在 中加入.的 /.对 产物进行琼脂糖凝胶电泳处理找出相应的基因产物然后将 产物的测序送往上海生工来完成.基因生物信息学分析通过、.、等在线软件对编码氨基酸序列进行蛋白结构、蛋白保守结构功能域、跨膜区域、信号肽、磷酸化位点、亚细胞
8、定位进行预测分析应用 .软件构建进化树采用 对 编码氨基酸进行同源比对等.草地早熟禾 基因对不同组织及不同逆境响应分析根据试剂盒提取生长期为 个月的草地早熟禾植株根、茎、叶 个部位的 之后用于 测定草地早熟禾 基因在不同组织部位的相对表达量 提取经过、胁迫样本的叶 部 用 于 测 定 草 地 早 熟 禾 基因在逆境响应过程中的相对表达量 采用相对定量分析 为内参基因利用 试剂盒总体系为 程序为:预变性 个循环 结果与分析.草地早熟禾 基因的克隆采用设计的特异性引物/(表)和草地早熟禾 为模板利用 技术进行扩增获得 的目的条带(图)测序结果显示 基因序列含有的 为 共编码 个氨基酸与预测结果一致
9、表 基因克隆及荧光定量所需引物.引物名称 序列()()长度/.图 基因 扩增产物.生物信息学分析用 对 蛋白进行理化性质分析结果显示 相对分子质量.等电点为.蛋白质分子式为 为不稳定蛋白 在 蛋白中亮氨酸()成分含量最高为.氨基酸残基中具有正/负电荷的残基 、分别为 个平均亲水系数为.为亲水性蛋白(表)亚细胞定位预测显示 蛋白定位于细胞质中 利用 对磷酸化位点进行预测分析结果表明草地早熟禾 氨基酸磷酸化位点包含:丝氨酸 个苏氨酸 个酪氨酸 个(图)表 草地早熟禾 编码氨基酸组成.氨基酸 比例氨基酸 比例氨基酸 比例氨基酸 比例丙氨酸().谷氨酰胺().亮氨酸().丝氨酸().精氨酸().谷氨酸
10、().赖氨酸().苏氨酸().天冬酰胺 ().甘氨酸().甲硫氨酸().色氨酸().天冬氨酸().组氨酸().苯丙氨酸().酪氨酸().半胱氨酸().异亮氨酸().脯氨酸().缬氨酸().在线分析分析结果表明 蛋白包含典型的结构域 和(图)用 .对多物种 编码氨基酸进行进化树分析发现草地早熟禾 编码氨基酸与山羊草()(.)、黑麦草()(.)、大 华 北 农 学 报 卷图 草地早熟禾 蛋白的磷酸化位点.麦(.)编码氨基酸同源性较高分别为.(图)通过将草地早熟禾 保守序列区域分析 设定为 个保守的基序可以看出草地早熟禾与大麦、黑麦草、小麦(.)等禾本科植物 蛋白结构域非常相似 将草地早熟 禾 与
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