白藜芦醇对热应激诱导肉鸡脾脏淋巴细胞增殖及凋亡的作用研究.pdf
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1、动物营养学报,():白藜芦醇对热应激诱导肉鸡脾脏淋巴细胞增殖及凋亡的作用研究刘峰成 孟田田 郅可欣 龚番文 李泽政 陈乐乐 贺建华(湖南农业大学动物科学技术学院,长沙)摘 要:本试验旨在研究白藜芦醇对热应激诱导肉鸡脾脏淋巴细胞增殖及凋亡的作用。本试验通过分离和消化白羽肉鸡脾脏组织,成功培养出原代淋巴细胞,并能稳定传代。通过构建正常细胞模型()和热应激细胞模型(培养 ),培养鸡脾脏淋巴细胞,并分别添加不同剂量的白藜芦醇(、)。运用 法测定热应激对脾脏淋巴细胞存活率的影响;取脾脏淋巴细胞上清液,用乳酸脱氢酶()法测量 活性;采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记()染色法检测脾脏细胞凋亡水
2、平;采用酶联免疫吸附试验()试剂盒检测凋亡蛋白的含量;提取总,用实时荧光定量 法测量热休克蛋白()基因相对表达量的变化;提取总蛋白,用 法检测、肿瘤抑制因子()、凋亡激活因子()、肿瘤抑制因子()、核因子 抑制蛋白()、肿瘤抑制因子()蛋白表达量。结果表明:热应激处理导致淋巴细胞增殖显著下降(),活性显著增加()。用、白藜芦醇处理脾脏淋巴细胞并热应激培养时,细胞增殖呈剂量依赖性增加(),活性显著下降()。热应激会造成淋巴细胞凋亡和损伤,添加白藜芦醇后显著降低了细胞凋亡率()。热应激导致淋巴细胞的 含量和 蛋白表达量显著增加(),淋巴细胞瘤()含量显著降低(),相关 蛋白()含量显著增加()。热
3、应激时添加或正常条件下添加白藜芦醇会使 含量显著增加(),含量显著降低(),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶()含量显著降低(),的蛋白表达量显著降低()。热应激时添加白藜芦醇对 蛋白表达量没有显著影响()。综上所述,白藜芦醇可以剂量依赖性增加细胞增殖、减轻细胞凋亡等,从而减轻热应激导致的脾脏淋巴细胞的损伤。关键词:白藜芦醇;热应激;脾脏淋巴细胞;增殖;凋亡中图分类号:文献标识码:文章编号:()收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目()作者简介:刘峰成(),男,湖南怀化人,硕士研究生,从事单胃动物营养研究。:通信作者:贺建华,教授,博士生导师,:家禽因其无汗腺、全身覆被羽毛等特点,主要依赖呼吸来散热。
4、在家禽生产中,长期的生产性能选育计划及集群饲养导致家禽产生更高的代谢热,也提高了机体本身对热应激的敏感性。热应激来源于机体热能循环不平衡,即体内热能产生大于机体流向环境的能值。热应激严重影响家禽的生产性能,造成神经内分泌代谢紊乱,甚至造成应激不耐受死亡。在这种情况下,体温、呼吸频率和心跳速度的升高均会影响动物的采食量和生产效率,造成产业经济损失。热应激会导致免疫器官损伤并且萎缩,从而抑制肉鸡的免疫功能,影响机体的生长发育。研究表明,热应激肉鸡 期刘峰成等:白藜芦醇对热应激诱导肉鸡脾脏淋巴细胞增殖及凋亡的作用研究在体液反应期间循环抗体水平较低,免疫球蛋白()水平下降。此外,热应激会增加肉鸡黏膜通
5、透性,损伤黏膜屏障,进而导致嗜异细胞浸润和淋巴细胞数量减少,给机体造成损伤。嗜异细胞与淋巴细胞的比值()被认为是家禽应激的可靠指标,多项研究表明,热应激导致 显著升高,原因是淋巴细胞数量减少,嗜异细胞数量增多。本课题组前期研究表明,热应激诱导乌骨鸡肠道氧化损伤,抑制热休克蛋白()和核因子()的过表达,降低热应激肠道炎症,热应 激 导 致 肠 道 淋 巴 细 胞 和 杯 状 细 胞 数 量降低。白藜芦醇化学名,三羟基,二苯乙烯,是天然的多酚类植物提取物,广泛存在于花生、虎杖、葡萄等植物中。已有大量研究报道,白藜芦醇具有抗氧化、抗衰老、抗炎症等作用。白藜芦醇作为一种优良高效植物提取物,可以作为解毒
6、剂缓解热应激导致的负面影响。等研究表明,饲粮中添加白藜芦醇可通过恢复受损的绒毛隐窝结构,改变肠道、分泌型免疫球蛋白 和紧密连接相关基因的 表达,抑制促炎因子分泌,部分减轻了热应激对肠道屏障功能的不利影响。等报道,肉鸡饲粮中添加白藜芦醇可以通过重建氧化还原状态和抑制细胞凋亡,部分扭转热应激对免疫器官生长的不利影响。重要的是,白藜芦醇可以通过抑制肉鸡脾脏中模式识别受体()信号的激活,缓解热应激引起的先天免疫和炎症反应。脾脏是家禽最大的外周免疫器官,是机体免疫应答发生的重要器官。在热应激条件下,白藜芦醇可以缓解脾脏损伤,然而关于其相关机制鲜有报道。为深入探讨白藜芦醇缓解热应激的作用机制,本试验利用肉
7、鸡脾脏淋巴细胞在细胞水平验证其对脾脏淋巴细胞增殖及凋亡的影响。材料与方法 试验材料 试验动物:日龄健康的白羽肉鸡。试验药剂:白藜芦醇(纯度)由国家植物成分利用工程技术研究中心提供;二甲基亚砜()购自 公司(美国);青霉素、链霉素、磷酸盐缓冲溶液()购自 公司(美国);植物血凝素()、鸡脾脏淋巴细胞分离试剂盒购自索莱宝公司;培养基、胎牛血清()、胰 蛋 白 酶 购 自 公 司(美 国);试剂盒、试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(中国);细胞毒性检测试剂盒乳酸脱氢酶()法购自 公司(中国);原位细胞死亡检测试剂盒购自(中国);反转录试剂盒购自 公司(日本);鸡专用酶联免疫吸附试验()试剂盒购自
8、 科技有限公司(中国)。试验设计 采用生长良好的脾脏淋巴细胞用于试验。调整细胞数量为 个,分为以下几组:对照组(组),细胞置于基础培养基 培养;白藜芦醇组(组),基础培养基 白藜芦醇 培 养;白藜芦醇组(组),基础培养基 白藜芦醇 培养;白藜芦醇组(组),基础培养基 白藜芦醇 培养;热应激组(组),基础培养,然后细胞置于 培养 ;热应激 白藜芦醇组(组),白藜芦醇预处理 ,然后置于 培养 ;热应激 白 藜 芦 醇 组(组),白藜芦醇预处理 ,然后置于 培养 ;热应激 白藜芦醇组(组),白藜芦醇预处理 ,然后置于 培养 ,热应激 处理组(组,);组:细胞不加。试验处理 鸡脾脏淋巴细胞的分离、培养
9、包括以下步骤:)静脉放血宰杀,用 乙醇浸泡 ,无菌取出脾脏(将鸡固定用 乙醇喷洒腹部进行消毒,分批剪开外皮、内皮,取出脾脏),用灭菌生理盐水冲洗 次,放入冷的(青链霉素混合液)中。)用含双抗的 清洗新鲜脾脏 遍后,去除表面筋膜,转入新培养皿中。放入 中剪碎,清洗 次,置于细胞过滤器内过滤,收集细胞悬液并加入有淋巴细胞分离液的离心管中(按照鸡脾脏淋巴细胞分离试剂盒说明书分离细胞悬液)。)离心 。)吸取中间白色云雾状淋巴细胞层,加入红动 物 营 养 学 报 卷细胞裂解液碎解红细胞。)用 洗涤上清液至澄清。)离心(重复 次)回收细胞。)用培养液(胎牛血清双抗 )重悬成细胞液,并加入 ,用计数板在倒置
10、显微镜下计数,调节浓度为个,接种于 孔培养板中,每孔加入,放入培养箱中。淋巴细胞的鉴定可用 染色法和非特异性酯酶染色法鉴定。细胞呈球形,核圆,胞质很少。非热处理:非热应激组用含不同浓度(、)的白藜芦醇处理,置于 二氧化碳()的细胞培养箱中培养 。热处理:热应激组用含不同浓度(、)的白藜芦醇处理,首先在 的细胞培养箱中培养 ,然后转入 的细胞培养箱中热处理 。法细胞增殖试验 根据制造商的说明书,使用 检测试剂盒测定脾脏淋巴细胞上清液中的吸光度()值,每组 个重复。细胞存活率计算公式如下:细胞存活率()(试验组空白组)(对照组空白组)。活性检测 根据制造商的说明书,使用细胞毒性检测试剂盒(法)测定
11、脾脏淋巴细胞上清液中的 活性,每组 个重复。脾脏淋巴细胞凋亡水平 采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记()染色法检测脾脏细胞的凋亡水平。固定后的脾脏样本经过包埋和切片处理后,通过终端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记,用原位细胞死亡检测试剂盒在单细胞水平上检测 断裂。脾脏淋巴细胞凋亡蛋白含量检测 )向 孔培养板加入不同浓度的药物以及 的,每组 个重复。)用培养液(双抗)将细胞浓度(活细胞)调整为 个,每孔 接 种 于 孔 培 养 板 中,每 孔 为 体系。接种完后轻轻平晃培养板。)将培养板放入 的培养箱中 培养 。)用移液枪将培养液吸出至 离心管中,经 离心 ,取细胞上清液,于 保存
12、备用。)细胞上清液凋亡蛋白含量测定。根据制造商的说明书,使用市面上的鸡专用 试剂盒测定脾脏淋巴细胞上清液中 淋巴细胞瘤 ()、肿瘤抑制因子()、相关 蛋白()及 半 胱 氨 酸 天 冬 氨 酸 蛋 白 酶()的含量。基因表达量检测 应用 法提取脾脏淋巴细胞上清液总,使用实时荧光定量 法()检测基因相对表达量。使用 试剂盒从匀浆中分离出总。然后使用反转录试剂盒合成第一链。所有引物都是在 中使用鸡基因序列设计的,引物序列如表 所示。按照文献中的描述进行。使用 方法计算基因相对表达量,然后用甘油醛磷酸脱氢酶()作为看家基因进行归一化。表 引物序列 基因登录号 引物序列 ()产物大小 热休克蛋白:甘油
13、醛磷酸脱氢酶:总蛋白提取与 按照 试剂盒说明书进行细胞蛋白抽提和蛋白含量测定。蛋白含量调整为 ,进行 ,所使用的抗体如表 所示。期刘峰成等:白藜芦醇对热应激诱导肉鸡脾脏淋巴细胞增殖及凋亡的作用研究表 抗体信息 代号 一抗名称 公司物种稀释比 热休克蛋白 鼠 肿瘤抑制因子 鼠 凋亡激活因子 睿赢兔 肿瘤抑制因子 兔 核因子 抑制蛋白 兔 肿瘤抑制因子 兔 肌动蛋白 鼠 数据处理与统计分析 统计分析均使用 软件进行,数据以平均值标准误表示。分别使用 检验和 检验检查数据方差的正态性和同方差性。除 检测结果外,其他检测结果使用单因素方差分析和 氏法的多范围检验比较。检测后的结果使用一般线性模型的 进
14、行分析,该模型包括白藜芦醇和热应激 个主效应以及它们的交互作用。通过 检验和 氏法的多重比较检验分析非参数数据。为差异显著。结果与分析 白藜芦醇对热应激脾脏淋巴细胞增殖的影响 当细胞处于正常温度进行培养时,与 组相比,添加、白藜芦醇都会显著增加脾脏淋巴细胞存活率()。热应激会导致淋巴细胞存活率显著下降()。用、白藜芦醇处理脾脏淋巴细胞并且热应激培养时,细胞存活率呈剂量依赖性增加()。组和 组的细胞存活率与 组相比无显著差异()(图)。热应激和白藜芦醇对脾脏淋巴细胞 活性的影响 与 组相比,热应激导致淋巴细胞的 活性显著增加()。与 组相比,当脾脏淋巴细胞添加 或 白藜芦醇并且热应激培养时,活性
15、显著下降()。出乎意料的是,当细胞处于正常温度进行培养时,与组相比,添加或 白藜芦醇显著增加了脾脏淋巴细胞的 活性()。而与 和 组相比,添加 白藜芦醇则又显著降低 活性()(图)。:对 照 组;:白 藜 芦 醇 组;:白藜芦醇组;:白藜芦醇组;:热应激组;:热应激 白藜芦醇组;:热应激 白藜芦醇组;:热应激 白藜芦醇组;:热应激 组;:细胞不加 组。数据柱标注不同小写字母表示差异显著()。下图同。:;:;:;:;:;:;:;:;:;:()图 热应激和白藜芦醇对脾脏淋巴细胞增殖的影响 动 物 营 养 学 报 卷图 热应激和白藜芦醇对脾脏淋巴细胞 活性的影响 热应激和白藜芦醇对脾脏淋巴细胞凋亡的
16、影响 当细胞处于正常温度进行培养时,添加不同水平的白藜芦醇对脾脏淋巴细胞凋亡率无显著影响()。与 组相比,热应激会导致淋巴细胞凋亡率显著上升()。与 组相比,用 白藜芦醇处理脾脏淋巴细胞 后,细胞凋亡率显著下降()(图)。热应激和白藜芦醇对热应激脾脏淋巴细胞凋亡蛋白含量的影响 试验结果表明,与非热应激组相比,整体上可以看出热应激导致淋巴细胞的 蛋白含量显著增加()。与 组相比,热应激会导致 含量显著降低()。与 组相比,、和 组的 含量显著增加()。同时,与 组相比,组和 组的 含量显著升高()。与 组相比,热应激会导致 含量显著增加()。与 组相比,和 组的 含量显著降低()。与 组相比,、
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