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在肝细胞癌中的表达及与肿瘤免疫的相关性分析王锃涵，王云，王雪梅，朱威威，梁红霞（郑州大学第一附属医院 感染科，河南 郑州 ）基金项目：国家自然科学基金面上项目（）通信作者：梁红霞，：摘要：目的研究血磷脂酰胆碱酰基转移酶 （）在肝细胞癌（）中的表达水平、预后意义及潜在机制，重点探究 与免疫细胞和免疫检查点的关系。方法从肿瘤基因组图谱（）数据库获取 患者的临床信息及 表达水平，利用回归分析和生存分析等探索 与 患者的临床特征及预后的关系。通过功能富集分析进一步探索 在 中的潜在机制。应用肿瘤免疫浸润评估资源（）数据库分析 与免疫细胞浸润丰度和标志基因表达水平的相关性，应用 数据库分析 与 患者免疫检查点的遗传变异和表达水平的关系。通过细胞学实验验证 在 中的表达水平，并通过敲减 探究其对肝癌细胞恶性生物学行为的影响。结果在 中，的表达水平升高，与较高的 分期（）、组织学分级（）、分级（）、血清甲胎蛋白水平（）以及发生血管侵袭（）具有相关性，是 的独立风险因子和独立预后因子（）。可能参与糖酵解、药物代谢、通路和 通路等多种病理生理过程和信号通路。敲减 后肝癌细胞的体外增殖能力和迁移能力降低，差异有统计学意义（）。与 种免疫抑制性细胞的浸润丰度及标志物的表达水平呈正相关，与免疫检查点的遗传变异和表达水平也具有一定的相关性。结论 在 中高表达，可作为独立风险因子和预后因子，可能通过影响免疫细胞浸润和免疫检查点参与免疫抑制性肿瘤微环境的构建，进而参与 进展。关键词：肝细胞癌；血磷脂酰胆碱酰基转移酶 ；肿瘤基因组图谱；肿瘤免疫；生物信息学；分子标志物中图分类号：，（，）：（）（），（）（），（），（），（），（）（），（），（），：；原发性肝癌是全球第六大最常诊断的癌症和第三河南医学研究 年 月第 卷第 期 ，大癌症相关死因 ，年全球约有 万人被诊断为肝癌，万人死于肝癌 。肝细胞癌（，）是原发性肝癌最常见的病理类型，因其症状隐匿且进展迅速，约 的患者在确诊时已处于中晚期 。目前，以程序性死亡受体 （，）为代表的免疫治疗是中晚期 的主要治疗手段，也可作为 的辅助治疗和转化治疗手段 ，同时面临着客观应答率低、毒副作用高、适应性耐药等挑战 。研究表明，免疫治疗与肿瘤细胞异常的脂质代谢密切相关，后者可通过直接或间接调节免疫细胞的分化、凋亡以及细胞间相互作用等影响免疫治疗效果 。血磷脂酰胆碱酰基转移酶（，）作为脂质代谢过程中一种参与膜脂重塑的关键酶 ，已被证实在多种癌症中表达升高，且具有作为诊断和预后标志物的潜力 。在 中，被证实可通过激活 信号通路进而促进肝癌细胞的上皮间充质转化过程，以及通过抑制信号传导转录激活因子 进而促进肝癌细胞增殖等 。然而，目前关于 在 中与肿瘤免疫微环境的相互作用等尚未被阐明。本研究基于肿瘤基因组图谱（，）等数据库，联合 表达水平和患者的临床病理特征、预后信息等资料，探索 在 中的诊断意义、预后意义和潜在功能，通过细胞学实验探究 对 细胞恶性生物学行为的影响。同时，分析 与 中免疫细胞浸润水平和标志物表达水平的相关性，以及 与免疫检查点的遗传变异和表达水平的关系，以此探索 在肿瘤免疫中的潜在功能。材料与方法 表达情况分析从 （：）数据库下载包含 例 样本和 例正常样本的 数据集 ，对基因表达数据进行 对数转换，使用 包 分析 在肿瘤和正常样本中的差异表达。从人类蛋白质表达数据库（，：）中下载 在 肿 瘤 和 肝 脏 组 织 中 的 蛋 白 表 达情况 。预后意义分析利用基因表达谱在线分析平台（，）（：）和 数据库（：）对 表达水平与常见恶性肿瘤的预后信息进行 回归分析或 秩和检验，并绘制预后生存曲线 。通过绘制受试者工作特征（，）曲线分析 对于 预后情况的预测效能。与 患者临床病理特征的分析以 表达水平的中位数为标准将样本分为高表达组（例）和低表达组（例），利用检验分析 的表达与临床病理信息的相关性，不符合正态分布的变量运用 检验。随后进行单因素和多因素 回归分析，并通过 列线图对多因素 回归分析结果进行可视化。在 中的功能富集分析利用 秩相关性分析挑选与 表达水平具有显著相关性的 组基因，上传至 （，：）在线数据库进行功能富集分析，分析内容主要包括基因本体论（，）和京都基因和基因组百科全书（，）。同时从基因集富集分析（，）官网（：）下载 软件，对差异基因在信号通路或生理过程中的富集情况进行 。影响免疫细胞和免疫检查点的分析利用肿瘤免疫浸润评估资源（，）数据库（：）分析 与肿瘤微环境中免疫细胞浸润丰度的相关性 。应用 数据集（）（：）分析 中 与免疫检查点遗传变异的关系，包括扩增、缺失等 。应用相关性分析探索 与免疫细胞标志物及免疫检查点的表达水平的关系。细胞实验 细胞和主要试剂人类 细胞系和肝细胞系均购自中国细胞典藏中心。细胞培养基、胎牛血清等购自美国 公司，一抗购自英国 公司，蛋白定量试剂盒和 试剂盒购自上海碧云天公司，荧光定量 试剂盒购自瑞士 公司。和聚合酶链反应（，）引物分别由汉恒生物公司和生工生物公司构建。细胞培养和细胞转染 细胞系和 细胞系分别用含 （体积分数）胎牛血清的 或 培养基培育于 、的培养箱中。选取汇合度为 的 和 细胞系，按照说明书配制含有适量 和 的转染体系，等量加入细胞培养孔中，后更换为含血清 培养基。河南医学研究 年 月第 卷第 期 ，后检测 水平，后检测 蛋白质水平。实时荧光定量 应用 、氯仿等提取总 并测定浓度，依据操作说明配制反转录体系，依次于 反应 ，反应 ，反应 。随后依据操作说明配制 扩增体系。首先以 反应 ，后按照 ，的顺序反应 个循环，运用 法计算相对表达量。收集总蛋白后利用 法测定蛋白浓度并配制上样体系，变性后于 聚丙稀酰胺凝胶和 甘氨酸电泳液进行电泳，电泳条件为恒压 ，约 。随后，于 甘氨酸转膜液中构建转膜体系，转膜条件恒流 ，。于封闭液中进行 的室温封闭，清洗后分别孵育一抗和二抗（），随后进行蛋白显影和图像分析。实验按照说明书配制 工作液，选取对数生长期的细胞系加入 工作液孵育 ，随后进行固定和室温通透处理，并用 活性溶解体系和 反应液于室温下避光孵育 。用 溶液对细胞核进行染色。利用荧光显微镜对细胞增殖情况进行观测。划痕实验选取贴壁于六孔板的汇合度 的细胞，用 枪头对细胞进行垂直或水平划痕，每孔 道划痕。随后分别于 和 时用普通光学显微镜对划痕处进行观测和拍照，测量划痕的变化程度并进行后续分析。注意划痕后使用不含胎牛血清的培养基进行培养。统计学方法利用 、和 对相关数据进行整理、统计学分析和数据可视化。符合正态分布的计量资料用均数 标准差（珋 ）表示。利用 网站绘制 的表达水平与 患者预后的生存曲线并进行 检验。组间比较采用两独立样本 检验，组间相关性分析采用 秩相关性分析。双尾法 为差异有统计学意义。结果 在泛癌中的表达水平和预后分析本研究分析了 数据库中 种癌症组织和正常组织中 的表达水平。结果显示，有 种癌症组织表现出较高水平的 ，如 、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、肺鳞癌等，然而 在肾嫌色细胞癌、甲状腺癌和胸腺瘤中的表达水平低于癌旁组织（图 ）。基于 数据库的分析显示，与 、肺鳞癌、低级别胶质瘤的总生存期（，）和疾病特异性生存期（，）具有显著的相关性，的表达水平越高，患者的 和 越短（图 ）。为 在多种恶性肿瘤中显著高表达；为 在 、肺鳞癌和低级别胶质瘤患者中提示不良预后。图 数据库中泛癌和癌旁组织中 的表达水平及预后分析河南医学研究 年 月第 卷第 期 ，在 中高表达且提示不良预后根据 数据集和 数据库分析 在配对样本和非配对样本中的表达水平，结果均显示 在 中的表达水平高于癌旁组织（）（图 ）。对 与 临床病理特征的相关性进行统计分析，结果显示，与较高的 分 期（）、组 织 学 分 级（）、分级（）、血清甲胎蛋白水平（）以及发生血管侵袭（）具有显著相关性，见图 及表 （部分患者临床病理特征信息缺失）。通过 回归分析探索影响 预后的危险因素，单因素分析结果提示，较高的 分级（）、分期（）和 表达水平（）是影响 生存期的潜在危险因素，多因素回归分析提示高表达的 （）是影响 预后的独立因子（表）。基于回归分析结果的 列线图显示，高表达的 样本的单项总分更高，与之对应的、生存率更低，高表达的 可能是 患者潜在的预后预测指标（图 ）。生存曲线显示，高表达的 样本具有较低的 、和无进展生存期（，）（图 ）。依据 曲线分别利用 、和 评价 对 预后预测的效果，结果显示，曲线下面积（，）分别为 、和 ，具有较好的预测价值（图 ）。为 在 和癌旁样本中的表达水平；为 数据库中 在 和正常肝脏中的表达情况；为 与 样本的临床病理特征的关系；。图 在 和癌旁样本中的表达及与临床病理信息的关系表 与 临床病理特征的相关性 （）临床信息低表达的 （）高表达的 （）年龄 岁 （）（）（）（）性别男 （）（）女 （）（）分期 （）（）（）（）分级 （）（）（）（）组织学分级 （）（）（）（）甲胎蛋白（）（）（）（）（）有血管侵犯 （）（）注：为磷脂酰胆碱酰基转移酶 。河南医学研究 年 月第 卷第 期 ，表 临床病理特征与总生存率的相关性分析临床病理特征单因素分析 （）单因素分析 （）多因素分析 （）多因素分析 （）分级 （）（）（）（）病理分期 （）（）分期 （）（）（）（）甲胎蛋白 （）（）血管侵袭 （）（）（）（）（）（）注：为磷脂酰胆碱酰基转移酶 ；为总生存期；为疾病特异性生存期。为以 为预后指标的 预后预测模型；为以 为预后指标的 预后预测模型。图 基于 构建 预后预测模型、为基于 表达水平的生存曲线；、为基于 表达水平的 曲线模型。图 基于 表达水平的生存曲线和 曲线模型 的潜在功能分析利用相关性分析获取与 的表达水平相关性较强的基因共 个（，相关系数绝对值 ），以此进行 和 通路富集分析，结果显示，参与的生物过程主要包括中性粒细胞介导的免疫、有丝核分裂、微管细胞骨架组织等；参与的分子功能主要包括激活跨膜转运蛋白、铁离子结合、酰基转移酶活性等；相关的细胞组成主要为细胞 基质黏附结点、细胞微管、蛋白 脂质复合体等；通路富集分析结果提示，主要参与过氧化物酶体、糖酵解 糖异生等信号通路（图 ）。结果显示，在 中参与初始或效应河南医学研究 年 月第 卷第 期 ，细胞生成、辅助性 细胞 和 的上调、上皮 间充质转化等，以及 、等癌症相关信号通路（图 ）。图 样本中 的 和 功能分析 与免疫细胞浸润的关系首先利用 数据库分析 与 肿瘤微环境中免疫细胞浸润水平的相关性，结果显示，与 种免疫抑制性细胞的浸润丰度呈正相关，包括单核细胞（，）、型肿瘤相关巨噬细胞（，）（，）、肿瘤相关成纤维细胞（，）（，）、骨髓源性抑制细胞（，）（，）和调节性 细胞（，）（，）（图 ）。自 数据库（：）查询上述免疫细胞的细胞标志基因，相关性分析提示 与上述 种免疫抑制细胞亚群的标志基因在表达水平上呈正相关（图 ）。图 样本中 的 富集分析 为 与免疫细胞浸润程度的相关性分析；为 与 种免疫抑制性细胞的标志基因表达水平的相关性分析；。图 与 免疫细胞的相关性分析 与 中免疫检查点的关系为探索 可否作为预测抗肿瘤免疫治疗效果的潜在指标，分析 中 与免疫检查点的关系。首先利用 数据库绘制 与免疫检查点基因的共变异和互斥变异图谱，并采用 精确检验进行统计学分析，结果表明，与 、和 在同一 样本中存在共变异（），变异类型按照发生频率由高到低依次为扩增、深度缺失和错义突变，提示 与上述基因具有一定的共现性（图 ，表 ）。相关性分析结果显示，与免疫检查点在表达水平上具有一定的正相关性（图 ）。河南医学研究 年 月第 卷第 期 ，为 中 和免疫检查点基因的互斥性和共现性分析；为 与免疫检查点基因表达水平的相关性分析。图 与 中免疫检查点的遗传变异和基因表达的关系表 中 和免疫检查点的互斥性和共现性分析基因 基因 双阴单 单 双阳趋势相关性 共发生是 共发生是 共发生是 共发生是 共发生是 共发生否 互斥否 互斥否 互斥否 互斥否 互斥否 互斥否 互斥否 敲低 抑制 细胞系的增殖和迁移能力 结果显示，在 细胞系中的表达高于正常肝脏细胞（图 ）。随后应用 分别转染 和 两种细胞系，分别用 和 验证 的敲减效果，结果显示，组中的 水平降低，敲减有效（图 ）。实验结果显示，组在 内进行增殖的细胞比率低于对照组，敲低 可以抑制 细胞的增殖能力（图 ）；细胞划痕实验结果显示，组在划痕 之后划痕宽度缩短的距离短于对照组，敲低 可以抑制 细胞的迁移能力（图 ）。为 在肝脏细胞系和 细胞系中的表达情况；、为在蛋白质水平和 水平验证 的敲减效率；为敲低 对 细胞系增殖能力的影响；为敲低 对 细胞系迁移行为的影响；。图 敲低 抑制 细胞系的增殖和迁移能力河南医学研究 年 月第 卷第 期 ，讨论目前，关于 早期诊断和综合治疗的研究均取得了较大的突破和创新，部分中晚期患者有望在进行辅助性抗肿瘤药物治疗和局部治疗之后再进行外科切除，扩大了外科切除的治疗范围 。此外，围手术期可进行免疫检查点抑制剂或分子靶向药物的单药或联合治疗，有助于降低术后复发率 。然而，免疫治疗和分子靶向治疗仍面临着整体应答率低、毒副作用高、原发或继发性耐药等挑战 。迫切需要对 的发病和进展机制进行多学科联合研究，以获得理想的生物标志物和个体化治疗的靶点。在癌症进展过程中，异常活跃的脂质合成、吸收和相关酶的异常表达已被证实是一种适应性代谢重排现象，又叫做脂质代谢重编程 。是磷脂酰胆碱代谢的关键调节因子，催化溶血磷脂酰胆碱转化为磷脂酰胆碱，从而调节细胞膜的结构和流动性 。在多种癌症中的表达水平升高，如乳腺癌 、宫颈癌 和前列腺癌 等，可以促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和血管生成等恶性生物学行为。然而，目前关于 在 中的潜在机制，尤其是对免疫微环境和抗肿瘤免疫应答的影响尚未明确。本研究首先基于 数据库分析了 在泛癌中的表达谱以及与预后的相关性，发现 在包括 、前列腺癌等在内的多种癌症中的表达水平升高，且与一些肿瘤的预后相关，证明了 可能参与多种肿瘤的 发生和进展。随后，通过分析 与 临床病理特征和预后的关系，证明高表达的 与 患者较高的 分期、分级、血清甲胎蛋白水平等具有相关性，表明 与 的进展有关，进一步的 回归分析证实 是 的独立危险因子与独立预后因子。曲线显示 对患者预后的预测具有较高的特异性和敏感性。上述结果都表明 可能是一个对 具有诊断和预后评估能力的生物标志物。为探索 潜在的致癌机制，本研究通过功能富集分析，证实了 在 中主要参与多种具有促癌作用的信号通路和病理过程。随后通过细胞实验证实了 在 细胞系中的表达水平升高且敲低 对 细胞的增殖和迁移能力具有抑制性影响。以上结果均证实了 影响 的发生和进展过程，可为基于 的生物标志物和治疗靶点的研发提供更多理论基础。肿瘤微环境中的细胞成分主要由 淋巴细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、单核细胞、等组成，与肿瘤免疫逃逸和免疫耐受紧密相关 。以 为代表的免疫检查点抑制剂的功能主要是刺激特异性免疫，打破免疫耐受，重新赋予免疫细胞识别和杀伤癌细胞的活性 。目前，越来越多的研究证明恶性肿瘤中异常的脂质代谢与免疫细胞和免疫检查点基因具有潜在的相互作用，可共同促进肿瘤进展 。在免疫细胞方面，研究证实，淋巴细胞表面的 分子可以吸收低密度脂蛋白并诱导脂质过氧化，进而导致肿瘤局部 细胞功能障碍，促进了肿瘤的免疫逃逸 。另有研究表明，脂质异常聚集可降低树突状细胞的抗原呈递能力，进而导致 细胞的耗竭或功能障碍 。在免疫检查点方面，研究表明，胆固醇合成过程的重要限速酶之一辛伐他汀可通过抑制 来降低 相关蛋白的磷酸化和泛素化介导的蛋白降解，从而使程序性死亡受体配体 的转录水平降低 。另有研究表明，由脂肪酸合成酶（，）催化的脂肪酸从头合成过程可促进 的成熟与分化，在 基因缺失的 中可检测到上调的 表达水平，抑制 的脂质合成过程可以抑制肿瘤细胞生长且增强抗 免疫治疗的效果 。以上研究均表明脂质代谢重编程可通过影响免疫细胞和免疫检查点来发挥促癌作用。基于 和 数据库，本研究证实了 的高表达与 种免疫抑制细胞群即单核细胞、和 的浸润水平和标志基因的表达水平呈正相关，表明 可能通过影响免疫抑制性的肿瘤微环境来促进 的进展。此外，本研究首次绘制了 中 与免疫检查点的共变异和互斥变异图谱，证实了 与免疫检查点的遗传变异密切相关，同时也证实了 与免疫检查点的表达水平呈正相关，创新性地提出 可能和免疫检查点存在相互作用，具有成为预测抗 免疫治疗效果的生物标志物的潜力。结论本研究初步证实了 在包括 在内的多种恶性肿瘤中高表达，与 患者的临床病理信息和预后显著相关，是 的独立风险因子和独立预后因子，且 的敲减对 细胞的增殖和迁移能力有抑制作用。与免疫抑制性细胞以及免疫检查点紧密相关，可能通过参与免疫抑制性肿瘤微环境的构建进而参与 进展，有望成为预测抗 免疫治疗效果的生物标志物。需要进一步的深入研究为 相关的 治疗靶点的开发提供理论基础和临床证据。参考文献 ，（）：河南医学研究 年 月第 卷第 期 ，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，?，（）：，：，（）：，：，：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（），（）：徐?，袁克非 脂质代谢重编程与肝癌代谢应激 四川大学学报（医学版），（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，?，（）：，：，（）：，（）：（收稿日期：）河南医学研究 年 月第 卷第 期 ，