LPCAT1在肝细胞癌中的表达及与肿瘤免疫的相关性分析.pdf
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1、 在肝细胞癌中的表达及与肿瘤免疫的相关性分析王锃涵,王云,王雪梅,朱威威,梁红霞(郑州大学第一附属医院 感染科,河南 郑州 )基金项目:国家自然科学基金面上项目()通信作者:梁红霞,:摘要:目的研究血磷脂酰胆碱酰基转移酶 ()在肝细胞癌()中的表达水平、预后意义及潜在机制,重点探究 与免疫细胞和免疫检查点的关系。方法从肿瘤基因组图谱()数据库获取 患者的临床信息及 表达水平,利用回归分析和生存分析等探索 与 患者的临床特征及预后的关系。通过功能富集分析进一步探索 在 中的潜在机制。应用肿瘤免疫浸润评估资源()数据库分析 与免疫细胞浸润丰度和标志基因表达水平的相关性,应用 数据库分析 与 患者免
2、疫检查点的遗传变异和表达水平的关系。通过细胞学实验验证 在 中的表达水平,并通过敲减 探究其对肝癌细胞恶性生物学行为的影响。结果在 中,的表达水平升高,与较高的 分期()、组织学分级()、分级()、血清甲胎蛋白水平()以及发生血管侵袭()具有相关性,是 的独立风险因子和独立预后因子()。可能参与糖酵解、药物代谢、通路和 通路等多种病理生理过程和信号通路。敲减 后肝癌细胞的体外增殖能力和迁移能力降低,差异有统计学意义()。与 种免疫抑制性细胞的浸润丰度及标志物的表达水平呈正相关,与免疫检查点的遗传变异和表达水平也具有一定的相关性。结论 在 中高表达,可作为独立风险因子和预后因子,可能通过影响免疫
3、细胞浸润和免疫检查点参与免疫抑制性肿瘤微环境的构建,进而参与 进展。关键词:肝细胞癌;血磷脂酰胆碱酰基转移酶 ;肿瘤基因组图谱;肿瘤免疫;生物信息学;分子标志物中图分类号:,(,):()(),()(),(),(),(),()(),(),(),:;原发性肝癌是全球第六大最常诊断的癌症和第三河南医学研究 年 月第 卷第 期 ,大癌症相关死因 ,年全球约有 万人被诊断为肝癌,万人死于肝癌 。肝细胞癌(,)是原发性肝癌最常见的病理类型,因其症状隐匿且进展迅速,约 的患者在确诊时已处于中晚期 。目前,以程序性死亡受体 (,)为代表的免疫治疗是中晚期 的主要治疗手段,也可作为 的辅助治疗和转化治疗手段 ,
4、同时面临着客观应答率低、毒副作用高、适应性耐药等挑战 。研究表明,免疫治疗与肿瘤细胞异常的脂质代谢密切相关,后者可通过直接或间接调节免疫细胞的分化、凋亡以及细胞间相互作用等影响免疫治疗效果 。血磷脂酰胆碱酰基转移酶(,)作为脂质代谢过程中一种参与膜脂重塑的关键酶 ,已被证实在多种癌症中表达升高,且具有作为诊断和预后标志物的潜力 。在 中,被证实可通过激活 信号通路进而促进肝癌细胞的上皮间充质转化过程,以及通过抑制信号传导转录激活因子 进而促进肝癌细胞增殖等 。然而,目前关于 在 中与肿瘤免疫微环境的相互作用等尚未被阐明。本研究基于肿瘤基因组图谱(,)等数据库,联合 表达水平和患者的临床病理特征
5、、预后信息等资料,探索 在 中的诊断意义、预后意义和潜在功能,通过细胞学实验探究 对 细胞恶性生物学行为的影响。同时,分析 与 中免疫细胞浸润水平和标志物表达水平的相关性,以及 与免疫检查点的遗传变异和表达水平的关系,以此探索 在肿瘤免疫中的潜在功能。材料与方法 表达情况分析从 (:)数据库下载包含 例 样本和 例正常样本的 数据集 ,对基因表达数据进行 对数转换,使用 包 分析 在肿瘤和正常样本中的差异表达。从人类蛋白质表达数据库(,:)中下载 在 肿 瘤 和 肝 脏 组 织 中 的 蛋 白 表 达情况 。预后意义分析利用基因表达谱在线分析平台(,)(:)和 数据库(:)对 表达水平与常见恶
6、性肿瘤的预后信息进行 回归分析或 秩和检验,并绘制预后生存曲线 。通过绘制受试者工作特征(,)曲线分析 对于 预后情况的预测效能。与 患者临床病理特征的分析以 表达水平的中位数为标准将样本分为高表达组(例)和低表达组(例),利用检验分析 的表达与临床病理信息的相关性,不符合正态分布的变量运用 检验。随后进行单因素和多因素 回归分析,并通过 列线图对多因素 回归分析结果进行可视化。在 中的功能富集分析利用 秩相关性分析挑选与 表达水平具有显著相关性的 组基因,上传至 (,:)在线数据库进行功能富集分析,分析内容主要包括基因本体论(,)和京都基因和基因组百科全书(,)。同时从基因集富集分析(,)官
7、网(:)下载 软件,对差异基因在信号通路或生理过程中的富集情况进行 。影响免疫细胞和免疫检查点的分析利用肿瘤免疫浸润评估资源(,)数据库(:)分析 与肿瘤微环境中免疫细胞浸润丰度的相关性 。应用 数据集()(:)分析 中 与免疫检查点遗传变异的关系,包括扩增、缺失等 。应用相关性分析探索 与免疫细胞标志物及免疫检查点的表达水平的关系。细胞实验 细胞和主要试剂人类 细胞系和肝细胞系均购自中国细胞典藏中心。细胞培养基、胎牛血清等购自美国 公司,一抗购自英国 公司,蛋白定量试剂盒和 试剂盒购自上海碧云天公司,荧光定量 试剂盒购自瑞士 公司。和聚合酶链反应(,)引物分别由汉恒生物公司和生工生物公司构建
8、。细胞培养和细胞转染 细胞系和 细胞系分别用含 (体积分数)胎牛血清的 或 培养基培育于 、的培养箱中。选取汇合度为 的 和 细胞系,按照说明书配制含有适量 和 的转染体系,等量加入细胞培养孔中,后更换为含血清 培养基。河南医学研究 年 月第 卷第 期 ,后检测 水平,后检测 蛋白质水平。实时荧光定量 应用 、氯仿等提取总 并测定浓度,依据操作说明配制反转录体系,依次于 反应 ,反应 ,反应 。随后依据操作说明配制 扩增体系。首先以 反应 ,后按照 ,的顺序反应 个循环,运用 法计算相对表达量。收集总蛋白后利用 法测定蛋白浓度并配制上样体系,变性后于 聚丙稀酰胺凝胶和 甘氨酸电泳液进行电泳,电
9、泳条件为恒压 ,约 。随后,于 甘氨酸转膜液中构建转膜体系,转膜条件恒流 ,。于封闭液中进行 的室温封闭,清洗后分别孵育一抗和二抗(),随后进行蛋白显影和图像分析。实验按照说明书配制 工作液,选取对数生长期的细胞系加入 工作液孵育 ,随后进行固定和室温通透处理,并用 活性溶解体系和 反应液于室温下避光孵育 。用 溶液对细胞核进行染色。利用荧光显微镜对细胞增殖情况进行观测。划痕实验选取贴壁于六孔板的汇合度 的细胞,用 枪头对细胞进行垂直或水平划痕,每孔 道划痕。随后分别于 和 时用普通光学显微镜对划痕处进行观测和拍照,测量划痕的变化程度并进行后续分析。注意划痕后使用不含胎牛血清的培养基进行培养。
10、统计学方法利用 、和 对相关数据进行整理、统计学分析和数据可视化。符合正态分布的计量资料用均数 标准差(珋 )表示。利用 网站绘制 的表达水平与 患者预后的生存曲线并进行 检验。组间比较采用两独立样本 检验,组间相关性分析采用 秩相关性分析。双尾法 为差异有统计学意义。结果 在泛癌中的表达水平和预后分析本研究分析了 数据库中 种癌症组织和正常组织中 的表达水平。结果显示,有 种癌症组织表现出较高水平的 ,如 、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、肺鳞癌等,然而 在肾嫌色细胞癌、甲状腺癌和胸腺瘤中的表达水平低于癌旁组织(图 )。基于 数据库的分析显示,与 、肺鳞癌、低级别胶质瘤的总生存期(,)和疾病特异性生
11、存期(,)具有显著的相关性,的表达水平越高,患者的 和 越短(图 )。为 在多种恶性肿瘤中显著高表达;为 在 、肺鳞癌和低级别胶质瘤患者中提示不良预后。图 数据库中泛癌和癌旁组织中 的表达水平及预后分析河南医学研究 年 月第 卷第 期 ,在 中高表达且提示不良预后根据 数据集和 数据库分析 在配对样本和非配对样本中的表达水平,结果均显示 在 中的表达水平高于癌旁组织()(图 )。对 与 临床病理特征的相关性进行统计分析,结果显示,与较高的 分 期()、组 织 学 分 级()、分级()、血清甲胎蛋白水平()以及发生血管侵袭()具有显著相关性,见图 及表 (部分患者临床病理特征信息缺失)。通过 回
12、归分析探索影响 预后的危险因素,单因素分析结果提示,较高的 分级()、分期()和 表达水平()是影响 生存期的潜在危险因素,多因素回归分析提示高表达的 ()是影响 预后的独立因子(表)。基于回归分析结果的 列线图显示,高表达的 样本的单项总分更高,与之对应的、生存率更低,高表达的 可能是 患者潜在的预后预测指标(图 )。生存曲线显示,高表达的 样本具有较低的 、和无进展生存期(,)(图 )。依据 曲线分别利用 、和 评价 对 预后预测的效果,结果显示,曲线下面积(,)分别为 、和 ,具有较好的预测价值(图 )。为 在 和癌旁样本中的表达水平;为 数据库中 在 和正常肝脏中的表达情况;为 与 样
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