circ_NEK6_miR-503-5p对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响.pdf
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1、第5 2卷第4期第5 1 1页2 0 2 3年8月 华中科技大学学报(医学版)A c t aM e dU n i vS c iT e c h n o lH u a z h o n g V o l.5 2 N o.4 P.5 1 1A u g.2 0 2 3实验研究*贵州省遵义市科技计划项目N o.遵市科合H Z(2 0 2 2)9 6葛金丽,女,1 9 8 6年生,主治医师,E-m a i l:1 8 2 7 5 6 1 7 2 4 71 6 3.c o m通讯作者,C o r r e s p o n d i n ga u t h o r,E-m a i l:2 8 2 6 1 2 6 6q
2、q.c o mc i r c_N E K 6/m i R-5 0 3-5 p对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响*葛金丽,李 行,李 强,柘娜娜,周震沧,刘兆玉遵义医科大学第三附属医院(遵义市第一人民医院)血液内科,遵义 5 6 3 0 0 0摘要:目的 探讨c i r c_N E K 6/m i R-5 0 3-5 p分子轴对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响及其可能的作用机制。方法 选取2 0 2 0年2月至2 0 2 1年7月遵义医科大学第三附属医院收治的3 0例多发性骨髓瘤患者为研究组,同时选取在该院体检的5 5例健康志愿者为对照组;q R T-P C R法检测血清中c i r
3、 c_N E K 6、m i R-5 0 3-5 p的表达量;体外培养人多发性骨髓瘤U 2 6 6细胞,分为s i-c i r c_N E K 6组、m i R-5 0 3-5 p组和s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-5 0 3-5 p组以及相应的对照组(s i-N C组、m i R-N C组、s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-N C组);细胞增殖、凋亡及迁移用MT T法、克隆形成实验、流式细胞术与T r a n s w e l l实验测定;双荧光素酶报告基因实验验证c i r c_N E K 6与m i R-5 0 3-5
4、p之间的靶向关系;W e s t e r nb l o t检测B a x、B c l-2蛋白表达量。结果 与对照组比较,研究组患者血清中c i r c_N E K 6高表达(P0.0 5),m i R-5 0 3-5 p低表达(P0.0 5);s i-c i r c_N E K 6组U 2 6 6细胞m i R-5 0 3-5 p的表达、细胞增殖抑制率、凋亡率和B a x水平增加(均P0.0 5),而克隆数、迁移数和B c l-2水平降低(均P0.0 5);c i r c_N E K 6可靶向结合m i R-5 0 3-5 p;在m i R-5 0 3-5 p组U 2 6 6细胞,细胞增殖抑制
5、率、凋亡率和B a x水平上升(均P0.0 5),而克隆数、迁移数和B c l-2水平降低(均P0.0 5);此外,s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-5 0 3-5 p组细胞增殖抑制率、凋亡率和B a x水平降低(均P0.0 5),而克隆数、迁移数和B c l-2水平升高(P0.0 5)。结论 敲低c i r c_N E K 6可以通过靶向m i R-5 0 3-5 p降低多发性骨髓瘤细胞生长和迁移能力。关键词:多发性骨髓瘤;c i r c_N E K 6;m i R-5 0 3-5 p;细胞增殖;迁移;凋亡中图分类号:R 7 3 3.3 D O I:1 0.
6、3 8 7 0/j.i s s n.1 6 7 2-0 7 4 1.2 0 2 3.0 4.0 1 2E f f e c t o f c i r c_N E K 6/m i R-5 0 3-5 po nt h eP r o l i f e r a t i o n,A p o p t o s i sa n dM i g r a t i o no fM u l t i p l eM y e l o m aC e l l sG eJ i n l i,L iH a n g,L iQ i a n ge t a lD e p a r t m e n t o fH e m a t o l o g y,t h
7、 eT h i r dA f f i l i a t e dH o s p i t a l o fZ u n y iM e d i c a lU n i v e r s i t y(T h eF i r s tP e o p l esH o s p i t a l o fZ u n y i),Z u n y i 5 6 3 0 0 0,C h i n aA b s t r a c t O b j e c t i v e T oe x p l o r e t h ee f f e c to f c i r c_N E K 6/m i R-5 0 3-5 pa x i so nt h ep r o
8、 l i f e r a t i o n,a p o p t o s i sa n dm i g r a t i o no fm u l t i p l em y e l o m a(MM)c e l l sa n di t sp o s s i b l em e c h a n i s m.M e t h o d s T h i r t yp a t i e n t sw i t h MMa d m i t t e di no u rh o s p i t a lf r o mF e b r u a r y2 0 2 0t oJ u l y2 0 2 1w e r es e l e c t
9、e da st h es t u d yg r o u p,a n d5 5h e a l t h yv o l u n t e e r sw h or e c e i v e dp h y s i c a l e x a m i n a t i o ni no u r h o s p i t a lw e r e s e l e c t e da s t h e c o n t r o l g r o u p.T h e q R T-P C Rm e t h o dw a su s e d t od e t e c t t h e e x p r e s s i o no f c i r c
10、_N E K 6a n dm i R-5 0 3-5 p i ns e r u m.U 2 6 6c e l l sw e r e c u l t u r e d f o ri n v i t r oa s s a y,a n dc e l l sw e r e r a n d o m l yd i v i d e d i n t ot h e f o l l o w i n gg r o u p s:s i-c i r c_N E K 6g r o u p,m i R-5 0 3-5 pg r o u p,s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-5 0 3-5 p
11、g r o u pa n dn e g a t i v ec o n t r o lg r o u p(s i-N Cg r o u p,m i R-N Cg r o u p,a n ds i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-N Cg r o u p).MT Ta s s a y,c o l o n yf o r m a t i o na s s a y,f l o wc y t o m e t r ya s s a ya n dT r a n s w e l l a s s a yw e r eu s e d t od e t e c t c e l l p r
12、o l i f e r a t i o n,a p o p t o s i s a n dm i g r a t i o n.D u a l-l u c i f e r a s e r e p o r t e r a s s a yw a su s e d t od e t e c t t h e t a r g e t i n gr e-l a t i o n s h i pb e t w e e nc i r c_N E K 6a n dm i R-5 0 3-5 p.W e s t e r nb l o tw a su s e d t od e t e c t t h e e x p r
13、 e s s i o no fB a xa n dB c l-2p r o t e i n.R e s u l t sC o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l g r o u p,t h ee x p r e s s i o no fc i r c_N E K 6w a s i n c r e a s e d(P0.0 5),w h i l et h ee x p r e s s i o no fm i R-5 0 3-5 pw a sd e c r e a s e d(P0.0 5)i nt h es e r u mo fMMp a t i e n t
14、 s.T h em i R-5 0 3-5 pe x p r e s s i o n,c e l lp r o l i f e r a t i o ni n h i b i t i o nr a t e,a p o p t o s i sr a t ea n dB a x l e v e lw e r e i n c r e a s e d(a l lP0.0 5),w h i l e c e l l c o l o n yn u m b e r,c e l lm i g r a t i o nn u m b e r a n dB c l-2l e v e lw e r ed e c r e
15、a s e d(a l lP0.0 5)i nt h es i-c i r c_N E K 6g r o u p.T h ec i r c_N E K 6c o u l dt a r g e tm i R-5 0 3-5 p.C e l lp r o l i f e r a t i o ni n h i b i t i o nr a t e,a p o p t o s i sr a t ea n dB a x l e v e lw e r e i n c r e a s e d(a l lP0.0 5),w h i l e c e l l c o l o n yn u m b e r,c e
16、l lm i g r a t i o nn u m b e r a n dB c l-2l e v e lw e r ed e c r e a s e d(a l lP0.0 5)i n t h em i R-5 0 3-5 pg r o u p.B e s i d e s,c e l l p r o l i f e r a t i o n i n h i b i t i o nr a t e,a p o p t o s i s r a t e a n dB a x l e v e lw e r ed e c r e a s e d(a l lP0.0 5),w h i l ec e l l
17、c o l o n yn u m b e r,c e l lm i g r a t i o nn u m b e ra n dB c l-2l e v e lw e r e i n c r e a s e d(a l lP0.0 5)i nt h es i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-5 0 3-5 pg r o u p.C o n c l u s i o n K n o c k d o w no f c i r c_N E K 6c o u l d i n h i b i t t h eg r o w t ha n dm i g r a t i o no fM
18、Mc e l l sb y t a r g e t i n gm i R-5 0 3-5 p.K e yw o r d s m u l t i p l em y e l o m a;c i r c_N E K 6;m i R-5 0 3-5 p;c e l lp r o l i f e r a t i o n;m i g r a t i o n;a p o p t o s i s 多发性骨髓瘤是一种成熟B淋巴细胞恶性增生性疾病,严重威胁患者生命安全,但其发病机制尚未阐明1-2。环状R NA(c i r c u l a rR NA,c i r c R NA)可以充当微小R NA(m i R NA
19、)的海绵调控m i R NA水平。多项研究显示,c i r c R NA在多发性骨髓瘤中表达异常,并可在多发性骨髓瘤发生及发展过程中发挥癌基因或抑癌基因作用3。c i r c_N E K 6在非小细胞肺癌中表达水平升高,并可通过竞争性结合m i R-3 8 2-5 p而促进乳腺癌扩增序列2(B C A S 2)的表达从而促进非小细胞肺癌的发展4。但c i r c_N E K 6在多发性骨髓瘤进程中的作用尚不清楚。既往的报道显示,m i R-5 0 3-5 p对卵巢癌细胞的生长有抑制作用5,但其是否调控多发性骨髓瘤进程还未见报道。S t a r b a s e软件分析结果显示c i r c_N
20、E K 6可以与m i R-5 0 3-5 p互补结合。因此,我们推测c i r c_N E K 6可能靶向m i R-5 0 3-5 p而调节多发性骨髓瘤恶性进展。1 材料与方法1.1 材料与试剂招募3 0例多发性骨髓瘤患者为研究组,其中男1 8例,女1 2例,年龄4 76 8岁,平均年龄(6 0.3 24.2 6)岁。同时选取在本院体检的5 5例健康志愿者为对照组,其中男3 5例,女2 0例,年龄4 27 0岁,平均年龄(5 9.3 65.1 2)岁。所有受试者均签署了知情同意书,且本研究获得了遵义医科大学第三附属医院伦理委员会的批准。人多发性骨髓瘤U 2 6 6细胞购自上海通派公司;DM
21、EM培养液(货号:1 1 9 6 5 0 9 2)与胎牛血清(货号:1 0 1 0 0 1 4 7)购自美国G i b c o公司;T r i z o l试剂(货号:1 5 5 9 6 0 2 6)、L i p o f e c t a m i n e 3 0 0 0(货号:L 3 0 0 0 0 7 5)购自美国T h e r m oF i s h e r公司;反转录(货号:K R 1 0 7)与荧光定量P C R试剂盒(货号:F P 2 1 7)购自北京天根公司;s i-c i r c_N E K 6、m i R-5 0 3-5 pm i m i c s、a n t i-m i R-5 0
22、3-5 p及 相 应 的 对 照(s i-N C、m i R-N C、a n t i-m i R-N C)由广州锐博公司合成;MT T试剂(货号:C 0 0 0 9S)、细胞凋亡检测试剂盒(货号:C 1 0 6 2 S)购自上海碧云天公司;T r a n s w e l l小室(货号:3 4 2 2)购自美国C o r n i n g公司;双荧光素酶活性检测试剂盒(货号:E 1 9 1 0)购自美国P r o m e g a公司;兔抗人B a x(货号:a b 3 2 5 0 3)、B c l-2(货号:a b 3 2 1 2 4)、GA P DH(货号:#5 1 7 4)抗体与二抗(货号:a
23、 b 2 0 5 7 1 8)购自美国A b-c a m公司。1.2 方法1.2.1 采集血液样本 分别抽取多发性骨髓瘤患者和健康志愿者清晨空腹静脉血5m L,3 0 0 0r/m i n离心1 0m i n,吸取上清液后保存于-8 0 冰箱内。1.2.2 实验分组 U 2 6 6细胞接种于6孔板,按照L i p o f e c t a m i n e 3 0 0 0说明书采用脂质体转染法将s i-c i r c_N E K 6、m i R-5 0 3-5 pm i m i c s、a n t i-m i R-5 0 3-5 p及相应的对照(s i-N C、m i R-N C、a n t i-
24、m i R-N C)转染入U 2 6 6细胞,随后将细胞分为s i-c i r c_N E K 6组、s i-N C组、m i R-5 0 3-5 p组、m i R-N C组、s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-N C组和s i-c i r c_N E K 6+a n t i-m i R-5 0 3-5 p组。1.2.3 q R T-P C R检测 根据试剂盒说明书,使用T r i z o l试剂提取总R NA,用反转录试剂盒合成c D-NA。用S Y B RG r e e n进行q R T-P C R反应,反应条件:9 5预变性2m i n,9 5变性3 0s
25、,6 0退火3 0s,7 2延伸3 0s,共4 0个循环。采用2-C t法计算c i r c_N E K 6和m i R-5 0 3-5 p的相对表达量。1.2.4 MT T实验 U 2 6 6细胞接种于9 6孔板,每个孔中加入2 0L MT T(5m g/m L),孵育4h。去除上清液后,向每个孔中加入1 5 0LDM S O溶解结晶,最后应用酶标仪测量各孔4 9 0n m处吸光度值并计算细胞增殖抑制率。1.2.5 克隆形成实验 以每孔5 0 0个细胞将U 2 6 6细胞接种于含有完全培养液的6孔板中孵育。每3天更换1次培养液。培养1 4d,用甲醇固定形成的细胞克隆3 0m i n,用0.1
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