第一章-蛋白质结构与功能.ppt

n蛋白质蛋白质(protein)是由许多是由许多氨基酸氨基酸(amino acids)通过通过肽键肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物相连形成的高分子含氮化合物。Structure and Function of Protein第一章第一章 蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能n蛋白质研究的历史蛋白质研究的历史1833年年，从从麦麦芽芽中中分分离离淀淀粉粉酶酶；随随后后从从胃胃液液中中分离到类似胃蛋白酶的物质。分离到类似胃蛋白酶的物质。1864年，血红蛋白被分离并结晶。年，血红蛋白被分离并结晶。19世世纪纪末末，证证明明蛋蛋白白质质由由氨氨基基酸酸组组成成，并并合合成成了多种短肽。了多种短肽。20世世纪纪初初，发发现现蛋蛋白白质质的的二二级级结结构构；完完成成胰胰岛岛素一级结构测定素一级结构测定。20世世纪纪中中叶叶，各各种种蛋蛋白白质质分分析析技技术术相相继继建立，促进了蛋白质研究迅速发展；建立，促进了蛋白质研究迅速发展；1962年，确定了血红蛋白的四级结构。年，确定了血红蛋白的四级结构。20世世纪纪90年年代代，功功能能基基因因组组与与蛋蛋白白质质组组研究地展开。研究地展开。蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成The Molecular Component of Protein第一节第一节n组成蛋白质的元素组成蛋白质的元素主要有主要有C、H、O、N和和 S。有些蛋白质含有少量磷或金属元素有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘还含有碘。各种蛋白质的含氮量一般在各种蛋白质的含氮量一般在15-17%，平均为，平均为16%，即即1克克N相当于相当于6.25克的蛋白质克的蛋白质。因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.25100n蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点一、组成人体蛋白质的一、组成人体蛋白质的20种氨基酸种氨基酸均属于均属于L-氨基酸氨基酸 存存在在自自然然界界中中的的氨氨基基酸酸有有300余余种种，但但组组成成人人体体蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸仅仅有有20种种，且且均均属属 L-氨氨基基酸酸（甘甘氨氨酸酸除除外外）,都都具具有有光光学学活活性性，有有D型型和和L型型两种光学异构体。两种光学异构体。D-型型 L-型型H甘氨酸甘氨酸CH3丙氨酸丙氨酸L-L-氨基酸的通式氨基酸的通式RC+NH3COO-H（母核）（母核）非极性脂肪族氨基酸非极性脂肪族氨基酸极性中性氨基酸极性中性氨基酸芳香族氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸二、氨基酸二、氨基酸可根据侧链结构和理化性质可根据侧链结构和理化性质进行分类进行分类(一一)侧链含侧链含烃链烃链的氨基酸属于的氨基酸属于非极性脂肪族非极性脂肪族氨基酸氨基酸(二二)侧链侧链有极性但不带电荷有极性但不带电荷的氨基酸是的氨基酸是极性极性中性氨基酸中性氨基酸(三三)侧链侧链含芳香基团含芳香基团的氨基酸是的氨基酸是芳香族氨基酸芳香族氨基酸(四四)侧链含侧链含负性解离基团负性解离基团的氨基酸是的氨基酸是酸性氨基酸酸性氨基酸(五五)侧链含侧链含正性解离基团正性解离基团的氨基酸属于的氨基酸属于碱性氨基碱性氨基酸酸n几种特殊氨基酸几种特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸（亚氨基酸）（亚氨基酸）(非极性脂肪族非极性脂肪族)CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2在蛋白质合成加工时在蛋白质合成加工时被修饰成羟脯氨基酸被修饰成羟脯氨基酸亚氨基亚氨基 半胱氨酸半胱氨酸(极性中性氨基酸极性中性氨基酸)+胱氨酸胱氨酸二硫键二硫键-HH-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3三、三、20种氨基酸具有共同或特异的理化性质种氨基酸具有共同或特异的理化性质两性解离两性解离:氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。处溶液的酸碱度。等等电电点点(isoelectric point,pI):在在某某一一pH的的溶溶液液中中，氨氨 基基酸酸解解离离成成阳阳离离子子和和阴阴离离子子的的趋趋势势及及程程度度相相等等，成成为为兼兼性性离离子子，呈呈电电中中性性。此此时时溶溶液液的的pH值值称称为为该该氨氨基基酸酸的的等等电点电点。（一）氨基酸具有两性解离的性质（一）氨基酸具有两性解离的性质pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性离子氨基酸的兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子溶液溶液pH值大于值大于pI时时,AA解离成阴离子带负电荷解离成阴离子带负电荷,反之带正电荷反之带正电荷 pK1pK2pK1pK2（二）含共轭双键的氨基酸具有紫外吸收性质（二）含共轭双键的氨基酸具有紫外吸收性质色氨酸色氨酸(Trp,W)、酪氨酸酪氨酸(Tyr,Y)的最大的最大吸收峰在吸收峰在 280 nm 附近。附近。大大多多数数蛋蛋白白质质含含有有这这两两种种氨氨基基酸酸残残基基，所所以以 测测 定定 蛋蛋 白白 质质 溶溶 液液280nm的的光光吸吸收收值值是是分分析析溶溶液液中中蛋蛋白白质质含含量量的的快速简便的方法。快速简便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收（三）氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物（三）氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物氨氨基基酸酸与与茚茚三三酮酮水水合合物物共共热热，可可生生成成蓝蓝紫色紫色化合物，其最大吸收峰在化合物，其最大吸收峰在570nm处。处。由由于于此此吸吸收收峰峰值值与与氨氨基基酸酸的的含含量量存存在在正正比关系，因此可作为比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法氨基酸定量分析方法。四、蛋白质是由许多氨基酸残基组成的多肽链四、蛋白质是由许多氨基酸残基组成的多肽链肽肽键键(peptide bond)是是由由一一个个氨氨基基酸酸的的-羧羧基基与与另另一一个个氨氨基基酸酸的的-氨氨基基脱脱水水缩缩合合而而形形成成的化学键。的化学键。（一）（一）氨基酸通过肽键连接而形成肽氨基酸通过肽键连接而形成肽(peptide)+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物两两分分子子氨氨基基酸酸缩缩合合形形成成二二肽肽，三三分分子子氨氨基基酸缩合则形成酸缩合则形成三肽三肽肽肽链链中中的的氨氨基基酸酸分分子子因因为为脱脱水水缩缩合合而而基基团团不全，被称为不全，被称为氨基酸残基氨基酸残基(residue)。由由十十个个以以内内氨氨基基酸酸相相连连而而成成的的肽肽称称为为寡寡肽肽(oligopeptide)，由由更更多多的的氨氨基基酸酸相相连连形形成成的的肽称肽称多肽多肽(polypeptide)。多肽链有两端多肽链有两端：N 末端：多肽链中有末端：多肽链中有游离游离-氨基氨基的一端的一端C 末端：多肽链中有末端：多肽链中有游离游离-羧基羧基的一端的一端 许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构多肽链多肽链(polypeptide chain)N末端末端C末端末端牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶（二）（二）体内存在多种重要的生物活性肽体内存在多种重要的生物活性肽 1.谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶还原酶NADPH+H+NADP+nGSH与氧化型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽(GSSG)间的转换间的转换 体内许多激素属寡肽或多肽体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽神经肽(neuropeptide)2.多肽类激素及神经肽多肽类激素及神经肽N端谷氨酸环化端谷氨酸环化C端脯氨酸端脯氨酸残基酰化残基酰化掌握内容掌握内容n蛋白质分子元素组成及特点；蛋白质分子元素组成及特点；n组成人体组成人体20种氨基酸的名称和分类；种氨基酸的名称和分类；n氨基酸等电点和特征反应氨基酸等电点和特征反应第二节第二节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构The Molecular Structure of Proteinn蛋白质的分子结构包括蛋白质的分子结构包括:高级结构高级结构或空间结构或空间结构一级结构一级结构(primary structure)二级结构二级结构(secondary structure)三级结构三级结构(tertiary structure)四级结构四级结构(quaternary structure)n定义定义:蛋白质的一级结构指在蛋白质分子从蛋白质的一级结构指在蛋白质分子从N-N-端至端至C-C-端的端的氨基酸排列顺序氨基酸排列顺序。一、一、氨基酸的排列顺序决定蛋白质氨基酸的排列顺序决定蛋白质的一级结构的一级结构n主要的化学键主要的化学键:肽键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。，有些蛋白质还包括二硫键。一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的功能的基础基础，但不是决定蛋白质空间构象的但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素唯一因素。链间链间链内链内二、二、多肽链的局部主链构象为蛋白质多肽链的局部主链构象为蛋白质二级结构二级结构定定义义:蛋蛋白白质质分分子子中中某某一一段段肽肽链链的的局局部部空空间间结结构构，即即该该段段肽肽链链主主链链骨骨架架原原子子的的相相对对空空间间位位置置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象并不涉及氨基酸残基侧链的构象。主要的化学键主要的化学键：氢键氢键 定义定义:二级结构二级结构:肽链肽链主链骨架原子主链骨架原子的相对空间位置的相对空间位置（一）参与肽键形成的（一）参与肽键形成的6个原子在同一平面上个原子在同一平面上参参与与肽肽键键的的6个个原原子子C 1、C、O、N、H、C 2位位于于同同一一平平面面，C 1和和C 2在在平平面面上上所所处处的的位位置置为为反反式式(trans)构构型型，此此同同一平面上的一平面上的6个原子构成了所谓的个原子构成了所谓的肽单元肽单元(peptide unit)。蛋白质二级结构蛋白质二级结构 -螺旋螺旋(-helix)-折叠折叠(-pleated sheet)-转角转角(-turn)无规卷曲无规卷曲(random coil)（二）二）-螺旋结构是常见的蛋白质二级结构螺旋结构是常见的蛋白质二级结构特点：特点：1、右手螺旋、右手螺旋,螺距：螺距：3.6AA,0.54 nm；2、侧链伸向螺旋外侧；、侧链伸向螺旋外侧；3、氢键：、氢键：N-H与第四个肽键的羰基氧形成，与螺旋与第四个肽键的羰基氧形成，与螺旋 长轴平行；长轴平行；4、蛋白表面的、蛋白表面的-螺旋具有两性特点，一侧为亲水氨螺旋具有两性特点，一侧为亲水氨基酸，另一侧疏水氨基酸。基酸，另一侧疏水氨基酸。n-螺旋螺旋（三）（三）-折叠使多肽链形成片层结构折叠使多肽链形成片层结构特点：特点：1、分为平行式和反平行式两种类型；、分为平行式和反平行式两种类型；2、通过肽链间或肽段间的氢键维系；、通过肽链间或肽段间的氢键维系；3、-碳原子位于折叠线上碳原子位于折叠线上,由于其四面体性质由于其四面体性质,连续连续的酰氨平面排列成折叠形式；的酰氨平面排列成折叠形式；4、在折叠片上的侧链都垂直于折叠片的平面、在折叠片上的侧链都垂直于折叠片的平面,并交并交替的从平面上下二侧伸出。替的从平面上下二侧伸出。反向反向-折叠折叠 在平行在平行(a)和反平行和反平行(b)-折叠片中氢键的排列折叠片中氢键的排列（四）（四）-转角和无规卷曲在蛋白质分子中普遍存转角和无规卷曲在蛋白质分子中普遍存在在-转角转角特点：特点：1、4个个AA残基组成残基组成2、氢键：第一个残基的羰、氢键：第一个残基的羰基氧和第四个残基的氨基氢基氧和第四个残基的氨基氢形成形成3、第、第2个个AA残基通常为脯残基通常为脯氨酸氨酸无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。分肽链结构。（五）（五）超二级结构超二级结构在许多蛋白质分子中，可发现两个或两个以上在许多蛋白质分子中，可发现两个或两个以上具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个个有规则的二级结构组合，被称为有规则的二级结构组合，被称为超二级结构超二级结构。二级结构组合形式有二级结构组合形式有3种：种：，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为上相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为模体模体(motif)。模体是具有特殊功能的超二级结构，如钙模体是具有特殊功能的超二级结构，如钙结合蛋白，锌指蛋白等。结合蛋白，锌指蛋白等。模体模体钙结合蛋白中结合钙结合蛋白中结合钙离子的模体钙离子的模体锌指结构锌指结构-螺旋螺旋-转角转角（或环）（或环）-螺旋螺旋模体模体链链-转角转角-链模体链模体链链-转角转角-螺旋螺旋-转角转角-链模体链模体模体常见的形式模体常见的形式（六）氨基酸残基侧链对二级结构形成的影响六）氨基酸残基侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成适合形成-螺旋螺旋或或-折叠，它就会出现相应的二级结构折叠，它就会出现相应的二级结构。三、三、在二级结构基础上多肽链进一步折叠形成在二级结构基础上多肽链进一步折叠形成蛋白质三级结构蛋白质三级结构疏水键、离子键、氢键和疏水键、离子键、氢键和 范德华力等。范德华力等。主要的化学键主要的化学键:整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中肽链中所有原子在三维空间的排布位置所有原子在三维空间的排布位置。（一）三级结构（一）三级结构定义：定义：肌红蛋白肌红蛋白(Mb)N 端端 C端端纤连蛋白分子的结构域纤连蛋白分子的结构域（二）结构域（二）结构域是三级结构层次上的局部折叠区是三级结构层次上的局部折叠区分子量较大的蛋白质常可折叠成多个结构较为紧分子量较大的蛋白质常可折叠成多个结构较为紧密的区域，并各行其功能，称为密的区域，并各行其功能，称为结构域结构域(domain)。（三）分子伴侣（三）分子伴侣参与蛋白质折叠参与蛋白质折叠分子伴侣分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。导其正确折叠。分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。重要的作用。伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用亚基之间的结合亚基之间的结合主要是氢键和离子键主要是氢键和离子键。四、四、含有二条以上多肽链的蛋白质具有四级结构含有二条以上多肽链的蛋白质具有四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基亚基(subunit)。由由2个个亚亚基基组组成成的的蛋蛋白白质质四四级级结结构构中中，若若亚亚基基分分子子结结构构相相同同，称称之之为为同同二二聚聚体体(homodimer)，若若亚亚基基分分子子结结构构不不同同，则则 称称 之之 为为 异异 二二 聚聚 体体(heterodimer)。血红蛋白的四级结构血红蛋白的四级结构五、蛋白质的分类五、蛋白质的分类n根据蛋白质组成成分根据蛋白质组成成分:单纯蛋白质单纯蛋白质结合蛋白质结合蛋白质=蛋白质部分蛋白质部分+非蛋白质部分非蛋白质部分n根据蛋白质形状根据蛋白质形状:纤维状蛋白质纤维状蛋白质球状蛋白质球状蛋白质六、蛋白质组学六、蛋白质组学（一）蛋白质组学基本概念（一）蛋白质组学基本概念蛋白质组是指一种细胞或一种生物所表达的全部蛋白质组是指一种细胞或一种生物所表达的全部蛋白质，即蛋白质，即“一种基因组所表达的全套蛋白质一种基因组所表达的全套蛋白质”。（二）蛋白质组学研究技术平台二）蛋白质组学研究技术平台 蛋白质组学是高通量，高效率的研究蛋白质组学是高通量，高效率的研究:双向电泳分离样品蛋白质双向电泳分离样品蛋白质 蛋白质点的定位、切取蛋白质点的定位、切取 蛋白质点的质谱分析蛋白质点的质谱分析（三）蛋白质组学研究的科学意义（三）蛋白质组学研究的科学意义蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系The Relation of Structure and Function of Protein第三节第三节（一）一级结构是空间构象的基础（一）一级结构是空间构象的基础一、一级结构一、一级结构是高级结构与功能的基础是高级结构与功能的基础构象构象：由于分子中的某个原子：由于分子中的某个原子(基团基团)绕绕C-C单键自由旋单键自由旋转而形成的转而形成的不同的暂时性的易变的不同的暂时性的易变的空间结构形式，不同空间结构形式，不同的构象之间可以相互转变，在各种构象形式中，势能最的构象之间可以相互转变，在各种构象形式中，势能最低、最稳定的构象是优势对象。低、最稳定的构象是优势对象。空间构象空间构象：蛋白质的三维结构。：蛋白质的三维结构。如果空间构象遭到破坏，只要如果空间构象遭到破坏，只要一级结构（一级结构（AA序列）未被序列）未被破坏破坏，就可能恢复原来的空间构象，功能亦可回复。，就可能恢复原来的空间构象，功能亦可回复。牛核糖核酸酶的一级结构牛核糖核酸酶的一级结构二二硫硫键键 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能构与功能胰胰岛素素 氨基酸残基序号氨基酸残基序号A5A6A10B30人人ThrSerIleThr猪猪ThrSerIleAla狗狗ThrSerIleAla兔兔ThrGlyIleSer牛牛AlaGlyValAla羊羊AlaSerValAla马ThrSerIleAla哺乳动物胰岛素氨基酸序列差异哺乳动物胰岛素氨基酸序列差异（三）（三）氨基酸序列提供重要的生物化学信息氨基酸序列提供重要的生物化学信息一些广泛存在于一些广泛存在于生物界的蛋白质如细生物界的蛋白质如细胞色素胞色素(cytochrome C)，比较它们的一级，比较它们的一级结构，可以帮助了解结构，可以帮助了解物种进化间的关系。物种进化间的关系。从从Cytc一级结构看生物进化一级结构看生物进化（四）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病（四）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病n例：镰刀形红细胞贫血例：镰刀形红细胞贫血N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-val his leu thr pro val glu C(146)“分子病分子病”：由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，：由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，成为分子病，病因是基因突变所致。成为分子病，病因是基因突变所致。n肌红蛋白肌红蛋白/血红蛋白血红蛋白含有血红素辅基含有血红素辅基血红素结构血红素结构 二、二、蛋白质的功能依赖特定空间结构蛋白质的功能依赖特定空间结构（一）（一）血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相似血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相似n肌红蛋白肌红蛋白(myoglobin，Mb)肌肌红红蛋蛋白白是是一一个个只只有有三三级级结结构构的的单单链链蛋蛋白白质质，有有8段段-螺螺旋结构。旋结构。血血红红素素分分子子中中的的两两个个丙丙酸酸侧侧链链以以离离子子键键形形式式与与肽肽链链中中的的两两个个碱碱性性氨氨基基酸酸侧侧链链上上的的正正电电荷荷相相连连，加加之之肽肽链链中中的的F8组组氨氨酸酸残残基基还还与与Fe2+形形成成配配位位结结合合，所所以以血血红红素素辅辅基基与与蛋蛋白白质质部部分分稳定结合稳定结合。n血红蛋白血红蛋白(hemoglobin，Hb)血血红红蛋蛋白白具具有有4个个亚亚基基组组成成的的四四级级结结构构，每每个个亚亚基基可可结结合合1个个血血红红素素并携带并携带1分子氧。分子氧。Hb亚亚基基之之间间通通过过8对对盐盐键键，使使4个个亚亚基基紧紧密密结结合合而而形形成成亲亲水水的的球球状状蛋白。蛋白。Hb各亚基的三级结构与各亚基的三级结构与Mb极为相似极为相似Hb与与Mb一一样样能能可可逆逆地地与与O2结结合合，Hb与与O2结结合合后后称称为为氧氧合合Hb。氧氧合合Hb占占总总Hb的的百百分分数数（称称百百分分饱饱和和度度）随随O2浓度变化而改变。浓度变化而改变。（二）血红蛋白亚基构象变化影响亚基与氧结合（二）血红蛋白亚基构象变化影响亚基与氧结合肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的的氧解离曲线氧解离曲线n协同效应协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为为协同效应协同效应。如果是促进作用则称为如果是促进作用则称为正协同效应正协同效应(positive cooperativity)如果是抑制作用则称为如果是抑制作用则称为负协同效应负协同效应(negative cooperativity)O2血血红红素素与与氧氧结结合合后后，铁铁原原子子半半径径变变小小，就就能能进进入入卟卟啉啉环环的的小小孔孔中中，继继而而引引起起肽肽链链位位置置的的变动。变动。n变构效应变构效应(allosteric effect)蛋蛋白白质质空空间间结结构构的的改改变变伴伴随随其其功功能能的的变变化化，称称为为变变构构效效应应。例例如如，一一个个氧氧分分子子与与Hb亚亚基基结结合合后后引引起起亚亚基基构构象象的的变变化，功能随之改变，化，功能随之改变，O2称为称为变构剂变构剂，Hb称为称为变构蛋白变构蛋白。（三）蛋白质构象改变（三）蛋白质构象改变可引起疾病可引起疾病蛋蛋白白质质构构象象疾疾病病：若若蛋蛋白白质质的的折折叠叠发发生生错错误误，尽尽管管其其一一级级结结构构不不变变，但但蛋蛋白白质质的的构构象象发发生生改改变变，仍仍可可影影响响其其功功能能，严严重重时时可可导导致疾病发生。致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病老年痴呆症、亨停顿舞蹈病疯牛病等。疯牛病等。疯牛病是由疯牛病是由朊病毒蛋白朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为为-折叠的折叠的PrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病n疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变掌握内容掌握内容n蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构：一级结构的定义，一级结构是蛋白质多样性的基础。一级结构的定义，一级结构是蛋白质多样性的基础。蛋白质的空间结构（二、三蛋白质的空间结构（二、三四级结构）的定义和要点四级结构）的定义和要点模体，结构域，协同效应等模体，结构域，协同效应等一级结构与功能的关系一级结构与功能的关系空间结构与功能的关系空间结构与功能的关系一级结构变异与分子病一级结构变异与分子病第四节第四节蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质The Physical and Chemical Characters of Protein一、一、蛋白质具有两性电离的性质蛋白质具有两性电离的性质蛋蛋白白质质分分子子除除两两端端的的氨氨基基和和羧羧基基可可解解离离外外，氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链中中某某些些基基团团，在在一一定定的的溶溶液液pH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。当当蛋蛋白白质质溶溶液液处处于于某某一一pHpH时时，蛋蛋白白质质解解离离成成正正、负负离离子子的的趋趋势势相相等等，即即成成为为兼兼性性离离子子，净净电电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pHpH称为称为蛋白质的等电点蛋白质的等电点。n蛋白质的等电点蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)二、蛋白质具有胶体性质二、蛋白质具有胶体性质蛋蛋白白质质属属于于生生物物大大分分子子之之一一，分分子子量量可可自自1万万至至100万万之之巨巨，其其分分子子的的直直径径可可达达1100nm，为为胶胶粒范围之内。粒范围之内。颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜n蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素:+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉三、蛋白质空间结构破坏而引起变性三、蛋白质空间结构破坏而引起变性在在某某些些物物理理和和化化学学因因素素作作用用下下，其其特特定定的的空空间间构构象象被被破破坏坏，也也即即有有序序的的空空间间结结构构变变成成无无序序的的空空间间结结构构，从从而而导导致致其其理理化化性性质质改改变变和和生生物活性的丧失。物活性的丧失。n蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)n造成变性的因素造成变性的因素:如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等重金属离子及生物碱试剂等。n变性的本质变性的本质:破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。n 应用举例应用举例:鸡蛋清煮熟后就是蛋白质变性鸡蛋清煮熟后就是蛋白质变性,鸡蛋清煮熟后就鸡蛋清煮熟后就可食用可食用,蛋清的病菌都杀死了蛋清的病菌都杀死了,而且口感好而且口感好,易吸易吸收收,脱敏脱敏;临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌;此外此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件剂（如疫苗等）的必要条件 若若蛋蛋白白质质变变性性程程度度较较轻轻，去去除除变变性性因因素素后后，蛋蛋白白质质仍仍可可恢恢复复或或部部分分恢恢复复其其原原有有的的构构象和功能，称为象和功能，称为复性复性(renaturation)。蛋白质沉淀蛋白质沉淀蛋白质凝固蛋白质凝固不可逆变性不可逆变性 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性蛋蛋白白变变性性后后，疏疏水水侧侧链链暴暴露露在在外外，肽肽链链融融汇汇相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出的现象相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出的现象变变性性的的蛋蛋白白质质易易于于沉沉淀淀，有有时时蛋蛋白白质质发发生生沉沉淀，但并不变性。淀，但并不变性。（变性蛋白一定沉淀吗？）变性蛋白一定沉淀吗？）蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。n蛋白质沉淀蛋白质沉淀n蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation)沉淀与变性的关系沉淀与变性的关系 变性的蛋白质不一定沉淀变性的蛋白质不一定沉淀 如如煮沸的牛奶，其中的酪蛋白已经变性，但并不沉淀。煮沸的牛奶，其中的酪蛋白已经变性，但并不沉淀。沉淀的蛋白质不一定变性沉淀的蛋白质不一定变性 如如盐析、低温下有机溶剂沉淀的蛋白质。盐析、低温下有机溶剂沉淀的蛋白质。凝固的蛋白质既沉淀又变性凝固的蛋白质既沉淀又变性 如如酸牛奶的酸牛奶的pH已接近有关蛋白质的已接近有关蛋白质的pI，一旦煮沸便蛋白，一旦煮沸便蛋白质开质开 始变性，蛋白质即结絮沉降下来始变性，蛋白质即结絮沉降下来 四、蛋白质四、蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰在紫外光谱区有特征性吸收峰由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此和色氨酸，因此在在280nm波长处有特征性吸收波长处有特征性吸收峰峰。蛋白质的。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因与其浓度呈正比关系，因此可作此可作蛋白质定量测定蛋白质定量测定。蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。反应。蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应双缩脲反应，双，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。五、应用蛋白质呈色反应可测定蛋白质溶液含量五、应用蛋白质呈色反应可测定蛋白质溶液含量1.茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction)2.双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction)补充补充n盐键盐键 又称盐桥或离子键，是蛋白质分子中又称盐桥或离子键，是蛋白质分子中正、负电正、负电荷的侧链基团互相接近，通过静电吸引而形成荷的侧链基团互相接近，通过静电吸引而形成的的，如羧基和氨基、胍基、咪唑基等基团之间，如羧基和氨基、胍基、咪唑基等基团之间的作用力。如，在近中性环境中，蛋白质分子的作用力。如，在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负电荷，而中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成离子键。间可形成离子键。共轭双键共轭双键n在近紫外光区（在近紫外光区（220-300nm）酪氨酸和色氨酸有吸）酪氨酸和色氨酸有吸收光的能力，因为它们的侧链含有苯环共轭双键系收光的能力，因为它们的侧链含有苯环共轭双键系统。酪氨酸的最大光吸收波长为统。酪氨酸的最大光吸收波长为275nm（苯酚基）、（苯酚基）、色氨酸为色氨酸为280nm（吲哚基）；（吲哚基）；n共轭双键是以共轭双键是以C=C-C=C为基本单位为基本单位，随着共轭度的，随着共轭度的增加，其紫外特性，最大吸收波长红移；增加，其紫外特性，最大吸收波长红移；n苯环是一个闭合的共轭体系，六个碳原子的苯环是一个闭合的共轭体系，六个碳原子的电子云电子云分布是一样的。分布是一样的。共轭效应会使苯环的电子云密度改共轭效应会使苯环的电子云密度改变，增加稳定性。变，增加稳定性。第五节第五节蛋白质的分离纯化与结构分析蛋白质的分离纯化与结构分析The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein一、一、透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的小分子化合物小分子化合物应用应用正压或离心力正压或离心力使蛋白质溶液透过有一使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。的目的。n透析透析(dialysis)n超滤法超滤法利用利用透析袋透析袋把大分子蛋白质与小分子化合把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法物分开的方法。透析袋及透析装置透析袋及透析装置超滤膜及超滤装置超滤膜及超滤装置二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质沉淀方法的蛋白质沉淀方法使用使用丙酮沉淀丙酮沉淀时，必须在时，必须在04低温下进行，低温下进行，丙酮用量一般丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。也可用乙醇沉淀。盐析盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。免疫沉淀法：免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。三、利用荷电性质可用电泳法将蛋白质分离三、利用荷电性质可用电泳法将蛋白质分离蛋蛋白白质质在在高高于于或或低低于于其其pI的的溶溶液液中中为为带带电电的的颗颗粒粒，在在电电场场中中能能向向正正极极或或负负极极移移动动。这这种种通通过过蛋蛋白白质质在在电电场场中中泳泳动动而而达达到到分分离离各各种种蛋蛋白白质质的的技技术术,称为称为电泳电泳(elctrophoresis)。根根据据支支撑撑物物的的不不同同，可可分分为为薄薄膜膜电电泳泳、凝凝胶胶电泳等。电泳等。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子，常用于蛋白质分子量的测定。量的测定。等电聚焦电泳等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。离蛋白质的电泳方法。双向凝胶电泳双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。是蛋白质组学研究的重要技术。n几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳:SDS-PAGE等电聚焦电泳等电聚焦电泳四、四、应用相分配或亲和原理可将蛋白质应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离进行层析分离待待分分离离蛋蛋白白质质溶溶液液（流流动动相相）经经过过一一个个固固态态物物质质（固固定定相相）时时，根根据据溶溶液液中中待待分分离离的的蛋蛋白白质质颗颗粒粒大大小小、电电荷荷多多少少及及亲亲和和力力等等，使使待待分分离离的的蛋蛋白白质质组组分分在在两两相相中中反反复复分分配配，并并以以不不同同速速度度流流经经固固定定相相而而达到分离蛋白质的目的。达到分离蛋白质的目的。n层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理离子交换层析离子交换层析:（Ion Exchange Chromatography简称为简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离上的