第二篇-第2章-抗体制药456节.ppt

第四节第四节 基因工程抗体和抗体工程基因工程抗体和抗体工程 抗体研究进展抗体研究进展抗体研究进展抗体研究进展3 3 3 3个阶段：个阶段：个阶段：个阶段：1890189018901890年年年年BehringBehring发现白喉抗毒发现白喉抗毒发现白喉抗毒发现白喉抗毒 素，特点：多克隆抗体；素，特点：多克隆抗体；素，特点：多克隆抗体；素，特点：多克隆抗体；1975197519751975年年年年KhlerKhler创建杂交瘤技术制创建杂交瘤技术制创建杂交瘤技术制创建杂交瘤技术制备单克隆抗体；备单克隆抗体；备单克隆抗体；备单克隆抗体；1994199419941994年年年年WinterWinter基因工程方法制备基因工程方法制备基因工程方法制备基因工程方法制备抗体。抗体。抗体。抗体。Winter等人建立了噬菌体抗体库，克服了人体等人建立了噬菌体抗体库，克服了人体不能随意免疫的缺点，不能随意免疫的缺点，用人的外周血制备抗体用人的外周血制备抗体文库文库，获得了人源性，获得了人源性基因工程抗体基因工程抗体。在此之前，基因工程抗体技术只能对已有的单体在此之前，基因工程抗体技术只能对已有的单体进行改造，而抗体库技术的诞生却可以不通过进行改造，而抗体库技术的诞生却可以不通过动物免疫和细胞融合便可以从抗体库中筛选得动物免疫和细胞融合便可以从抗体库中筛选得到全新的人源化的抗体，并通过细菌发酵或转到全新的人源化的抗体，并通过细菌发酵或转基因动植物生产出来。抗体库技术的发展使得基因动植物生产出来。抗体库技术的发展使得抗体工程技术进入了一个全新的时期。抗体工程技术进入了一个全新的时期。抗体库技术抗体库技术的生产与发展基础在于两项关的生产与发展基础在于两项关键技术的突破，一是键技术的突破，一是PCR技术技术的应用使得的应用使得人们可以利用一组引物扩增出全套免疫球人们可以利用一组引物扩增出全套免疫球蛋白的可变区的基因；二是从蛋白的可变区的基因；二是从大肠杆菌中大肠杆菌中直接表达直接表达出有功能活性的抗体分子片段。出有功能活性的抗体分子片段。基因原理基因原理是将某种动物的所有抗体可变区是将某种动物的所有抗体可变区的基因克隆在质粒或噬菌体载体中进行表的基因克隆在质粒或噬菌体载体中进行表达，分泌，然后通过特定的固相化抗原便达，分泌，然后通过特定的固相化抗原便可筛选出高度特异性抗体基因的克隆。该可筛选出高度特异性抗体基因的克隆。该抗体库又称全套抗体库或组合抗体库。抗体库又称全套抗体库或组合抗体库。用基因工程的方法可以用基因工程的方法可以将抗体基因的将抗体基因的克隆和表达融为一体克隆和表达融为一体，同在一种载，同在一种载体上进行，将抗体基因表达在载体体上进行，将抗体基因表达在载体的表面，用固相化抗原对表达产物的表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，在数日内就可筛的载体进行淘筛，在数日内就可筛选出阳性克隆。选出阳性克隆。一、噬菌体抗体库技术的一、噬菌体抗体库技术的一、噬菌体抗体库技术的一、噬菌体抗体库技术的基本方法基本方法基本方法基本方法 获取目的基因（获取目的基因（获取目的基因（获取目的基因（RT-PCRRT-PCR）抗体库技术的载体抗体库技术的载体抗体库技术的载体抗体库技术的载体（噬菌粒（噬菌粒（噬菌粒（噬菌粒phagemidphagemid为载体）为载体）为载体）为载体）具有噬菌体与质具有噬菌体与质具有噬菌体与质具有噬菌体与质粒特点、转化效率高、库容量大粒特点、转化效率高、库容量大粒特点、转化效率高、库容量大粒特点、转化效率高、库容量大 淘筛淘筛淘筛淘筛抗原固相化后，对噬菌粒群的吸附、洗抗原固相化后，对噬菌粒群的吸附、洗抗原固相化后，对噬菌粒群的吸附、洗抗原固相化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增。涤和洗脱后再感染扩增。涤和洗脱后再感染扩增。涤和洗脱后再感染扩增。表达与鉴定表达与鉴定表达与鉴定表达与鉴定 （Western blotWestern blot）噬菌体抗体库的技术流程噬菌体抗体库的技术流程采集淋巴细胞，杂交瘤细胞株等采集淋巴细胞，杂交瘤细胞株等提取提取mRNART-PCR获得获得VH，VL基因基因构建分别表达构建分别表达VH，VL的载体的载体扩增后克隆至同一噬菌体扩增后克隆至同一噬菌体转化至大肠杆菌转化至大肠杆菌或其他表达系统或其他表达系统筛选特异性抗体并富集筛选特异性抗体并富集抗体的体外亲和力成熟抗体的体外亲和力成熟二、噬菌体抗体库技术的特点二、噬菌体抗体库技术的特点 模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库抗体文库可以达到或超过抗体文库可以达到或超过抗体文库可以达到或超过抗体文库可以达到或超过10101111库容，所以能包库容，所以能包库容，所以能包库容，所以能包含含含含BB细胞全部克隆细胞全部克隆细胞全部克隆细胞全部克隆 避开了人工免疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术可以调出任意抗体基因可以调出任意抗体基因可以调出任意抗体基因可以调出任意抗体基因 可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体 抗体基因来自人体抗体基因来自人体抗体基因来自人体抗体基因来自人体三、基因工程抗体表达三、基因工程抗体表达三、基因工程抗体表达三、基因工程抗体表达 原核细胞表达原核细胞表达原核细胞表达原核细胞表达（大肠杆菌）（大肠杆菌）（大肠杆菌）（大肠杆菌）真核细胞表达真核细胞表达真核细胞表达真核细胞表达 （酵母菌）（酵母菌）（酵母菌）（酵母菌）转基因植物表达转基因植物表达转基因植物表达转基因植物表达（烟草烟草烟草烟草）转基因动物表达转基因动物表达转基因动物表达转基因动物表达（鼠）（鼠）（鼠）（鼠）第五节第五节 抗体诊断试剂抗体诊断试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的诊断和血原型，主要用于疾病的病原菌的诊断和血原型，主要用于疾病的病原菌的诊断和血原型，主要用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定型鉴定型鉴定型鉴定。常用的方法是凝集反应。常用的方法是凝集反应。常用的方法是凝集反应。常用的方法是凝集反应。鉴定病原菌的抗体试剂鉴定病原菌的抗体试剂鉴定病原菌的抗体试剂鉴定病原菌的抗体试剂 常用诊断血清的品种和用途常用诊断血清的品种和用途常用诊断血清的品种和用途常用诊断血清的品种和用途 沙门氏菌属诊断血清沙门氏菌属诊断血清沙门氏菌属诊断血清沙门氏菌属诊断血清 志贺氏菌属诊断血清志贺氏菌属诊断血清志贺氏菌属诊断血清志贺氏菌属诊断血清 病原性大肠埃希氏菌诊断血清病原性大肠埃希氏菌诊断血清病原性大肠埃希氏菌诊断血清病原性大肠埃希氏菌诊断血清 诊断血清的制备步骤诊断血清的制备步骤制备细菌抗原制备细菌抗原免疫动物和制备抗体血清免疫动物和制备抗体血清 诊断血清诊断方法诊断血清诊断方法直接凝集直接凝集反应反应 乙型肝炎病毒表面抗原的乙型肝炎病毒表面抗原的乙型肝炎病毒表面抗原的乙型肝炎病毒表面抗原的 反向被动血凝诊断试剂反向被动血凝诊断试剂反向被动血凝诊断试剂反向被动血凝诊断试剂 妊娠诊断试剂妊娠诊断试剂妊娠诊断试剂妊娠诊断试剂 抗抗抗抗ABOABO血型系统血清血型系统血清血型系统血清血型系统血清二、免疫标记技术用的抗体类试剂二、免疫标记技术用的抗体类试剂二、免疫标记技术用的抗体类试剂二、免疫标记技术用的抗体类试剂能将抗原抗体反应放大，使常规方法不能将抗原抗体反应放大，使常规方法不能将抗原抗体反应放大，使常规方法不能将抗原抗体反应放大，使常规方法不能观察的反应得以显现，因而大幅度能观察的反应得以显现，因而大幅度能观察的反应得以显现，因而大幅度能观察的反应得以显现，因而大幅度提高抗原抗体反应的敏感性，用于对提高抗原抗体反应的敏感性，用于对提高抗原抗体反应的敏感性，用于对提高抗原抗体反应的敏感性，用于对微量抗原物质进行定性或定量检测。微量抗原物质进行定性或定量检测。微量抗原物质进行定性或定量检测。微量抗原物质进行定性或定量检测。荧光抗体诊断试剂荧光抗体诊断试剂荧光抗体诊断试剂荧光抗体诊断试剂 荧光抗体的制备荧光抗体的制备荧光抗体的制备荧光抗体的制备 免疫荧光测定方法免疫荧光测定方法免疫荧光测定方法免疫荧光测定方法 免疫酶抗体诊断试剂免疫酶抗体诊断试剂 免疫酶染色法用抗体诊断试剂免疫酶染色法用抗体诊断试剂 酶免疫测定用抗体诊断试剂酶免疫测定用抗体诊断试剂 HBsAg酶标诊断试剂酶标诊断试剂 HBeAg酶标诊断试剂酶标诊断试剂HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）（甲型肝炎病毒抗原）酶标诊断试剂酶标诊断试剂测定测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗（人免疫缺陷病毒）抗 原的酶标抗体诊断试剂原的酶标抗体诊断试剂甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFP）酶标抗体诊）酶标抗体诊 断试剂断试剂癌胚抗原（癌胚抗原（CEA）的酶标抗体）的酶标抗体 诊断试剂诊断试剂 放射免疫用抗体诊断试剂放射免疫用抗体诊断试剂 放射免疫技术放射免疫技术是将放射性核素分是将放射性核素分析的高度灵敏性与抗原抗体反应析的高度灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合起来建立的检测技的特异性结合起来建立的检测技术。术。放射性核素标记抗体的方法：放射性核素标记抗体的方法：氯胺氯胺-T法法 Iodogen氏法氏法抗原的测定有：抗原的测定有：抗原的测定有：抗原的测定有：夹心法夹心法夹心法夹心法间接法间接法间接法间接法竟争法竟争法竟争法竟争法常用标记抗体试剂有常用标记抗体试剂有常用标记抗体试剂有常用标记抗体试剂有 HBsAgHBsAg放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体 诊断试剂诊断试剂诊断试剂诊断试剂HBeAg放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体 诊断试剂诊断试剂HIV抗原放射性核素标记抗体抗原放射性核素标记抗体 诊断试剂诊断试剂AFP放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体 诊断试剂诊断试剂CEA放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体 诊断试剂诊断试剂三、导向诊断药物三、导向诊断药物三、导向诊断药物三、导向诊断药物 放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体 肿瘤放射免疫显像肿瘤放射免疫显像肿瘤放射免疫显像肿瘤放射免疫显像 放射免疫显像优点：放射免疫显像优点：放射免疫显像优点：放射免疫显像优点：在体内确切肿瘤定位作用，准确在体内确切肿瘤定位作用，准确在体内确切肿瘤定位作用，准确在体内确切肿瘤定位作用，准确性达性达性达性达90%90%，灵敏度达，灵敏度达，灵敏度达，灵敏度达100%100%。在体内可检出在体内可检出在体内可检出在体内可检出0.5cm0.5cm大小大小大小大小的病灶，的病灶，的病灶，的病灶，并可检出肺、脑的转移灶。并可检出肺、脑的转移灶。并可检出肺、脑的转移灶。并可检出肺、脑的转移灶。小分子抗体小分子抗体小分子抗体小分子抗体易到达肿瘤部位，易到达肿瘤部位，易到达肿瘤部位，易到达肿瘤部位，可显著提高可显著提高可显著提高可显著提高T/NTT/NT值。值。值。值。抗体在肿瘤部位可保留抗体在肿瘤部位可保留抗体在肿瘤部位可保留抗体在肿瘤部位可保留6 6 6 69 9 9 9日日日日能观擦抗体在血中的半衰期和能观擦抗体在血中的半衰期和能观擦抗体在血中的半衰期和能观擦抗体在血中的半衰期和 可能出现的不良反应。可能出现的不良反应。可能出现的不良反应。可能出现的不良反应。放射免疫显像定位技术放射免疫显像定位技术 将抗肿瘤单克隆抗体（将抗肿瘤单克隆抗体（McAb）与二乙基）与二乙基三胺五乙酸（三胺五乙酸（DTPA）在体外偶联成）在体外偶联成McAb-DTPA，再注入体内后，就能与体，再注入体内后，就能与体内组织相结合。内组织相结合。3天后注入放射性核素天后注入放射性核素In-113M（半衰期（半衰期100m），因），因DTPA是重是重金属离子络合剂，所以金属离子络合剂，所以In-113M可以结合可以结合到到DTPA分子上，使肿瘤组织显像。这一分子上，使肿瘤组织显像。这一过程在过程在2小时内可完成。小时内可完成。建立预定位技术需解决建立预定位技术需解决建立预定位技术需解决建立预定位技术需解决3 3 3 3个问题：个问题：个问题：个问题：抗体在肿瘤组织滞留要抗体在肿瘤组织滞留要抗体在肿瘤组织滞留要抗体在肿瘤组织滞留要7 7天以上天以上天以上天以上;在肿瘤在肿瘤在肿瘤在肿瘤组织内的量要满足显像要求。组织内的量要满足显像要求。组织内的量要满足显像要求。组织内的量要满足显像要求。Ab-DTPAAb-DTPA偶联物比较稳定。偶联物比较稳定。偶联物比较稳定。偶联物比较稳定。内源性金属离子对内源性金属离子对内源性金属离子对内源性金属离子对DTPADTPA的封闭的封闭的封闭的封闭作用要小。作用要小。作用要小。作用要小。第六节第六节第六节第六节 抗体治疗药物抗体治疗药物抗体治疗药物抗体治疗药物以抗体为载体的导向治疗药物，还不成熟。以抗体为载体的导向治疗药物，还不成熟。以抗体为载体的导向治疗药物，还不成熟。以抗体为载体的导向治疗药物，还不成熟。治疗用的制剂尚未达到商品化程度。障治疗用的制剂尚未达到商品化程度。障治疗用的制剂尚未达到商品化程度。障治疗用的制剂尚未达到商品化程度。障碍：分子量大，排斥反应碍：分子量大，排斥反应碍：分子量大，排斥反应碍：分子量大，排斥反应一、放射性核素标记的抗体治疗药物一、放射性核素标记的抗体治疗药物一、放射性核素标记的抗体治疗药物一、放射性核素标记的抗体治疗药物抗体作为放射性核素的导向载体，标记操抗体作为放射性核素的导向载体，标记操抗体作为放射性核素的导向载体，标记操抗体作为放射性核素的导向载体，标记操作简便、用量小。放射性核素标记的抗作简便、用量小。放射性核素标记的抗作简便、用量小。放射性核素标记的抗作简便、用量小。放射性核素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大。体对肿瘤细胞杀伤较大。体对肿瘤细胞杀伤较大。体对肿瘤细胞杀伤较大。二、抗癌药物偶联的抗体药物二、抗癌药物偶联的抗体药物二、抗癌药物偶联的抗体药物二、抗癌药物偶联的抗体药物 常用的抗癌药物常用的抗癌药物常用的抗癌药物常用的抗癌药物 氨甲喋呤（氨甲喋呤（氨甲喋呤（氨甲喋呤（MTXMTX）、阿霉素）、阿霉素）、阿霉素）、阿霉素（ADMADM）、丝裂霉素（）、丝裂霉素（）、丝裂霉素（）、丝裂霉素（MMCMMC）、环）、环）、环）、环磷酰胺（磷酰胺（磷酰胺（磷酰胺（CTXCTX）等。以人）等。以人）等。以人）等。以人血清白蛋白血清白蛋白血清白蛋白血清白蛋白作为中间载体，可明显提高每分子抗作为中间载体，可明显提高每分子抗作为中间载体，可明显提高每分子抗作为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的体所携带的体所携带的体所携带的MTXMTX量，使体外细胞毒性量，使体外细胞毒性量，使体外细胞毒性量，使体外细胞毒性提高提高提高提高2 2倍。倍。倍。倍。抗体类药物逆转耐药性抗体类药物逆转耐药性抗体类药物逆转耐药性抗体类药物逆转耐药性 肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药性（药性（药性（药性（MDRMDR）。）。）。）。MDRMDR是由基因调控的，其编码蛋白是由基因调控的，其编码蛋白是由基因调控的，其编码蛋白是由基因调控的，其编码蛋白称为称为称为称为P P糖蛋白，其中糖蛋白，其中糖蛋白，其中糖蛋白，其中P170P170是与肿瘤是与肿瘤是与肿瘤是与肿瘤耐药相关的主要蛋白，由耐药相关的主要蛋白，由耐药相关的主要蛋白，由耐药相关的主要蛋白，由Mdr1Mdr1基因基因基因基因编码，编码，编码，编码，12801280个氨基酸残基，相对分个氨基酸残基，相对分个氨基酸残基，相对分个氨基酸残基，相对分子质量子质量子质量子质量170180K170180K的跨膜蛋白。的跨膜蛋白。的跨膜蛋白。的跨膜蛋白。耐药性产生的机理耐药性产生的机理P蛋白蛋白是是ATP酶依赖性药泵，药酶依赖性药泵，药物进入细胞后与物进入细胞后与P蛋白结合，蛋白结合，利用利用ATP水解释放的能量将药水解释放的能量将药物泵出胞外，使胞内药物蓄积物泵出胞外，使胞内药物蓄积减少，因而产生减少，因而产生耐药性耐药性。三、毒素偶联的抗体药物三、毒素偶联的抗体药物三、毒素偶联的抗体药物三、毒素偶联的抗体药物 免疫毒素及其换代制品免疫毒素及其换代制品免疫毒素及其换代制品免疫毒素及其换代制品 在导向药物中，毒素和抗体的交联在导向药物中，毒素和抗体的交联在导向药物中，毒素和抗体的交联在导向药物中，毒素和抗体的交联物称为物称为物称为物称为免疫毒素免疫毒素免疫毒素免疫毒素。第一代免疫毒素是包含有第一代免疫毒素是包含有第一代免疫毒素是包含有第一代免疫毒素是包含有AA、BB链链链链完整毒素和抗体的交联物，其中完整毒素和抗体的交联物，其中完整毒素和抗体的交联物，其中完整毒素和抗体的交联物，其中BB链的链的链的链的非特异性结合，使其仅能在体外应用。非特异性结合，使其仅能在体外应用。非特异性结合，使其仅能在体外应用。非特异性结合，使其仅能在体外应用。第二代免疫毒素第二代免疫毒素是利用抗体或抗是利用抗体或抗体片段与毒素的体片段与毒素的A链或与链或与A链作用链作用相似的单链核糖体失活蛋白的结相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。因避免了第一代免疫毒素合物。因避免了第一代免疫毒素的非特异性，故能在体内有一定的非特异性，故能在体内有一定的抗肿瘤作用。的抗肿瘤作用。第三代免疫毒素第三代免疫毒素是重组免疫毒素，用基因是重组免疫毒素，用基因重组技术改造毒素基因，去除非特异性重组技术改造毒素基因，去除非特异性结合部位，明显降低了毒性反应。改造结合部位，明显降低了毒性反应。改造的毒素基因与小分子抗体基因重组后进的毒素基因与小分子抗体基因重组后进行表达，所以，特异性好、稳定性强、行表达，所以，特异性好、稳定性强、渗透性佳、免疫原性低。渗透性佳、免疫原性低。免疫毒素的制备方法免疫毒素的制备方法毒素的来源：毒素的来源：细菌毒素细菌毒素 植物毒素植物毒素载体的种类载体的种类载体主要作用是将毒素携带至靶细胞表面，载体主要作用是将毒素携带至靶细胞表面，并与其结合，使毒素进入细胞内起作用。并与其结合，使毒素进入细胞内起作用。主要有：主要有：小分子抗体小分子抗体FV或或SCFV细胞生长因子细胞生长因子激素激素CD4 制备方法制备方法 先克隆毒素基因，再利用基因重先克隆毒素基因，再利用基因重组技术去除毒素中非特异性细胞结合组技术去除毒素中非特异性细胞结合部位基因。经改造的毒素基因再与载部位基因。经改造的毒素基因再与载体基因体基因cDNA重组，转入受体菌中表重组，转入受体菌中表达，形成融合蛋白，再经过纯化就得达，形成融合蛋白，再经过纯化就得到重组免疫毒素。到重组免疫毒素。免疫毒素的临床应用免疫毒素的临床应用 治疗肿瘤、自身免疫病、并能克复组治疗肿瘤、自身免疫病、并能克复组织移植排斥反应。由于重组免疫毒织移植排斥反应。由于重组免疫毒素是在胞浆物质代谢中发挥作用，素是在胞浆物质代谢中发挥作用，相对分子质量又小，渗透力强，所相对分子质量又小，渗透力强，所以效果好。以效果好。随着技术的进步，越来越多的抗体走向临床，随着技术的进步，越来越多的抗体走向临床，成为攻克疾病的有力武器。根据互联网成为攻克疾病的有力武器。根据互联网（http:/）的资料统计（）的资料统计（2000年），在年），在369种进行临床研究（种进行临床研究（pipeline）的生物药品中，）的生物药品中，抗体就占了抗体就占了59种，是除疫苗以外种类最多的。种，是除疫苗以外种类最多的。抗体可变区序列的多样性决定其结合抗原的抗体可变区序列的多样性决定其结合抗原的特异性，因而比较容易形成自己的专利，比特异性，因而比较容易形成自己的专利，比其他产品有更广阔的开发余地。其他产品有更广阔的开发余地。第四章第四章 抗体制药思考题（抗体制药思考题（2）1 1、建立噬菌体抗体库的基本方法是什、建立噬菌体抗体库的基本方法是什么？请列出建立噬菌体抗体库的技么？请列出建立噬菌体抗体库的技术流程术流程2 2、耐药性产生的机理是什么？、耐药性产生的机理是什么？3 3、常用的抗体诊断试剂和抗体治疗药、常用的抗体诊断试剂和抗体治疗药物分别有哪几类？物分别有哪几类？细胞壁细胞壁细胞膜细胞膜细胞膜细胞膜细胞质细胞质细胞质细胞质核糖体核糖体核糖体核糖体细胞核细胞核核膜核膜核仁核仁线粒体线粒体核区核区原原核核细细胞胞真真核核细细胞胞原原核核细细胞胞和和真真核核细细胞胞的的模模式式结结构构植物细胞模式图植物细胞模式图动物细胞结构图动物细胞结构图自学内容自学内容动物细胞制药动物细胞制药植物细胞制药植物细胞制药生物药物的分离纯化技术生物药物的分离纯化技术