第六章微生物的生长与控制.ppt

第六章 微生物的生长与控制【知识目标知识目标知识目标知识目标】1.了解微生物生长的概念。2.理解环境条件对微生物生长的影响和控制方法，工业上常用的微生物培养技术。3.掌握几种常用的微生物生长量的测定方法，微生物的生长曲线及对生产实践的指导意义，微生物的诱变育种和常用的微生物菌种保藏的方法。【技能目标技能目标技能目标技能目标】1.能够运用微生物生长量的相关理论知识，完成微生物生长量的测定。2.能够运用微生物生长规律的相关理论知识，完成微生物生长曲线的绘制，并学会如何运用微生物的生长曲线来指导生产实践。3.能够运用微生物菌种保藏的相关知识，完成生产菌种的保藏工作。第一节第一节 微生物的生长微生物的生长一、微生物生长的概念一、微生物生长的概念一、微生物生长的概念一、微生物生长的概念n n微生物生长是细胞物质有规律地、不可逆增加，导致细胞体积增大的微生物生长是细胞物质有规律地、不可逆增加，导致细胞体积增大的生物学过程，这是微生物个体生长的定义。生物学过程，这是微生物个体生长的定义。n n当微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方当微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起个体数量增加，这是微生物的繁殖。式产生新的生命个体，即引起个体数量增加，这是微生物的繁殖。n n由于微生物个体微小，生长与繁殖这两个过程是紧密联系又很难划分由于微生物个体微小，生长与繁殖这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。因此在讨论微生物生长时，往往将这两个过程放在一起讨论，的过程。因此在讨论微生物生长时，往往将这两个过程放在一起讨论，这样微生物生长又可以定义为在一定时间和条件下细胞数量的增加，这样微生物生长又可以定义为在一定时间和条件下细胞数量的增加，这是微生物群体生长的定义。这是微生物群体生长的定义。二、微生物生长量的测定二、微生物生长量的测定（一）微生物细胞数目的测定方法（一）微生物细胞数目的测定方法1 1细胞总数计数法细胞总数计数法 细胞总数计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种细胞总数计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般包括显微镜直接计数法、涂片计数法和比浊法。方法。一般包括显微镜直接计数法、涂片计数法和比浊法。n n （1 1）显微镜直接计数法）显微镜直接计数法 这类方法是利用特定的血球计数板，在显微镜下计算一定容这类方法是利用特定的血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。积里样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。图6-1血球计数板和血球计数板计数网的分区和分格血球计数板是一块特制的载玻片（如图6-1），上面有特定面积（1mm2）和高度（0.1mm）的计数室，在1mm2的面积里又被刻划成25个（或16个）中格，每个中格进一步划分成16个（或25个）小格，但整个计数室都是由400个小格组成。n n将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计算下计算4 45 5个中格的菌体总数，并求出每个小格所含菌体个中格的菌体总数，并求出每个小格所含菌体的平均数，再按下面公式求出每毫升样品所含的菌体数。的平均数，再按下面公式求出每毫升样品所含的菌体数。n n（2 2）涂片计数法）涂片计数法 用计数板附带的用计数板附带的0.01mL0.01mL吸管，吸取定量稀释的细菌悬液，放置刻有吸管，吸取定量稀释的细菌悬液，放置刻有1cm1cm2 2面积的玻片上，使菌液均匀地涂布在面积的玻片上，使菌液均匀地涂布在1cm1cm2 2面积上，固定后染色，在显微面积上，固定后染色，在显微镜下任意选择几个乃至十几个视野来计算细胞数量。根据计算出的视野面镜下任意选择几个乃至十几个视野来计算细胞数量。根据计算出的视野面积核算出积核算出1cm1cm2 2中的菌数，然后按中的菌数，然后按1cm1cm2 2面积上的菌液量和稀释度，计算每面积上的菌液量和稀释度，计算每毫升原液中的含菌数。毫升原液中的含菌数。每毫升原菌液的含菌数视野中的平均菌数1cm2/视野面积100稀释倍数图6-3涂布平板法和倒平板法（3 3）滤膜过滤法）滤膜过滤法当待测样品中菌数很低时，可以将样品通过膜过滤器（如图当待测样品中菌数很低时，可以将样品通过膜过滤器（如图6-46-4），然），然后将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。后将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。图6-4滤膜过滤法测定微生物生长的相关生理指标，也可以间接的反应出微生物的生长量，测定微生物生长的相关生理指标，也可以间接的反应出微生物的生长量，常用以下方法来测定。常用以下方法来测定。1 1重量法重量法此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长量的测定。多细胞以及丝状体微生物生长量的测定。将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，离心后直将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，离心后直接称重，求出湿重。如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间接称重，求出湿重。如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将的自由水，再称重求出湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105105烘干至恒重，取出放入干烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。一般说来，干重为湿重的燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。一般说来，干重为湿重的10%10%20%20%。（二）微生物生理指标的测定方法（二）微生物生理指标的测定方法2 2体积测量法体积测量法体积测量法又称测菌丝浓度法。通过测定一定体积体积测量法又称测菌丝浓度法。通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。具体方法是取一定量的待测培养液（如具体方法是取一定量的待测培养液（如10mL10mL）放）放在有刻度的离心管中（如图在有刻度的离心管中（如图6-56-5），设定一定的离），设定一定的离心时间（如心时间（如5min5min）和转速（如）和转速（如5000rpm5000rpm），离），离心后，倒出上清液，测出上清液体积为心后，倒出上清液，测出上清液体积为V V，则菌丝，则菌丝浓度为（浓度为（10-V10-V）/10/10。菌丝浓度测定法是大规模。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产中测定微生物生长量的一个重要监测工业发酵生产中测定微生物生长量的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。图6-5刻度离心管3 3测定菌种细胞内化学成分测定菌种细胞内化学成分测定菌种细胞内化学成分的方法较复杂，操作困难，但较准确，菌种测定菌种细胞内化学成分的方法较复杂，操作困难，但较准确，菌种细胞内化学成分的多少，可反映出群体中菌体数量的多少。细胞内化学成分的多少，可反映出群体中菌体数量的多少。（1 1）测定含氮量）测定含氮量微生物细胞的含氮量一般比较稳定，所以常作为生长量的指标，大多微生物细胞的含氮量一般比较稳定，所以常作为生长量的指标，大多数细菌的含氮量为其干重的数细菌的含氮量为其干重的12.512.5，酵母菌为，酵母菌为7.57.5，霉菌为，霉菌为6.06.0。根据其含氮量再乘以根据其含氮量再乘以6.256.25，即可测得其粗蛋白的含量（包括了杂环氮，即可测得其粗蛋白的含量（包括了杂环氮和氧化型氮）。细菌中蛋白质含量占细菌固形物的和氧化型氮）。细菌中蛋白质含量占细菌固形物的50%50%80%80%，一般，一般以以65%65%为代表，因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式为代表，因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式计算：计算：（2 2）氨基氮的测定）氨基氮的测定 具体方法是离心发酵液，取上清液，加入甲基红和盐酸作指示剂，加具体方法是离心发酵液，取上清液，加入甲基红和盐酸作指示剂，加入入0.02N0.02N的的NaOHNaOH调色至颜色刚刚褪去，加入上清液调色至颜色刚刚褪去，加入上清液18%18%的中性甲醛，反的中性甲醛，反应片刻，加入应片刻，加入0.02N0.02N的的NaOHNaOH使之变色，根据使之变色，根据NaOHNaOH的用量折算出氨基氮的用量折算出氨基氮的含量。根据培养液中氨基氮的含量，可间接反映微生物的生长状况。的含量。根据培养液中氨基氮的含量，可间接反映微生物的生长状况。（3 3）其他生理物质的测定）其他生理物质的测定 P P、DNADNA、RNARNA、ATPATP、NAMNAM（乙酰胞壁酸）等含量以及产酸、产气、（乙酰胞壁酸）等含量以及产酸、产气、产产COCO2 2（用标记葡萄糖做基质）、耗氧、黏度、产热等指标，都可用于生（用标记葡萄糖做基质）、耗氧、黏度、产热等指标，都可用于生长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化、最终产气量、微生物长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化、最终产气量、微生物活性等方面的测定反映微生物的生长。活性等方面的测定反映微生物的生长。（4 4）商业化快速微生物检测法）商业化快速微生物检测法微生物检测的发展方向是快速、准微生物检测的发展方向是快速、准确、简便、自动化，当前很多生物确、简便、自动化，当前很多生物制品公司利用传统微生物检测原理，制品公司利用传统微生物检测原理，结合不同的检测方法，设计了形式结合不同的检测方法，设计了形式各异的微生物检测仪器设备，这些各异的微生物检测仪器设备，这些仪器设备正逐步应用于医学微生物仪器设备正逐步应用于医学微生物检测和科学研究领域。例如全自动检测和科学研究领域。例如全自动微生物快速检测系统（如图微生物快速检测系统（如图6-66-6）可）可以在数小时内获得监测结果，样本以在数小时内获得监测结果，样本颜色及光学特征都不影响读数，对颜色及光学特征都不影响读数，对酵母菌和霉菌检测同样具有高度敏酵母菌和霉菌检测同样具有高度敏感。感。图6-6全自动微生物快速检测系统 对于丝状微生物，特别是丝状真对于丝状微生物，特别是丝状真菌，通常是通过测定菌丝的长度变菌，通常是通过测定菌丝的长度变化来反映它们的生长速率，主要采化来反映它们的生长速率，主要采用的有如下几种方法。用的有如下几种方法。1 1培养基表面菌体生长速率测培养基表面菌体生长速率测定法定法 培养基表面菌体生长速率测定法主培养基表面菌体生长速率测定法主要测定一定时间内在琼脂培养基表要测定一定时间内在琼脂培养基表面菌落直径的增加值。一般采用载面菌落直径的增加值。一般采用载玻片培养法，方法如图玻片培养法，方法如图6-76-7。图6-7载玻片培养法（三）菌丝长度的测定方法2 2培养料中菌体生长速率测定法培养料中菌体生长速率测定法 主要测定一定时间内在固体培养料中菌丝体向主要测定一定时间内在固体培养料中菌丝体向前延伸的距离。这种方法常用于食用菌菌丝体前延伸的距离。这种方法常用于食用菌菌丝体生长速率的测定。生长速率的测定。3 3单个菌丝顶端生长速率测定法单个菌丝顶端生长速率测定法具体操作是将待测菌株点植接种于培养基平板具体操作是将待测菌株点植接种于培养基平板的中心，生长一定时间后，将平板置于显微镜的中心，生长一定时间后，将平板置于显微镜载物台上，同时校对所用显微镜的目镜测微尺，载物台上，同时校对所用显微镜的目镜测微尺，并计算每一格的长度。在菌落边缘选择单根菌并计算每一格的长度。在菌落边缘选择单根菌丝的顶端在低倍镜下聚焦。然后将目镜测微尺丝的顶端在低倍镜下聚焦。然后将目镜测微尺与菌丝平行，并选择菌丝开始出现侧枝的部位与菌丝平行，并选择菌丝开始出现侧枝的部位与目镜测微尺上的一条刻度线重合，这个点即与目镜测微尺上的一条刻度线重合，这个点即为为“参照点参照点”，每隔一定时间测量一次菌丝生，每隔一定时间测量一次菌丝生长的长度。长的长度。图6-8霉菌菌丝生长（图中的数字为分钟）第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律 研究微生物的生长规律，需要从研究微生物的个体生研究微生物的生长规律，需要从研究微生物的个体生长和群体生长两个方面着手。长和群体生长两个方面着手。一、微生物的个体生长和同步生长一、微生物的个体生长和同步生长一、微生物的个体生长和同步生长一、微生物的个体生长和同步生长 以细菌为例介绍微生物的个体生长和同步生长。以细菌为例介绍微生物的个体生长和同步生长。目前对细菌的个体生长进行研究主要有两种方法。目前对细菌的个体生长进行研究主要有两种方法。n n一是利用电子显微镜观察细胞的超薄切片；一是利用电子显微镜观察细胞的超薄切片；n n二是采用同步培养方法。二是采用同步培养方法。n n同步培养能使群体中处于个体生长的不同阶段细同步培养能使群体中处于个体生长的不同阶段细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。n n以同步培养方法使群体细胞能够处于同一生长阶以同步培养方法使群体细胞能够处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式称为同步生长。段，并同时进行分裂的生长方式称为同步生长。n n同步培养细胞常被用来研究在单个细胞上难以研同步培养细胞常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。是一种理想的材料。同步培养方法很多，可归纳为同步培养方法很多，可归纳为机械法与环境条件控制法两类。机械法与环境条件控制法两类。1 1机械法机械法 这是一类根据微生物细胞在这是一类根据微生物细胞在不同生长阶段的细胞体积和质不同生长阶段的细胞体积和质量不同或根据它们同某种材料量不同或根据它们同某种材料结合不同的原理设计出来的方结合不同的原理设计出来的方法。其中常用的有以下几种方法。其中常用的有以下几种方法。法。n n（1 1）离心方法）离心方法 n n（2 2）过滤分离法）过滤分离法n n（3 3）硝酸纤维素滤膜法）硝酸纤维素滤膜法图6-9机械法获得细胞同步培养a、硝酸纤维素滤膜法b、离心法2 2环境条件控制技术环境条件控制技术n n这类技术是根据细菌生长与分裂对环境因子要求不同的原理设计的一类获得同步这类技术是根据细菌生长与分裂对环境因子要求不同的原理设计的一类获得同步细胞的方法。细胞的方法。n n （1 1）温度：最适生长温度有利于细菌生长与分裂，不适宜温度如低温不利于）温度：最适生长温度有利于细菌生长与分裂，不适宜温度如低温不利于细菌生长与分裂。通过适宜与不适宜温度的交替处理之后，通过培养可获得同步细菌生长与分裂。通过适宜与不适宜温度的交替处理之后，通过培养可获得同步细胞。细胞。n n （2 2）培养基成分控制：培养基中的碳、氮源或生长因子不足，可导致细菌缓）培养基成分控制：培养基中的碳、氮源或生长因子不足，可导致细菌缓慢生长直至生长停止。因此将不同步的细菌在营养不足的条件下培养一段时间，慢生长直至生长停止。因此将不同步的细菌在营养不足的条件下培养一段时间，然后转移到营养丰富的培养基里培养，能获得同步细胞。另外也可以将不同步的然后转移到营养丰富的培养基里培养，能获得同步细胞。另外也可以将不同步的细胞转接到含有一定浓度的、能抑制蛋白质等生物大分子合成的化学物质如抗生细胞转接到含有一定浓度的、能抑制蛋白质等生物大分子合成的化学物质如抗生素等的培养基里，培养一段时间后，再转接到完全培养基里培养也能获得同步细素等的培养基里，培养一段时间后，再转接到完全培养基里培养也能获得同步细胞。胞。n n环境条件控制获得同步细胞的机理不完全了解。这种处理可能是导致细胞内某些环境条件控制获得同步细胞的机理不完全了解。这种处理可能是导致细胞内某些物质合成，这些物质的合成和积累可导致细胞分裂，从而获得同步细胞。物质合成，这些物质的合成和积累可导致细胞分裂，从而获得同步细胞。二、微生物的群体生长及其规律n n微生物个体细胞的生长时间微生物个体细胞的生长时间一般很短，很快就进入繁殖一般很短，很快就进入繁殖阶段，即微生物的群体生长阶段，即微生物的群体生长阶段。微生物群体的生长表阶段。微生物群体的生长表现为细胞数目或群体细胞物现为细胞数目或群体细胞物质的增加。工业发酵的过程质的增加。工业发酵的过程就是微生物群体细胞新陈代就是微生物群体细胞新陈代谢的过程，因此研究微生物谢的过程，因此研究微生物群体生长的规律对于发酵工群体生长的规律对于发酵工业生产具有重要的指导意义。业生产具有重要的指导意义。图6-10细菌群体形成的过程（图中的数字为小时）n n如将少量微生物纯培养物接种入新鲜的液体培养基，在适宜的条件如将少量微生物纯培养物接种入新鲜的液体培养基，在适宜的条件下培养，定期取样测定单位体积培养基中的菌体（细胞）数，可发下培养，定期取样测定单位体积培养基中的菌体（细胞）数，可发现开始时群体生长缓慢，后逐渐加快，进入一个生长速率相对稳定现开始时群体生长缓慢，后逐渐加快，进入一个生长速率相对稳定的高速生长阶段，随着培养时间的延长，生长达到一定阶段后，生的高速生长阶段，随着培养时间的延长，生长达到一定阶段后，生长速率又表现为逐渐降低的趋势，随后出现一个细胞数目相对稳定长速率又表现为逐渐降低的趋势，随后出现一个细胞数目相对稳定的阶段，最后转入细胞衰老死亡。如用坐标法作图，以培养时间为的阶段，最后转入细胞衰老死亡。如用坐标法作图，以培养时间为横坐标，以计数获得的细胞数的对数为纵坐标，可得到一条定量描横坐标，以计数获得的细胞数的对数为纵坐标，可得到一条定量描述液体培养基中微生物生长规律的实验曲线，该曲线则称为生长曲述液体培养基中微生物生长规律的实验曲线，该曲线则称为生长曲线。线。（一）微生物的生长曲线n n从图从图6-116-11可见，细菌生长曲线可见，细菌生长曲线可划分为四个时期，即：可划分为四个时期，即：延延滞期，滞期，指数期，指数期，稳定期，稳定期，衰亡期。衰亡期。n n生长曲线表现了细菌细胞及其群生长曲线表现了细菌细胞及其群体在新的适宜的理化环境中，生体在新的适宜的理化环境中，生长繁殖直至衰老死亡的动态学变长繁殖直至衰老死亡的动态学变化过程。化过程。n n生长曲线各个时期的特点，反映生长曲线各个时期的特点，反映了所培养的细菌细胞与其所处环了所培养的细菌细胞与其所处环境间进行物质与能量交流，以及境间进行物质与能量交流，以及细胞与环境间相互作用与制约的细胞与环境间相互作用与制约的动态变化。动态变化。图6-11细菌生长曲线1 1延滞期延滞期n n这是培养基接种之后开始的一个适应期。当微生物从一种环境进入新这是培养基接种之后开始的一个适应期。当微生物从一种环境进入新的培养环境时，必须重新调整其小分子和大分子的组成，包括酶和细的培养环境时，必须重新调整其小分子和大分子的组成，包括酶和细胞结构成分，以适应新环境，因而又有调整期之称。这个时期表现曲胞结构成分，以适应新环境，因而又有调整期之称。这个时期表现曲线平坦稳定，细菌繁殖极少。工业生产上应尽可能缩短延滞期。延滞线平坦稳定，细菌繁殖极少。工业生产上应尽可能缩短延滞期。延滞期的长短因菌种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为期的长短因菌种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为1 14 4小时，通常可采取处于快速生长繁殖中的健壮菌种细胞接种、适小时，通常可采取处于快速生长繁殖中的健壮菌种细胞接种、适当增加接种量、采用营养丰富的培养基、种子培养基与下一步培养用当增加接种量、采用营养丰富的培养基、种子培养基与下一步培养用的发酵培养基的营养养成分以及培养的其它理化条件尽可能保持一致的发酵培养基的营养养成分以及培养的其它理化条件尽可能保持一致等措施，可以有效地缩短延滞期，缩短发酵周期。此期中细菌体积增等措施，可以有效地缩短延滞期，缩短发酵周期。此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖、储备充足的酶、能量及中间代谢大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖、储备充足的酶、能量及中间代谢产物的重要时期。产物的重要时期。（二）微生物的生长曲线各阶段说明2 2指数期指数期n n指数期又称对数期（如图指数期又称对数期（如图6-126-12），此期在），此期在生长曲线上表现为活菌数直线上升，细菌生长曲线上表现为活菌数直线上升，细菌以稳定的几何级数快速增长，若以乘方的以稳定的几何级数快速增长，若以乘方的形式表示，即为形式表示，即为2 2n n；这里的指数；这里的指数“n n”则为则为细胞分裂的次数或增殖的代数，也即一个细胞分裂的次数或增殖的代数，也即一个细菌繁殖细菌繁殖 n n代产生代产生 2 2n n个子代菌体，此时期个子代菌体，此时期可持续几小时至几天不等。此期细菌形态、可持续几小时至几天不等。此期细菌形态、染色性、生物活性都很典型，对外界环境染色性、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此在研究微生物的代因素的作用敏感，因此在研究微生物的代谢和遗传时，宜用这个时期的细胞；在微谢和遗传时，宜用这个时期的细胞；在微生物发酵中以该生长后期的细胞作为种子，生物发酵中以该生长后期的细胞作为种子，接种合适的发酵培养基可以缩短延滞期，接种合适的发酵培养基可以缩短延滞期，从而缩短发酵周期，提高劳动生产率与经从而缩短发酵周期，提高劳动生产率与经济效益。济效益。图6-12生长曲线的指数期n n培养基中细胞的最初个数和对数式生长一段时间后的细胞个数之间存在培养基中细胞的最初个数和对数式生长一段时间后的细胞个数之间存在如下关系：如下关系：n n N=NN=N0 022n n式中：式中：N N 细胞最终数目细胞最终数目 N N0 0 细胞初始数目细胞初始数目 n n 指数生长期细胞繁殖代数指数生长期细胞繁殖代数n n细胞每分裂一次所需要的时间称为代时，以符号细胞每分裂一次所需要的时间称为代时，以符号 GG表示，表示，n nGG t/nt/n。t t是指数生长期时间，可从细胞最终数目（是指数生长期时间，可从细胞最终数目（N N）时的培养时间）时的培养时间t t2 2，减去细胞初始数目（，减去细胞初始数目（N N0 0）时的培养时间）时的培养时间 t1 t1 而求得，即而求得，即t=tt=t2 2 t t1 1。n n因此，如果已知指数生长期的初始细胞数和指数生长期的最终细胞数，因此，如果已知指数生长期的初始细胞数和指数生长期的最终细胞数，就可以计算出就可以计算出 其繁殖的代数（其繁殖的代数（n n），计算方法如下：），计算方法如下：3 3稳定期稳定期n n由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、H H2 2OO2 2等）积累、等）积累、pHpH下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度渐趋下降，死亡数开始逐下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度渐趋下降，死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。到对数末期，微生物生渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。到对数末期，微生物生长速度降低，繁殖率与死亡率逐渐趋于平衡，活菌数基本保持稳定，长速度降低，繁殖率与死亡率逐渐趋于平衡，活菌数基本保持稳定，从而进入稳定期，该时期可以维持相当长的时间。从而进入稳定期，该时期可以维持相当长的时间。4 4衰亡期衰亡期n n随着稳定期的继续发展，生长环境的继续恶化和营养物质的短缺，细随着稳定期的继续发展，生长环境的继续恶化和营养物质的短缺，细菌繁殖速度越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数与培养时间呈反比菌繁殖速度越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形，关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形，生理代谢活动趋于停滞。生理代谢活动趋于停滞。n n掌握微生物的群体生长繁殖规律对生产菌种的选择和发酵生产过程的控制具掌握微生物的群体生长繁殖规律对生产菌种的选择和发酵生产过程的控制具有十分重要的作用。有十分重要的作用。1 1延滞期与发酵生产过程延滞期与发酵生产过程n n延滞期的长短与生产菌种的菌龄、接种量以及培养基成分有直接的关系。使延滞期的长短与生产菌种的菌龄、接种量以及培养基成分有直接的关系。使用对数期菌龄的微生物作为生产用对数期菌龄的微生物作为生产“种子种子”，延滞期较短；如使用延滞期或衰，延滞期较短；如使用延滞期或衰亡期菌龄的微生物作为生产亡期菌龄的微生物作为生产“种子种子”，则延滞期较长。接种量大，延滞期较，则延滞期较长。接种量大，延滞期较短；接种量小，延滞期较长。培养基成分丰富的，延滞期较短；培养基成分短；接种量小，延滞期较长。培养基成分丰富的，延滞期较短；培养基成分与种子培养基一致，延滞期较短。与种子培养基一致，延滞期较短。2 2指数期与发酵生产过程指数期与发酵生产过程n n 指数期的菌体细胞是代谢、生理研究的良好材料；是增殖噬菌体的最适宿指数期的菌体细胞是代谢、生理研究的良好材料；是增殖噬菌体的最适宿主菌龄；是发酵生产中用作主菌龄；是发酵生产中用作“种子种子”的最佳种龄；是革兰氏染色菌种鉴定的的最佳种龄；是革兰氏染色菌种鉴定的最佳时期。最佳时期。（三）微生物的生长曲线对生产实践的指导意义（三）微生物的生长曲线对生产实践的指导意义3 3稳定期与发酵生产过程稳定期与发酵生产过程n n稳定期是发酵生产中以菌体为终产品的最佳收获期。某些代谢产物特别是次稳定期是发酵生产中以菌体为终产品的最佳收获期。某些代谢产物特别是次生代谢产物发生在此阶段，某些细菌的芽孢也发生在此阶段，故又称为代谢生代谢产物发生在此阶段，某些细菌的芽孢也发生在此阶段，故又称为代谢产物合成期；对稳定期的理论研究导致了连续培养原理的提出和工艺技术的产物合成期；对稳定期的理论研究导致了连续培养原理的提出和工艺技术的改进。改进。4 4衰亡期与发酵生产过程衰亡期与发酵生产过程n n衰亡期与菌种的遗传特性有关，有些细菌的培养要经历所有的生长时期，几衰亡期与菌种的遗传特性有关，有些细菌的培养要经历所有的生长时期，几天以后死亡，有些细菌培养几个月乃至几年以后仍然有一些活的细胞。衰亡天以后死亡，有些细菌培养几个月乃至几年以后仍然有一些活的细胞。衰亡期的形成与菌体是否产芽孢有关，产芽孢的细菌更易于幸存下来。衰亡期的期的形成与菌体是否产芽孢有关，产芽孢的细菌更易于幸存下来。衰亡期的形成与营养物质的消耗和有毒物质的生成有关，补充营养和能源，以及中和形成与营养物质的消耗和有毒物质的生成有关，补充营养和能源，以及中和环境毒性，可以减缓死亡期细胞的死亡速率，延长菌种的存活时间。环境毒性，可以减缓死亡期细胞的死亡速率，延长菌种的存活时间。第三节 环境条件对微生物生长的影响一、物理因素对微生物生长的影响与控制一、物理因素对微生物生长的影响与控制一、物理因素对微生物生长的影响与控制一、物理因素对微生物生长的影响与控制（一）温度（一）温度 温度是影响微生物生长繁殖最重要的因素之一。在一定温度范围内，温度是影响微生物生长繁殖最重要的因素之一。在一定温度范围内，机体的代谢活动与生长繁殖随着温度的上升而增强，当温度上升到一定机体的代谢活动与生长繁殖随着温度的上升而增强，当温度上升到一定高度，开始对机体产生不利的影响，如再继续升高，则细胞功能急剧下高度，开始对机体产生不利的影响，如再继续升高，则细胞功能急剧下降以至死亡。降以至死亡。1 1微生物生长温度三基点微生物生长温度三基点 与其他生物一样，任何微生物的生长温度尽管有高有低，但总有其最与其他生物一样，任何微生物的生长温度尽管有高有低，但总有其最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度这三个重要指标，这就是生低生长温度、最适生长温度和最高生长温度这三个重要指标，这就是生长温度的三个基本点，简称生长温度三基点。长温度的三个基本点，简称生长温度三基点。2 2微生物生长的温度类型微生物生长的温度类型n n根据不同微生物对温度的要求和适应能力，可以把它们区分为低温、中根据不同微生物对温度的要求和适应能力，可以把它们区分为低温、中温和高温温和高温3 3种不同的类型。种不同的类型。（1 1）低温型微生物）低温型微生物（2 2）中温型微生物）中温型微生物（3 3）高温型微生物）高温型微生物 温度对微生物的影响是广泛的，改变温度必然会影响温度对微生物的影响是广泛的，改变温度必然会影响微生物体内所进行的多种生物化学反应。适宜的温度能刺微生物体内所进行的多种生物化学反应。适宜的温度能刺激生长，不适的温度会改变微生物的形态、代谢、毒力等，激生长，不适的温度会改变微生物的形态、代谢、毒力等，甚至导致死亡。总的来讲，温度是通过影响微生物膜的液甚至导致死亡。总的来讲，温度是通过影响微生物膜的液晶结构、酶和蛋白质的合成与活性，以及晶结构、酶和蛋白质的合成与活性，以及RNARNA的结构和转的结构和转录等影响微生物的生命活动。录等影响微生物的生命活动。3温度对微生物的影响利用温度对微生物的影响，在实验室和发酵生产实践中可以利用温度对微生物的影响，在实验室和发酵生产实践中可以采用低温或高温的方法抑制和杀死有害的微生物。常用的方采用低温或高温的方法抑制和杀死有害的微生物。常用的方法有干热灭菌和湿热灭菌两种。法有干热灭菌和湿热灭菌两种。（1 1）干热灭菌）干热灭菌 干热灭菌法是指在干燥环境（如火焰或干热空气）进行灭干热灭菌法是指在干燥环境（如火焰或干热空气）进行灭菌的技术。一般有火焰灭菌法和干热空气灭菌法。菌的技术。一般有火焰灭菌法和干热空气灭菌法。4控制温度在生产实践中的应用n n火焰灭菌法：火焰灭菌法是指用火焰灭菌法：火焰灭菌法是指用火焰直接烧灼的灭菌方法。该方法火焰直接烧灼的灭菌方法。该方法灭菌迅速、可靠、简便，适用于实灭菌迅速、可靠、简便，适用于实验室的金属器械（镊子、剪子、接验室的金属器械（镊子、剪子、接种环等）（如图种环等）（如图6-136-13）、玻璃试）、玻璃试管口和瓶口等的灭菌，不适合药品管口和瓶口等的灭菌，不适合药品的灭菌。具体做法是将器械放在火的灭菌。具体做法是将器械放在火焰上烧灼焰上烧灼1 12 2分钟。若为搪瓷容分钟。若为搪瓷容器，可倒少量器，可倒少量9595乙醇，慢慢转乙醇，慢慢转动容器，使乙醇分布均匀，点火燃动容器，使乙醇分布均匀，点火燃烧至熄灭约烧至熄灭约1 12min2min。图6-13接种环的火焰灭菌法n n干热空气灭菌法：干热空气灭菌法常采用电热烤箱和微波消毒的方法。干热空气灭菌法：干热空气灭菌法常采用电热烤箱和微波消毒的方法。电热烤箱是利用烤箱的热空气消毒灭菌。烤箱通电加热后的空气在一定电热烤箱是利用烤箱的热空气消毒灭菌。烤箱通电加热后的空气在一定空间不断对流，产生均一效应的热空气直接穿透物体，达到灭菌目的。空间不断对流，产生均一效应的热空气直接穿透物体，达到灭菌目的。一般繁殖体在干热温度一般繁殖体在干热温度8080100100中经中经1h1h可被杀死，芽孢、病毒需可被杀死，芽孢、病毒需160160170170经经2h2h方可被杀死。热空气灭菌法适用于玻璃器皿、瓷器方可被杀死。热空气灭菌法适用于玻璃器皿、瓷器以及液体石蜡、各种粉剂、软膏等。灭菌后待箱内温度降至以及液体石蜡、各种粉剂、软膏等。灭菌后待箱内温度降至50504040以下才能开启箱门，以防器皿炸裂。以下才能开启箱门，以防器皿炸裂。n n微波消毒是利用一种高频电磁波，其杀菌的作用原理，一为热效应，微波消毒是利用一种高频电磁波，其杀菌的作用原理，一为热效应，电磁波所到之处产生分子内部剧烈运动，使物体里外湿度迅速升高；电磁波所到之处产生分子内部剧烈运动，使物体里外湿度迅速升高；二为综合效应，诸如化学效应、电磁共振效应。微波消毒目前已广泛二为综合效应，诸如化学效应、电磁共振效应。微波消毒目前已广泛应用于食品、药品的消毒，用微波灭菌手术器械包、微生物实验室用应用于食品、药品的消毒，用微波灭菌手术器械包、微生物实验室用品等亦有报告。若物品先经品等亦有报告。若物品先经1 1过氧乙酸或过氧乙酸或0.50.5新洁尔灭湿化处理后，新洁尔灭湿化处理后，可起协同杀菌作用，再经微波照射可起协同杀菌作用，再经微波照射2 2分钟，杀芽孢率由分钟，杀芽孢率由98.8198.81可增可增加到加到99.9899.9899.9999.99。微波对人体有一定危害性，其热效应可损。微波对人体有一定危害性，其热效应可损伤睾丸、眼睛晶状体等，长时间照射还可致神经功能紊乱。使用时可伤睾丸、眼睛晶状体等，长时间照射还可致神经功能紊乱。使用时可设置不透微波的金属屏障或戴特制防护眼境等。设置不透微波的金属屏障或戴特制防护眼境等。（2 2）湿热灭菌）湿热灭菌 湿热灭菌法是指用饱和水蒸汽、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，该法的灭湿热灭菌法是指用饱和水蒸汽、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是药物制剂生产过程中最常用的灭菌方法。湿热灭菌效率比干热灭菌法高，是药物制剂生产过程中最常用的灭菌方法。湿热灭菌法可分为：煮沸消毒法、巴氏消毒法、高压蒸汽灭菌法、和间歇蒸汽灭菌菌法可分为：煮沸消毒法、巴氏消毒法、高压蒸汽灭菌法、和间歇蒸汽灭菌法。法。n n煮沸消毒法：将水煮沸至煮沸消毒法：将水煮沸至100100，保持，保持5 510min10min可杀灭微生物繁殖体，保可杀灭微生物繁殖体，保持持1 13h3h可杀灭芽孢。如向水中加入可杀灭芽孢。如向水中加入1 12 2碳酸氢钠，沸点可达碳酸氢钠，沸点可达105105，能增强杀菌作用，还可去污防锈。此法适用于不怕潮湿耐高温的搪瓷、金属、能增强杀菌作用，还可去污防锈。此法适用于不怕潮湿耐高温的搪瓷、金属、玻璃、橡胶类物品。玻璃、橡胶类物品。n n高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌法是实验室及发酵生产中常用的灭菌方法。高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌法是实验室及发酵生产中常用的灭菌方法。在常压下水的沸点为在常压下水的沸点为100100，如果加压则可提供高于，如果加压则可提供高于100100的蒸汽，加之蒸汽的蒸汽，加之蒸汽热穿透力强，可迅速引起蛋白质凝固变性。所以高压蒸汽灭菌在湿热灭菌法热穿透力强，可迅速引起蛋白质凝固变性。所以高压蒸汽灭菌在湿热灭菌法中效果最佳、应用较广。适用于各种耐热物品的灭菌。中效果最佳、应用较广。适用于各种耐热物品的灭菌。图6-14手提式和立式高压蒸汽灭菌锅n n间歇蒸汽灭菌法：间歇蒸汽灭菌法是用流通蒸汽反复几次处理的灭间歇蒸汽灭菌法：间歇蒸汽灭菌法是用流通蒸汽反复几次处理的灭菌方法。将待灭菌物品置于阿诺氏灭菌器或蒸锅（蒸笼）及其他灭菌菌方法。将待灭菌物品置于阿诺氏灭菌器或蒸锅（蒸笼）及其他灭菌器中，常压下器中，常压下100100处理处理151530min30min，以杀死其中的营养细胞。冷却，以杀死其中的营养细胞。冷却后，置于一定温度（后，置于一定温度（28283737）保温过夜，使其中可能残存的芽）保温过夜，使其中可能残存的芽孢萌发为营养细胞，再以同样方法加热处理。如此反复三次，可杀灭孢萌发为营养细胞，再以同样方法加热处理。如此反复三次，可杀灭所有芽孢和营养细胞，以达到灭菌的目的。此法的缺点是灭菌比较费所有芽孢和营养细胞，以达到灭菌的目的。此法的缺点是灭菌比较费时，一般只用于不耐热的药品、营养物、特殊培养基等的灭菌。在缺时，一般只用于不耐热的药品、营养物、特殊培养基等的灭菌。在缺乏高压蒸汽灭菌设备时也可用此法灭菌。乏高压蒸汽灭菌设备时也可用此法灭菌。n n巴氏消毒法：巴氏消毒法也称低温消毒法、冷杀菌法，是一种利用巴氏消毒法：巴氏消毒法也称低温消毒法、冷杀菌法，是一种利用较低的温度既可杀死病菌又能保持物品中营养物质风味不变的消毒法。较低的温度既可杀死病菌又能保持物品中营养物质风味不变的消毒法。图6-15高温瞬间巴氏消毒法的操作流程图湿热灭菌较干热灭菌效果好主要有三点原因：湿热灭菌较干热灭菌效果好主要有三点原因：n n蛋白质在含水