第六章金黄色葡萄球菌的检验.ppt

第六章第六章金黄色葡萄球菌检金黄色葡萄球菌检验验雪印牛奶中毒事件人民日报（记者于青管克江）报导6月底以来，日本关西等地区发生特大食品中毒事件，截至6月30日晚间，因喝下有问题的雪印牌低脂肪牛奶而产生上吐下泻、腹痛等不适症状的患者人数为4891人，到7月1日中午，中毒人数已经超过5000人！且受害范围也由原来的5个行政区域扩大至8个。这是战后日本发生的规模最大的一起食品中毒事件。7月2日，大阪府公共卫生研究所证实，从患者饮用剩余的雪印牛奶中检查出了金黄色葡萄球菌，这种葡萄球菌导致A型肠毒素滋生，该毒素可造成饮用者腹泻、呕吐及全身不适。牛奶被污染原因何在？一、金黄色葡萄球菌的生物学特性1、形态与染色：(staphylococcus aureus)金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，不运动典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8m mm左右，显微镜下排列成葡萄串状。革兰氏染色阳性 附：金黄色葡萄球菌的显微照片 金黄色葡萄球菌的染色照片 金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片 金黄色葡萄球菌的透射电镜照片 金黄色葡萄球菌的显微照片典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8 m mm左左右，显微镜下排列成葡萄串状。右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌革兰氏染色显微照片金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜革兰氏染色阳性革兰氏染色阳性金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片Staphylococcus aureus Enhanced sem w:7.9 micron3、生化特性：生化特性：可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸，产酸不产气。甲基红反应阳性，不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，酸盐，液化明胶液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏对青霉素、红霉素等高度敏感感。金黄色葡萄球菌的致病性金黄色葡萄球菌的致病性金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌的的致致病病力力强强弱弱主主要要取取决决于于其其产产生生的的毒毒素素和侵袭性酶：和侵袭性酶：a.a.溶血毒素溶血毒素：外毒素，分：外毒素，分、，能损伤血小板，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；b.b.杀白细胞素杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.c.血浆凝固酶血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d.d.脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；e.e.肠毒素肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为白质性肠毒素，分为A A、B B、C C、D D、E E及及F F六种血清型。六种血清型。*金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。类中毒事件也非常多。肠毒素形成条件肠毒素形成条件：存放温度存放温度，在，在37内，温度越高，产内，温度越高，产毒时间越短；毒时间越短；存放地点存放地点，通风不良氧分压低易形成，通风不良氧分压低易形成肠毒素；肠毒素；食物种类食物种类，含蛋白质丰富，水分多，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。当当金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌污污染染了了含含淀淀粉粉及及水水分分较较多多的的食食品品，如如牛牛奶奶和和乳乳制制品品、肉肉、蛋蛋等等，在在温温度度条条件件适适宜宜时时，经经过过810小小时时即即可可产产生生相相当当数数量量的的肠肠毒毒素，肠毒素可耐受素，肠毒素可耐受100煮沸煮沸30分钟而不被破坏。分钟而不被破坏。人摄食该菌污染的食物人摄食该菌污染的食物23h后后可引起中毒症状，它引起的食可引起中毒症状，它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。物中毒症状是呕吐和腹泻。金黄色葡萄球菌的流行病学特点金黄色葡萄球菌的流行病学特点季节分布，多见于春夏季；中毒食品季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。的中毒事件也有报道。GB4789.10-2010第一法：金黄色葡萄球菌的定性检测第二法：金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数第三法：金黄色葡萄球菌MPN计数金黄色葡萄球菌的检验金黄色葡萄球菌的定性检验检样检样增菌增菌（7.5氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或10氯化钠胰酪胨大豆肉汤）氯化钠胰酪胨大豆肉汤）BP平板平板，血平板血平板涂片染色涂片染色观察溶血观察溶血BHI肉汤和营养琼脂肉汤和营养琼脂血浆凝固酶实验血浆凝固酶实验报告报告金黄色葡萄球菌的检验金黄色葡萄球菌的检验1、样品制备、样品制备按无菌操作取检样按无菌操作取检样25 g（mL），加入，加入225 mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或置灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成均质器中制成1:10样品混悬液。样品混悬液。供计数检验时，可按十进位递增稀释法供计数检验时，可按十进位递增稀释法将样品匀液再进行适当稀释。将样品匀液再进行适当稀释。金黄色葡萄球菌的检验金黄色葡萄球菌的检验2、增菌及分离培养、增菌及分离培养 吸取吸取5 mL混悬液，接种于混悬液，接种于7.5%氯化钠氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤肉汤或胰酪胨大豆肉汤50 mL培养基内，培养基内，361培养培养24 h，转种血平板和转种血平板和Baird-Parker平板，平板，361培养培养24 h，挑取血挑取血平板上金黄色（有时为白色）菌落进行革兰平板上金黄色（有时为白色）菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。氏染色镜检及血浆凝固酶试验。血平板上金黄色葡萄球菌菌落形态金黄色葡萄球球菌的单个菌落在血金黄色葡萄球球菌的单个菌落在血平板上呈金黄色，有时也为白色，大而平板上呈金黄色，有时也为白色，大而突出、圆形、不透明、表面光滑，周围突出、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。有溶血圈。溶血圈溶血圈金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌在在BPBP平板上的菌落形态平板上的菌落形态在在Baird-Parker琼脂平板上菌落呈圆形，表面光琼脂平板上菌落呈圆形，表面光滑、凸起、湿滑、凸起、湿 润，直径润，直径23 mm。灰黑色至黑色，有灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明圈圈（沉淀），其外常有一清晰带。当用接种针触及菌（沉淀），其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同。株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱从长期贮存的冷冻或脱 水食品中分离的菌落，其黑色水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。亚碲酸钾亚碲酸钾卵磷脂环卵磷脂环甘氨酸、甘氨酸、氯化锂氯化锂成分：成分：胰蛋白胨胰蛋白胨牛肉膏牛肉膏酵母膏酵母膏丙酮酸钠丙酮酸钠甘氨酸甘氨酸氯化锂氯化锂卵黄卵黄亚碲酸钾亚碲酸钾琼脂琼脂BP平板主要成分及作用氯化锂、甘氨酸抑制非致病性葡萄球菌的生长丙酮酸钠促进葡萄球菌生长亚碲酸钾抑制G-杆菌生长，可被金黄色葡萄球菌还原为碲盐呈黑色卵黄含蛋白质、卵磷脂、脂肪，提供营养和有利于观察卵磷脂环金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌在甘露醇盐平板上的菌落在甘露醇盐平板上的菌落Staphylococcus aureus on mannitol salts agar3、血浆凝固酶试验：吸取吸取1:4新鲜兔血浆新鲜兔血浆0.5 mL，放入小试放入小试管中，再加入培养管中，再加入培养24 h的金黄色葡萄球菌的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物肉浸液肉汤培养物0.5 mL，振荡摇匀，振荡摇匀，置置 361温箱或水浴内，每半小时观察一温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察次，观察6 h，如呈现凝固如呈现凝固,即将试管倒置即将试管倒置或或 倾斜时，呈现凝块者，被认为阳性结果。倾斜时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。作为对照。金黄色葡萄球菌肠毒素的检测金黄色葡萄球菌肠毒素的检测一、动物学试验主要用幼猫和猴。一、动物学试验主要用幼猫和猴。二、血清学试验肠毒素作为抗原，可以二、血清学试验肠毒素作为抗原，可以和特异性抗体发生结合性反应，产生可见和特异性抗体发生结合性反应，产生可见沉淀。沉淀。用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素，方法主要有：毒素，方法主要有：1.免疫琼脂扩散法免疫琼脂扩散法 2.反向间接血凝试验反向间接血凝试验 3.免疫荧光法免疫荧光法 4.酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法金黄色葡萄球菌快速检测方法目前，随着研究的深入，一些快速和采用目前，随着研究的深入，一些快速和采用现代技术的检测方法不断出现，这些新的快速现代技术的检测方法不断出现，这些新的快速方法，一般都缩短了传统检测方法的时间，能方法，一般都缩短了传统检测方法的时间，能够较快地得到检测结果，并且操作相对简单。够较快地得到检测结果，并且操作相对简单。比如：法国梅里埃公司生产的比如：法国梅里埃公司生产的RPF培养基、培养基、API检测系统等。梅里埃公司生产的检测系统等。梅里埃公司生产的mini VIDAS利用荧光免疫的方法检测葡萄球菌利用荧光免疫的方法检测葡萄球菌肠毒素，在仪器上肠毒素，在仪器上45 min可以得到结果。可以得到结果。法国梅里埃公司生产的法国梅里埃公司生产的RPFRPF培养基培养基凝固酶阳性葡萄球菌凝固酶阳性葡萄球菌:菌落周围形成沉淀圈菌落周围形成沉淀圈(例例例例)金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌-+l将兔血浆包括在培养基中作为直接确认菌落的手段将兔血浆包括在培养基中作为直接确认菌落的手段金黄色葡萄球菌污染的控制金黄色葡萄球菌污染的控制防止食品污染防止食品污染防止带菌人群对各种食物的污染：防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产加工人员进行健康检查，患定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性肺、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止其炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止其工作或调换岗位。工作或调换岗位。金黄色葡萄球菌污染的控制金黄色葡萄球菌污染的控制防止食品污染防止食品污染防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；奶挤出后，要迅速冷至奶挤出后，要迅速冷至-10以下，以防以下，以防毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶为原料，注意低温保存。牛奶为原料，注意低温保存。对肉制品加工厂，患局部化脓感染对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产或其他适当方式处理后进行加工生产。防止金黄色葡萄球菌肠毒素生成防止金黄色葡萄球菌肠毒素生成 应在低温和通风良好的条件下贮藏应在低温和通风良好的条件下贮藏食物，以防肠毒素形成；食物，以防肠毒素形成；在气温高的春夏季，食物置冷藏或在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风阴凉地方也不应超过通风阴凉地方也不应超过6小时，并且小时，并且食用前要彻底加热。食用前要彻底加热。