微生物总结.ppt

o微生物学研究技术进展 观察工具、培养接种技术、鉴定检测技术、育种保种技术等方面p食品微生物学的研究任务：四个方面 食品微生物种类：有益微生物的应用形式：五种有益微生物的应用形式有益微生物的应用形式-微生物微生物发酵发酵原料灭菌接种微生物 发酵发酵产品提取、纯化代谢产物微生物代谢产物的修饰和改造菌体有益微生物在食品工业中的应用形式有益微生物在食品工业中的应用形式o微生物菌体的应用o微生物发酵食品的应用o微生物代谢产物的应用o微生物酶制剂的应用o微生物在食品工厂废弃物处理方面的应用第二部分微生物分类第二部分微生物分类鉴定进展鉴定进展微生物的命名微生物的命名学名（学名（Scientific name）林奈的林奈的“双名法双名法”Binominal nomenclature生物界的分类及微生物在生生物界的分类及微生物在生物界中位置物界中位置六界系统六界系统五界系统（五界系统（19691969年年WhittakerWhittaker）三大领域三大领域WoeseWoese 16SrRNA 16SrRNA序列分析比较序列分析比较 ，提出将生物分成为三，提出将生物分成为三界界(Kingdom)(Kingdom)(后来改称三个域后来改称三个域)：古细菌：古细菌Archaea(Archaea(古生古生菌菌)、真细菌、真细菌Eubacteria)Eubacteria)和真核生物和真核生物(Eukaryotes)Eukaryotes)。古菌古菌o1977年年Carl Woese and George Foxo细胞结构细胞结构o化学组成化学组成o生存环境条件等生存环境条件等特殊性特殊性古菌古菌o古菌是一群具有独特基因结构或系统发育生古菌是一群具有独特基因结构或系统发育生物大分子序列的单细胞生物，大多生活在地物大分子序列的单细胞生物，大多生活在地球上如超高温、高酸碱度、高盐浓度、严格球上如超高温、高酸碱度、高盐浓度、严格无氧状态等极端环境或生命出现初期的自然无氧状态等极端环境或生命出现初期的自然环境。环境。古菌的特点古菌的特点o形态o细胞结构：o细胞壁o细胞膜o代谢方式：多样化o呼吸类型：多为严格厌氧o繁殖方式：裂殖，慢o分布：多为极端环境古菌的特点古菌的特点o遗传物质特性：16srRNA序列特征既不同于真细菌，也不同于真核生物o对抗生素的敏感性：与真核生物相同，而与真细菌不同古菌分群古菌分群o古菌分为古菌分为 5 大类群：大类群：l产甲烷古菌群、产甲烷古菌群、l还原硫酸盐古菌群、还原硫酸盐古菌群、l极端嗜盐古菌群、极端嗜盐古菌群、l无细胞壁古菌群无细胞壁古菌群l极端嗜热和超嗜热代谢元素硫古菌群极端嗜热和超嗜热代谢元素硫古菌群产甲烷古菌分类产甲烷古菌分类产甲烷菌属产甲烷菌属Gram 反应反应细胞壁主要成分细胞壁主要成分甲烷杆菌属（甲烷杆菌属（Methanobacterium）G+假胞壁质假胞壁质甲烷短杆菌（甲烷短杆菌（MthanobrevibacterG+假胞壁质假胞壁质甲烷球菌属（甲烷球菌属（Methanococcus G-蛋白质单位，少量葡萄蛋白质单位，少量葡萄糖胺糖胺甲烷微菌属（甲烷微菌属（Methanomicrobium）G-蛋白质亚单位蛋白质亚单位产甲烷菌属（产甲烷菌属（Methanogenium）G-蛋白质亚单位蛋白质亚单位甲烷螺菌属（甲烷螺菌属（Methanospirillum）G-蛋白质亚单位，蛋白质蛋白质亚单位，蛋白质鞘鞘甲烷八叠球菌属（甲烷八叠球菌属（Methanosarcina G+异多糖异多糖产甲烷古细菌产甲烷古细菌是一类在形态和生理方面有着极大差异能产甲烷的严格厌氧微生物。其共同点在于利用氢气、二碳化合物（甲酸或乙酸等）在厌氧条件下还原CO2产生甲烷和合成细胞物质。反应式：CO2+4H2 CH4+2H2OCH3COOH CO2+CH4细胞中常含有辅酶M（-巯基乙基磺酸）和能在低电位条件下传递电子的因子F420。有些类群能同化CO2营自养生活，但同化CO2不经卡尔文循环，而是将它直接固定为乙酸盐加以利用。产甲烷古细菌产甲烷古细菌主要分布在有机质厌氧分解的环境中，如沼泽、湖泥、污水和垃圾处理场、动物的胃及消化道和沼气发酵池中，包括G+和G-，自养和异养。形态从球状、杆状、丝状到螺旋状等多种类型。主要有甲烷杆菌属（Methanobacterium）产甲烷球菌属（Methanococcus）产甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）产甲烷螺菌属（Methanospirillum）等。极端嗜盐古细菌（极端嗜盐古细菌（Hyperthermophilic archaea）能在含盐能在含盐20%-30%甚至饱和盐水中生活甚至饱和盐水中生活生长需要的盐浓度为生长需要的盐浓度为1.5molL-1NaCI,大多数在大多数在3.5-4.0molL-1NaCI时生长最好时生长最好严格好气，化能有机营养，常以蛋白质、氨基酸等为碳严格好气，化能有机营养，常以蛋白质、氨基酸等为碳源和能源，细胞内累积高浓度来进行渗透压调节源和能源，细胞内累积高浓度来进行渗透压调节一般因具有类胡萝卜素而呈红、橙等颜色一般因具有类胡萝卜素而呈红、橙等颜色分布在盐湖和晒盐池中，常引起腌制食品等的腐败和脱分布在盐湖和晒盐池中，常引起腌制食品等的腐败和脱色色主要有嗜盐杆菌属（主要有嗜盐杆菌属（Halobacterium）和嗜盐球菌属）和嗜盐球菌属(Halococcus)微生物分类依据微生物分类依据1.形态学特征：微生物可利用的形态特征少;形态特征在不同类群中进化速度差异大，不准确。2.生理生化特征3.生态特征微生物分类依据微生物分类依据4.血清学反应5.细胞化学成分鉴定：A：细胞壁的化学组成 B：全细胞水解液的糖型：C：磷酸类脂的成分分析:D：枝菌酸的分析：E：醌类的分析：微生物分类依据微生物分类依据6.氨基酸序列和蛋白质分析氨基酸序列和蛋白质分析微生物分类依据微生物分类依据7.核酸的碱基组成和分子杂交 A：DNA碱基比例的测定主要是（G+C）mol%值：同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在45%以下;同属不同种的差别应低于1015%B：核酸分子杂交DNA-DNA和DNA-RNA杂交 C：16SrRNA寡核苷酸编目分析微生物分类方法微生物分类方法o1.传统分类法（传统分类法（classical classification）以细菌的形态和生理生化特征为依据。以细菌的形态和生理生化特征为依据。o2.数值分类法（数值分类法（numerical classification）20世纪世纪60年代兴起，细菌的各种生物学性状年代兴起，细菌的各种生物学性状“等重要等重要原则原则”分类，性状数量超过分类，性状数量超过50个个。o3.种系分类或自然分类种系分类或自然分类(natural calssification)以细菌大分子物质（核酸、蛋白质）结构的同源程度进以细菌大分子物质（核酸、蛋白质）结构的同源程度进行分类。行分类。2024/11/5 周二25 伯杰氏细菌分类系统伯杰氏细菌分类系统 伯杰氏细菌鉴定手册伯杰氏细菌鉴定手册是细菌分类系统的综合和标准，由美国细菌学家协会（现称美国微生物学会）发起编写的，最初指定David H.Bergey作为编委会主席，在1923年出版了手册的第一版，相继在1925、1930、1934、1939、1948、1957、1994年出版了第二至第九版，成为国际上细菌学家普遍接受和采用。o第九版伯杰氏细菌鉴定手册设立35个群，将古细菌部改编为5个群，全书描写了约500个属。划分为四大类：第一类 具细胞壁的革兰氏阴性真细菌 第二类 具细胞壁的革兰氏阳性真细菌 第三类 无细胞壁的真细菌 第四类 古细菌 2024/11/5 周二27 1984-1989年陆续出版的四卷册伯杰氏系统伯杰氏系统细菌学手册细菌学手册第一版，在着重于表观特征描述的基础上，结合化学分类、数值分类特别是DNA相关性分析，及16S rRNA寡核苷酸编目在生物种群间的亲缘关系研究中的应用作了详细的阐述，体现了细菌分类的研究从表观向系统发育体系的发展。除此，还附有每个菌群的生态、分离、保藏及鉴定的方法。o第二版 由George Garrity主编分为5卷，将从2000年起陆续出版。这一版纳入了研究核糖体RNA测序所产生的许发育)分类系统。o分古细菌和真细菌2个界，下设18门、27纲、73目、186科，包括870余属和4900多个种。真菌分类真菌分类-Ainsworth 分类系统（分类系统（1971，1983年）年）真菌界真菌界Kingdom Fungi Kingdom Fungi 粘菌门粘菌门 Myxomycota 480Myxomycota 480多种多种 真菌门真菌门 Eumycota Eumycota 近近1010万种万种 鞭毛菌亚门（壶菌纲、丝壶菌纲、卵菌纲）鞭毛菌亚门（壶菌纲、丝壶菌纲、卵菌纲）接合菌亚门（接合菌纲、毛菌纲）接合菌亚门（接合菌纲、毛菌纲）子囊菌亚门（子囊菌亚门（2600026000多种）多种）担子菌亚门（层菌纲、腹菌纲、锈菌纲、担子菌亚门（层菌纲、腹菌纲、锈菌纲、黑粉菌纲黑粉菌纲 24000 24000多种）多种）半知菌亚门（腔孢纲、丝孢菌纲半知菌亚门（腔孢纲、丝孢菌纲 26000 26000多种）多种）真菌字典真菌字典的分类系统的分类系统o1995 1995 年年 ,根据根据 16s RNA 16s RNA 序列的研究、生物化序列的研究、生物化学和细胞壁组分以及学和细胞壁组分以及 DNA DNA 序列分析的结果，国序列分析的结果，国际真菌学研究的权威机构际真菌学研究的权威机构英国国际真菌研究英国国际真菌研究所（所（International Mycological Institute International Mycological Institute）出版的第）出版的第 8 8 版版真菌字典真菌字典中，将原来的真中，将原来的真菌界划分为原生动物界、藻界和真菌界。真菌菌界划分为原生动物界、藻界和真菌界。真菌界仅包括了界仅包括了 4 4 个门，即壶菌门、接合菌门、子个门，即壶菌门、接合菌门、子囊菌门和担子菌门。囊菌门和担子菌门。微生物的鉴定微生物的鉴定o常规鉴定方法：常规鉴定方法：1.形态学鉴定（群体形态特征、个体形态特征）形态学鉴定（群体形态特征、个体形态特征）2.生理生化反应试验（种类）生理生化反应试验（种类）3.半自动或全自动微生物鉴定仪半自动或全自动微生物鉴定仪微量生化反应微量生化反应试验；采用数值分类原理。试验；采用数值分类原理。4.分子遗传学分类鉴定方法分子遗传学分类鉴定方法5.16srRNA序列和序列和16s-23s-rRNA间区序列分析间区序列分析6.微生物全基因组测序微生物全基因组测序形态学检查内容形态学检查内容o个体形态个体形态细胞大小、形状细胞大小、形状菌丝形态（分隔情况）孢子着生情况菌丝形态（分隔情况）孢子着生情况细胞结构（荚膜、鞭毛、芽孢着生情况）、细胞结构（荚膜、鞭毛、芽孢着生情况）、细胞核（原核、真核）、细胞结构化学组细胞核（原核、真核）、细胞结构化学组分（细胞壁、细胞膜）分（细胞壁、细胞膜）形态学检查内容形态学检查内容o群体形态群体形态在固体培养基上（划线接种、点种、混菌、涂在固体培养基上（划线接种、点种、混菌、涂布）布）固体斜面上（菌苔）固体斜面上（菌苔）固体平板上（菌落）固体平板上（菌落）在液体培养基中在液体培养基中在半固体培养基中（穿刺接种）在半固体培养基中（穿刺接种）微微 生生 物物 育育 种种第三部分第三部分u工业生产自然选育微生物菌种的一工业生产自然选育微生物菌种的一般步骤般步骤o一、含微生物样品的采集一、含微生物样品的采集o二、富集培养二、富集培养o三、分离三、分离o四、筛选和目的产物的鉴别四、筛选和目的产物的鉴别o五五.毒性试验毒性试验出发菌株的选择出发菌株的选择1.1.自然选育的具有一定生产能力的野生或至少能少自然选育的具有一定生产能力的野生或至少能少量产生目的产物的菌株。量产生目的产物的菌株。2.2.具有有利性状的菌株，如生长速度快，营养要求具有有利性状的菌株，如生长速度快，营养要求低以及产孢子早而多的菌株。低以及产孢子早而多的菌株。3.3.选择已发生其它变异的菌株。选择已发生其它变异的菌株。4.4.采用采用“增变菌株增变菌株”（对诱变剂的敏感性比原始菌（对诱变剂的敏感性比原始菌株大为提高）的变异菌株。株大为提高）的变异菌株。诱变育种步骤与方法诱变育种步骤与方法（一）出发菌株的选择（一）出发菌株的选择单细胞或单孢子悬液的制备单细胞或单孢子悬液的制备*诱变育种工作中，一般采用诱变育种工作中，一般采用3-43-4个出发菌株，在个出发菌株，在逐代处理后，将产量高、特性好的菌株留作继续逐代处理后，将产量高、特性好的菌株留作继续诱变的出发菌株。诱变的出发菌株。（二）单细胞或单孢子悬液的制备（二）单细胞或单孢子悬液的制备采用对数期细胞或成熟而新鲜的孢子：用发芽孢子采用对数期细胞或成熟而新鲜的孢子：用发芽孢子（芽长为孢子（芽长为孢子 0.5-1 0.5-1倍）或直接用斜面孢子。倍）或直接用斜面孢子。不产生孢子的真菌采用年幼的菌丝体。不产生孢子的真菌采用年幼的菌丝体。均匀的悬液。均匀的悬液。诱变剂及诱变剂量的选择诱变剂及诱变剂量的选择（三）诱变剂及诱变剂量的选择（三）诱变剂及诱变剂量的选择（1 1）物理诱变剂）物理诱变剂q非电离辐射（只使物质分子或原子中的电子非电离辐射（只使物质分子或原子中的电子级能提高）级能提高）-紫外线紫外线1.1.诱变剂的种类诱变剂的种类紫外线紫外线诱变机制诱变机制紫外线紫外线诱变机制诱变机制q电离辐射：杀菌率电离辐射：杀菌率90%-99.9%90%-99.9%形成胸腺嘧啶二聚体；形成胸腺嘧啶二聚体；嘧啶间的水合作用；嘧啶间的水合作用；DNADNA与蛋白质交联，与蛋白质交联，DNADNA分子间交联；分子间交联；DNADNA链断裂。链断裂。紫外线最有效的波长是紫外线最有效的波长是25372537埃。采用埃。采用1515w w紫外线灯管，紫外线灯管，3030cmcm距离。距离。电离辐射电离辐射射线种类射线种类放射源放射源性质性质能量范围能量范围危险性危险性透过组织透过组织的深度的深度X X射线射线X X 光机光机电离辐射电离辐射 50-50-300300kvkv危险，有危险，有穿透力穿透力几几mm-mm-几几cmcm 射线射线放射形同位放射形同位素及核反应素及核反应同上同上达几百万达几百万evev同上同上 1 1cmcm中子中子核反应堆核反应堆或加速器或加速器不带电子不带电子的粒子的粒子1 1ev-ev-几几百万百万evev危险性高，危险性高，穿透力强穿透力强 1 1cmcm 粒子粒子放射性同位放射性同位素或加速器素或加速器电子电子几百万几百万evev有时有有时有危险危险 1 1cmcm 粒子粒子放射性同放射性同位素位素氦核氦核2 2 10106 6-9 9 106106evev内照射，内照射，很危险很危险 1 1cmcmq其它物理诱变剂：微波、红外线、激光、高能电子流等。其它物理诱变剂：微波、红外线、激光、高能电子流等。化学诱变剂化学诱变剂(2).(2).化学诱变剂化学诱变剂缺失缺失诱变剂诱变剂名称名称诱变效应诱变效应羟胺羟胺亚硝基胍亚硝基胍（NTGNTG）吖啶类吖啶类亚硝酸亚硝酸5-5-BUBUG G C C A A T TA A T T G G C C 颠换颠换移换移换回复效应回复效应+/+/+化学诱变剂化学诱变剂v大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。有效。v化化学学诱诱变变剂剂是是很很经经济济的的，因因为为只只需需要要少少量量的的合合适适的的诱诱变变剂剂，设设备备是是实实验验室室的的一一般般玻玻璃璃器器皿皿，一一个个蒸蒸气气罩罩。而而用用电电离离辐辐射射进进行行工工作作时时，设设备备费费用用大大，并并要要注注意意安安全性。全性。v大大部部分分诱诱变变剂剂是是致致癌癌剂剂，所所以以在在使使用用中中必必须须非非常常谨谨慎慎，要要避避免免化化学学诱诱变变剂剂与与皮皮肤肤接接触触，且且切切勿勿吸吸入入其其蒸蒸气气，有有人人对对某某些些诱诱变变剂剂极极其其敏敏感感，甚甚至至未未直直接接接接触触就会过敏，这就更要当心。就会过敏，这就更要当心。使用化学诱变剂的优缺点：使用化学诱变剂的优缺点：诱变剂的选择诱变剂的选择碱碱基基类类似似物物和和羟羟胺胺具具有有很很高高的的特特异异性性，但但很很少少使使用用，回回复突变率高，效果不大。复突变率高，效果不大。亚亚硝硝酸酸和和烷烷化化剂剂应应用用的的范范围围较较广广，造造成成的的遗遗传传损损伤伤较较多多。其其中中亚亚硝硝基基胍胍和和甲甲基基磺磺酸酸乙乙酯酯常常被被称称为为“超超诱诱变变剂剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。紫紫外外线线仍仍十十分分有有效效。电电离离辐辐射射是是造造成成染染色色体体巨巨大大损损伤伤的的最最好好诱诱变变剂剂，它它能能造造成成不不可可回回复复的的缺缺失失突突变变。但但它它可可能能影响邻近基因的性能。影响邻近基因的性能。2.2.诱变剂的选择诱变剂的选择诱变剂量的选择诱变剂量的选择（1 1）处理剂量大，杀菌率高（）处理剂量大，杀菌率高（90%-99%90%-99%），在单），在单位存活细胞中负变菌株多，正变菌株少。位存活细胞中负变菌株多，正变菌株少。（2 2）用小剂量进行诱变处理时，杀菌率约）用小剂量进行诱变处理时，杀菌率约50%-50%-80%80%，在单位存活细胞中正变株多，然而大幅度提，在单位存活细胞中正变株多，然而大幅度提高产量的菌株可能较少。高产量的菌株可能较少。3.3.诱变剂量的选择诱变剂量的选择诱变剂量的选择诱变剂量的选择（3 3）化学诱变剂主要是调节浓度、处理时间、处）化学诱变剂主要是调节浓度、处理时间、处理条件（温度、理条件（温度、pHpH值等）。值等）。物理诱变剂主要是控制照射距离、时间和照射过物理诱变剂主要是控制照射距离、时间和照射过程中的条件（程中的条件（O O2 2、水等）。水等）。诱变剂处理方式诱变剂处理方式（1 1）单因子处理）单因子处理处理处理1 1次次连续重复使用连续重复使用（2 2）复合因子处理）复合因子处理两个以上因子同时处理两个以上因子同时处理不同诱变剂交替处理不同诱变剂交替处理4.4.诱变剂处理方式诱变剂处理方式中间培养（四）中间培养（四）中间培养 由由于于在在发发生生了了突突变变尚尚未未表表现现出出来来之之前前，有有一一个个表表现现延延迟迟的的过过程程，即即细细胞胞内内原原有有酶酶量量的的稀稀释释过过程程(生生理理延延迟迟)，需需3 3代代以以上上的的繁繁殖殖才才能能将将突突变变性性状状表表现现出出来来。这这个个过过程程对对今今后后的的筛筛选选和和获获得得稳定菌株都是极为重要的。稳定菌株都是极为重要的。表型迟延(Phenotypic lag)指细胞遗传型虽已突变，但表型却需要在DNA复制、分离和细胞分裂后，才表现出来。表型迟延的结果是造成不纯的菌落。分离性迟延和生理性迟延中间培养方法 让让变变异异处处理理后后细细胞胞在在液液体体培培养养基基中中培培养养几几小小时时，以以让让细细胞胞的的遗遗传传物物质质复复制制，让让细细胞胞繁繁殖殖几几代代，以以得得到到纯纯的的变变异异细细胞胞。这这样样，隐隐性性的的变变异异就就会会显显现现出出来来，若若不不经经液液体体培培养养基基的的中中间间培培养养，直直接接在在平平皿皿上上分分离离就就会会出出现现变变异异和和不不变变异异细细胞胞同同时时存存在在于于一一个个菌菌落落内内的的可可能能，形形成成混混杂杂菌菌落落，以以致致造造成成筛筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。选结果的不稳定和将来的菌株退化。突变株的分离与筛选突变株的分离与筛选筛筛选选分分初初筛筛和和复复筛筛。初初筛筛以以迅迅速速筛筛出出大大量量的的达达到到初初步步要要求求的分离菌落为目的，以量为主。的分离菌落为目的，以量为主。复复筛筛则则是是精精选选，以以质质为为主主，也也就就是是以以精精确确度度为为主主。因因此此在在具体方法上就有差异具体方法上就有差异.例例如如初初筛筛可可以以在在平平皿皿上上直直接接以以菌菌落落的的代代谢谢产产物物与与某某些些染染料料或或基基质质的的作作用用形形成成的的变变色色圈圈或或透透明明圈圈的的大大小小来来挑挑取取参参加加复复筛筛者者，而而将将90%90%的的菌菌落落淘淘汰汰。在在数数量量减减少少后后就就要要仔仔细细比比较较参参加加复复筛筛和和再再复复筛筛的的菌菌株株，最最后后才才能能选选得得优优秀秀菌菌株株。在在以以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。（五）突变株的分离与筛选（五）突变株的分离与筛选产物活性测定产物活性测定一般突变规律：一个出发菌株通过一次诱变，生产一般突变规律：一个出发菌株通过一次诱变，生产能力提高能力提高5%5%的突变株约为的突变株约为1/501/50，而生产能力提高，而生产能力提高10%10%以上的突变株约为以上的突变株约为1/3001/300。通常诱变一代至少要挑选通常诱变一代至少要挑选10001000株以上，经平皿预筛株以上，经平皿预筛后，约保留后，约保留200200株进行摇瓶初筛。株进行摇瓶初筛。经典法：蛋白酶测定采用分光光度法；脂肪酶测经典法：蛋白酶测定采用分光光度法；脂肪酶测定采用定采用NaOHNaOH滴定法；滴定法；。缺点是操作繁琐、样品。缺点是操作繁琐、样品不能同时测定，带来误差。不能同时测定，带来误差。（六）产物活性测定（六）产物活性测定培养基和培养条件的调整培养基和培养条件的调整快速检验法：快速检验法：琼脂平板活性圈法：平板打孔加入发酵液或滤纸片琼脂平板活性圈法：平板打孔加入发酵液或滤纸片浸透发酵液覆盖于琼脂平板上（加有检验菌或底物）浸透发酵液覆盖于琼脂平板上（加有检验菌或底物）。其他法其他法（七）培养基和培养条件的调整（七）培养基和培养条件的调整营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型菌株的筛选实例三、营养缺陷型菌株的筛选实例三、营养缺陷型菌株的筛选2.2.营养缺陷型营养缺陷型（auxotrophauxotroph）：）：由于基因突变引起代谢过由于基因突变引起代谢过程中某种酶合成能力丧失的突变型，它们必须在原有培养基程中某种酶合成能力丧失的突变型，它们必须在原有培养基中添加相应的营养成分才能正常生长。中添加相应的营养成分才能正常生长。1.1.野生型菌株野生型菌株（wild typestrainwild typestrain）：）：从自然界分离到的从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株。微生物在其发生突变前的原始菌株。一、定义：定义：基本培养基（基本培养基（minimal medium,MMminimal medium,MM）：仅能满足微生仅能满足微生物野生型菌株生长所需的培养基。用物野生型菌株生长所需的培养基。用-表示。不同微生物表示。不同微生物的基本培养基是不同的。的基本培养基是不同的。补充培养基（补充培养基（supplemental medium,SMsupplemental medium,SM）：凡只能凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基。由满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基。由MM+MM+该菌株不能合成的营养因子而组成。该菌株不能合成的营养因子而组成。完全培养基（完全培养基（complete medium,CMcomplete medium,CM）：凡可满足一切凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需求的天然或半合成培养基。用符号营养缺陷型菌株营养需求的天然或半合成培养基。用符号+表示。一般可在表示。一般可在MMMM中加入富含氨基酸、维生素和碱基之中加入富含氨基酸、维生素和碱基之类的天然物质配制成。类的天然物质配制成。（一）营养缺陷型的诱发：亚硝基胍、紫外线、（一）营养缺陷型的诱发：亚硝基胍、紫外线、亚硝酸等作诱变剂。亚硝酸等作诱变剂。二、步骤：二、步骤：淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株（二）淘汰野生型菌株（二）淘汰野生型菌株细菌：青霉素法（抑制肽聚糖交链）细菌：青霉素法（抑制肽聚糖交链）真菌：制霉素法（作用于细胞膜上的甾醇，引起真菌：制霉素法（作用于细胞膜上的甾醇，引起细胞膜损伤）细胞膜损伤）将诱变处理后的菌体用将诱变处理后的菌体用CMCM振荡培养振荡培养2-32-3代后，离心、代后，离心、洗涤菌体，转移至洗涤菌体，转移至MMMM中饥饿培养中饥饿培养4-64-6小时，转至小时，转至MMMM中（中（+20%+20%蔗糖）培养蔗糖）培养3-43-4小时，加一定浓度的青霉小时，加一定浓度的青霉素。素。1.1.抗生素法：抗生素法：+MMMM振荡培养约振荡培养约1010小时，用灭菌的脱脂棉或滤纸等除小时，用灭菌的脱脂棉或滤纸等除去菌丝。继续培养，每隔去菌丝。继续培养，每隔3-43-4小时过滤一次，重复小时过滤一次，重复3-3-4 4次。次。诱变，诱变，MMMM振荡培养，加热至振荡培养，加热至8080。2.2.菌丝过滤法（丝状菌）菌丝过滤法（丝状菌）3.3.高温杀菌法（芽孢菌）高温杀菌法（芽孢菌）（三）营养缺陷型的检出（三）营养缺陷型的检出1.1.点植对照法（点种法点植对照法（点种法）1CMMMCM影印法影印法2.2.影印法影印法CM8cmMM高高10cm+0.5%+0.5%脱氧胆酸脱氧胆酸钠防止菌落扩散钠防止菌落扩散夹层法3.夹层法（延迟补给法）MM（薄）薄）MM（含菌）含菌）MMCM最上层最上层MMMM倾注后培养倾注后培养2424小时，非营养缺陷型菌株小时，非营养缺陷型菌株生长成菌落，再倾注最后一层生长成菌落，再倾注最后一层CM，在在MMMM上不长，上不长，后在后在CMCM上长出的小的菌落为营养缺陷型菌落。上长出的小的菌落为营养缺陷型菌落。限量补充培养法限量补充培养法限量某种营养物质（如限量某种营养物质（如0.01%0.01%蛋白胨），野生蛋白胨），野生型长出大菌落，缺陷型长出小菌落。型长出大菌落，缺陷型长出小菌落。4.4.限量补充培养法限量补充培养法营养缺陷型的鉴定营养缺陷型的鉴定（四）营养缺陷型的鉴定（四）营养缺陷型的鉴定1.1.测定缺陷型菌株所需生长因子的类别（哪测定缺陷型菌株所需生长因子的类别（哪类的判定）类的判定）（1 1）氨基酸混合物（）氨基酸混合物（2121种）；种）；（2 2）维生素混合物（）维生素混合物（1515种）；种）；（3 3）核酸碱基混合液或酵母核酸（）核酸碱基混合液或酵母核酸（0.1%0.1%）；）；（4 4）酵母浸出液。）酵母浸出液。待鉴定菌从斜面上用生理盐水刮洗，离心洗涤，待鉴定菌从斜面上用生理盐水刮洗，离心洗涤，制成制成10106 6-10-108 8个个/mlml的菌悬液，取的菌悬液，取0.10.1mlml加入加入MMMM中，中，混匀到平皿，凝固后用滤纸片分别沾各类物质混匀到平皿，凝固后用滤纸片分别沾各类物质覆于平板上，培养后观察生长圈。覆于平板上，培养后观察生长圈。2.2.具体测出缺陷型所需生长因子具体测出缺陷型所需生长因子分组测定分组测定基因重组育种自然存在自然存在原核微生物中基因重组方式原核微生物中基因重组方式v转化（转化（transformation）受体菌直接吸收来自供体菌的受体菌直接吸收来自供体菌的DNADNA片段通过片段通过交换，把它组合到自己的基因组中，从而交换，把它组合到自己的基因组中，从而获得供体菌的部分遗传性状的现象。获得供体菌的部分遗传性状的现象。转化现象在肺炎链球菌、葡萄球菌和流感转化现象在肺炎链球菌、葡萄球菌和流感嗜血杆菌等中被证实。嗜血杆菌等中被证实。v转导（转导（transduction）转导是以转导噬菌体为载体，将供体菌转导是以转导噬菌体为载体，将供体菌的一段的一段DNADNA转移到受体菌内，使受体菌获转移到受体菌内，使受体菌获得新的性状。得新的性状。普遍性转导（普遍性转导（generalized transductiongeneralized transduction）局限性转导（局限性转导（restricted transductionrestricted transduction）普遍性转导与局限性转导的区别普遍性转导与局限性转导的区别区别要点区别要点普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导基因转导发生基因转导发生的时期的时期裂解期裂解期溶原期溶原期转导的遗传物转导的遗传物质质供体菌染色体供体菌染色体DNADNA任何部位或质粒任何部位或质粒噬菌体噬菌体DNADNA及供体菌及供体菌DNADNA的特定部位的特定部位转导的后果转导的后果完全转导或流产转完全转导或流产转导导受体菌获得供体菌受体菌获得供体菌DNADNA特定部位的遗传特性特定部位的遗传特性转导频率转导频率受体菌的受体菌的1010-7-7转导频率较普遍转导增转导频率较普遍转导增加加10001000倍倍(10(10-4-4)v接合（接合（conjugationconjugation）接合是细菌通过性菌毛相互连接沟通，接合是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒将遗传物质（主要是质粒DNADNA）从供体菌）从供体菌转移给受体菌。转移给受体菌。接合性质粒：能通过接合方式转移的质接合性质粒：能通过接合方式转移的质粒称为接合性质粒，粒称为接合性质粒，F F质粒、质粒、R R质粒、质粒、ColCol质粒和毒力质粒。质粒和毒力质粒。真核微生物基因重组方式真核微生物基因重组方式1 1、有性杂交、有性杂交有性细胞的接合和随之发生的染色体重组。有性细胞的接合和随之发生的染色体重组。二、真核微生物基因重组方式二、真核微生物基因重组方式能产生有性孢子的酵母和霉菌能产生有性孢子的酵母和霉菌2 2、准性生殖（、准性生殖（parasexualityparasexuality）是真菌中不产生有性孢子的一种导致基因重组的是真菌中不产生有性孢子的一种导致基因重组的过程。类似于有性生殖而又比它更原始的一种繁过程。类似于有性生殖而又比它更原始的一种繁殖方式。殖方式。原生质体育种原生质体育种 原原生生质质体体育育种种技技术术主主要要有有原原生生质质体体融融合合、原原生生质质体体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。原原生生质质体体融融合合是是将将两两种种不不同同的的微微生生物物细细胞胞经经酶酶等等方方法法处处理理，去去掉掉细细胞胞壁壁成成为为原原生生质质体体后后进进行行融融合合的的过过程。程。原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。原原生生质质体体融融合合作作为为一一种种新新的的基基因因重重组组手手段段是是19781978年年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。基因工程育种基因工程育种是是运运用用体体外外DNADNA各各种种操操作作或或修修改改手手法法获获得得目目的的基基因因，再再借借助助于于病病毒毒、细细菌菌质质粒粒或或其其他他载载体体，将将目目的的基基因因转转移移至至新新的的宿宿主主细细胞胞并并使使其其在在新新的的宿主细胞系统内进行复制和表达。宿主细胞系统内进行复制和表达。第四部分第四部分微生物检测方法进微生物检测方法进展展食品安全标准中的微生物指标食品安全标准中的微生物指标菌落总数菌落总数菌落总数菌落总数食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。1.1菌落总数概念和其所指示的卫生意义菌落总数概念和其所指示的卫生意义菌落总数所指示的食品卫生意义菌落总数所指示的食品卫生意义：它可以作为食品被污染程度的标志，一般食它可以作为食品被污染程度的标志，一般食品中菌落总数越多，则表明该食品污染程度越品中菌落总数越多，则表明该食品污染程度越深。深。它可以用来预测食品存放的期限或程度。它可以用来预测食品存放的期限或程度。计数原则计数原则到达规定培养时间，应立即计数。如果不能到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于立即计数，应将平板放置于04，但不得超，但不得超过过24h。中中国国国国家家标标准准GB计计数数时时应应选选取取菌菌落落数数在在30300cfu/g的的平平板板（SN检检验验检检疫疫行行业业标标准准要求为要求为25250cfu/g）。）。o选选取取菌菌落落数数在在30 CFU300 CFU 之之间间、无无蔓蔓延延菌菌落落生生长长的的平平板板计计数数菌菌落落总总数数。低低于于30 CFU 的的平平板板记记录录具具体体菌菌落落数数，大大于于300 CFU 的的可可记记录录为为多多不不可可计。计。o其其中中一一个个平平板板有有较较大大片片状状菌菌落落生生长长时时，则则不不宜宜采采用用，而而应应以以无无片片状状菌菌落落生生长长的的平平板板作作为为该该稀稀释释度度的的菌菌落落数数；若若片片状状菌菌落落不不到到平平板板的的一一半半，而而其其余余一一半半中中菌菌落落分分布布又又很很均均匀匀，即即可可计计算算半半个个平平板板后后乘乘以以2，代代表表一一个个平平板菌落数。板菌落数。o当当平平板板上上出出现现菌菌落落间间无无明明显显界界线线的的链链状状生生长长时时，则则将将每条单链作为一个菌落计数。每条单链作为一个菌落计数。o若若所所有有稀稀释释度度的的平平板板上上菌菌落落数数均均大大于于300 CFU，则则对对稀稀释释度度最最高高的的平平板板进进行行计计数数，其其他他平平板板可可记记录录为为多多不不可可计计，结结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。o若若所所有有稀稀释释度度的的平平板板菌菌落落数数均均小小于于30 CFU，则则应应按按稀稀释释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。o若若所所有有稀稀释释度度（包包括括液液体体样样品品原原液液）平平板板均均无无菌菌落落生生长长，则以小于则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。乘以最低稀释倍数计算。o若若所所有有稀稀释释度度的的平平板板菌菌落落数数均均不不在在30 CFU300 CFU 之之间间，其其中中一一部部分分小小于于30 CFU 或或大大于于300CFU 时时，则则以以最最接接近近30 CFU 或或300 CFU 的的平平均均菌菌落落数数乘乘以以稀稀释释倍倍数计算。数计算。o若若只只有有一一个个稀稀释释度度平平板板上上的的菌菌落落数数在在适适宜宜计计数数范范围围内内，计计算算两两个个平平板板菌菌落落数数的的平平均均值值，再再将将平平均均值值乘乘以以相相应应稀稀释倍数，作为每释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。）样品中菌落总数结果。o若若有有两两个个连连续续稀稀释释度度的的平平板板菌菌落落数数在在适适宜宜计计数数范范围围内内时时，按公式（按公式（1）计算：）计算：N=C(n1+0.1n2)d式中：式中：N样品中菌落数；样品中菌落数；C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。稀释因子（第一稀释度）。大肠菌群大肠菌群粪便污染指示菌之一粪便污染指示菌之一-大肠菌群大肠菌群(coliforms)具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，指指一群能发酵乳糖产酸产气，需氧的或兼性厌氧的一群能发酵乳糖产酸产气，需氧的或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢的杆菌。包括埃希氏菌属、柠革兰氏阴性无芽孢的杆菌。包括埃希氏菌属、柠檬酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等的一些菌檬酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等的一些菌种。种。分布广泛：土壤、人和动物肠道。分布广泛：土壤、人和动物肠道。大肠菌群值所指示的卫生意义：大肠菌群值所指示的卫生意义：1.它可作为粪便污染食品的指示菌。它可作为粪便污染食