微生物的实验室培养---用.ppt

原生生物：原生生物：原核生物原核生物:真菌真菌:病毒病毒:如酵母菌如酵母菌单细胞的动植物单细胞的动植物如草履虫、单细胞藻类等如草履虫、单细胞藻类等微生物包含了除微生物包含了除植物界植物界和和动物界动物界以外的所有生物以外的所有生物无细胞结构无细胞结构真核细胞真核细胞细菌、蓝藻细菌、蓝藻、放线菌放线菌原核细胞原核细胞微微生生物物的的类类群群课题1 微生物的实验室培养1.提供营养和条件2.防止污染一一.培养基：培养基：微生物生存的环境和营养物质微生物生存的环境和营养物质1.1.基本成分：基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐碳源碳源无机碳源：无机碳源：有机碳源：有机碳源：COCO2 2、COCO3 32 2-、HCOHCO3 3-牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物氮源氮源无机氮源：无机氮源：有机氮源：有机氮源：NHNH4 4、NONO3 3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含注：含CHONCHON的的有机物有机物是是异异养型微生物的养型微生物的碳源碳源、氮源氮源、能源能源单个单个或少数菌体或少数菌体特征：特征：大小、形状、光泽度、大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。颜色、透明度等。功能：功能：定义：定义：菌落菌落鉴定菌种鉴定菌种的重要依据的重要依据固体固体培养基上培养基上大量繁殖大量繁殖子细胞群体子细胞群体形态各异的菌落形态各异的菌落其它分类：其它分类：根据根据化学成分化学成分分分 合成培养基合成培养基成分明确成分明确 天然培养基天然培养基成分成分不明确不明确根据根据用途用途分分 选择培养基选择培养基 鉴别培养基鉴别培养基选择培养基选择培养基加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基 分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基 分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基 分离固氮菌分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基加入青霉素等抗生素的培养基 分离导入了目的基因的受体细胞分离导入了目的基因的受体细胞牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼脂琼脂20.0g分析营养构成？分析营养构成？练习1（多项选择）1、下列细菌中，能利用含碳无机物作碳源的是、下列细菌中，能利用含碳无机物作碳源的是A 光合细菌光合细菌 B 根瘤菌根瘤菌 C 硝化细菌硝化细菌 D 乳酸菌乳酸菌2、培养大肠杆菌的培养基中，必需含有的碳源和氮源、培养大肠杆菌的培养基中，必需含有的碳源和氮源是是A 糖、有机酸等糖、有机酸等 B 二氧化碳、碳酸盐二氧化碳、碳酸盐C 蛋白质蛋白质 D 无机氮化物无机氮化物3、下列叙述不正确的是、下列叙述不正确的是A 培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质B 液体培养基和固体培养基所含的最基本物质不相同液体培养基和固体培养基所含的最基本物质不相同C 微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌的单个细菌A.CA.CB.C.1.1.无菌范围：无菌范围：实验操作空间消毒实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒操作者的手、衣着消毒实验用具、培养基灭菌实验用具、培养基灭菌实验操作过程实验操作过程酒精灯旁操作酒精灯旁操作超净工作台超净工作台二二.无菌技术：无菌技术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染耐高温需保持干燥的耐高温需保持干燥的 物品，物品，160170 12小时小时接种环、接种针等接种环、接种针等 金属用具金属用具7075、30min 80、15min100、56min消毒消毒灭菌灭菌定义定义方法方法较为较为温和温和理化方法，理化方法，杀死杀死部分有害菌体部分有害菌体（不不包括芽孢、孢子）包括芽孢、孢子）强烈强烈的理化方法，的理化方法，杀死杀死所有微生物所有微生物（包括（包括芽孢、孢子芽孢、孢子）煮沸消毒法煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法化学药剂化学药剂紫外线紫外线灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌酒精、氯气、石炭酸等酒精、氯气、石炭酸等高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌培养基，培养基，100KPa、121、1530min二二.无菌技术：无菌技术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染2.2.消毒与灭菌：消毒与灭菌：思考:1)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？生物污染外，还有什么目的？2)消毒和灭菌有何不同？消毒和灭菌有何不同？3)为什么消毒牛奶要用巴氏消毒法为什么消毒牛奶要用巴氏消毒法?4)请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。需要，请选择合适的方法。培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管实验操作者的双手实验操作者的双手消毒消毒灭菌灭菌条件条件温和温和强烈强烈作用作用范围范围物体表面或内部一部物体表面或内部一部分分,不包括芽孢和孢不包括芽孢和孢子子物体内外所有微生物物体内外所有微生物,包括芽孢和孢子包括芽孢和孢子无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。灭菌灭菌 灭菌灭菌 消毒消毒营养成分不被破坏营养成分不被破坏培养基培养基培养皿培养皿空空 气气接种环接种环双双 手手牛牛 奶奶巴氏消毒巴氏消毒化学消毒化学消毒紫外线消毒紫外线消毒高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌常用的消毒方法和灭菌方法常用的消毒方法和灭菌方法1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼脂琼脂20.0g三三.大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.计算：计算：培养基用量培养基用量依配方计算各成分的用量依配方计算各成分的用量2.2.称量：称量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解 取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂琼脂 补水定容补水定容4.4.调调pHpH、分装、封口：、分装、封口：5.5.灭菌：灭菌：6.6.倒平板：倒平板：培养基、培养皿培养基、培养皿分散成单个细胞分散成单个细胞,形成单个菌落形成单个菌落冷却至冷却至5050，在酒精灯火焰附近，在酒精灯火焰附近倒平板倒平板思考思考1溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热?答:加琼脂的目的是什么?答:可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中溶于水中,减少误差减少误差作为凝固剂作为凝固剂思考思考2在灭菌前,用牛皮纸、旧报纸包紧盛有 培养基的锥形瓶的目的是什么？答:培养皿能否用高压蒸汽灭菌？答:在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞,在在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用杂菌污染的作用不能不能,因为培养皿要保持干燥因为培养皿要保持干燥,应该用干热灭菌应该用干热灭菌.讨论讨论:(1).培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？(2).为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？(3).平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？(4).在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？生物吗？为什么？提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。因此最好不要用这个平板培养微生物。纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：平板划线法：平板划线法：菌种菌种划划3 3个平板个平板1 1个不划线个不划线1.1.接种：接种：接种环接种环防止划破培养基防止划破培养基（重复实验）（重复实验）（空白对照）（空白对照）平板划线法：平板划线法：稀释涂布平板法稀释涂布平板法 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。感染操作者。2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。落。6 6支试管，分别加入支试管，分别加入9ml9ml无菌水无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：菌液菌液微量微量 移液器移液器稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：b.b.涂布平板：涂布平板：不超过不超过0.1ml0.1ml各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平板1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对照滴滴灼灼试试涂涂稀稀释释10103 3倍倍稀稀释释10104 4倍倍稀稀释释10105 5倍倍涂布平板操作涂布平板操作讨论讨论:涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第想，第2步应如何进行无菌操作？步应如何进行无菌操作？答：应从操作的各个细节保证答：应从操作的各个细节保证“无菌无菌”。例如，酒精灯。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。吸管要在酒精灯火焰周围；等等。2.2.培养：培养：将将接种后接种后的培养基和一个的培养基和一个未接种未接种的培养基的培养基放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24h后，后，观察并记录观察并记录 1.1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？落生长，说明了什么？无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则，说明培养基有杂菌，需要重新制备。否则，说明培养基有杂菌，需要重新制备。2.2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似？菌落？它们的大小、形状、颜色相似？如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。形状、颜色相似的菌落。四四.结果分析与评价结果分析与评价 3.3.培养培养12h12h和和24h24h后，观察到的实验结果相同吗？如后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？果不同，请分析产生差异的原因？培养培养12h12h与与24h24h后的大肠杆菌菌落的后的大肠杆菌菌落的大小大小会有明显会有明显不同不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。4.4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。其可能的原因。无菌操作无菌操作未未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了污染。污染。五五.菌种的保藏：菌种的保藏：1.1.临时保藏：临时保藏：试管固体斜面培养基上试管固体斜面培养基上442.2.长期保存：长期保存：菌种易被污染、变异菌种易被污染、变异甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油甘油1ml1ml菌液菌液2020练习：练习：1、培养细菌需要根据某种细菌的、培养细菌需要根据某种细菌的_配制特定的配制特定的_.其中其中_培养基应用广泛培养基应用广泛.2、为使培养基呈固体状态，需要在配制好的各营养、为使培养基呈固体状态，需要在配制好的各营养成分的液体加入成分的液体加入_,溶化冷却即可溶化冷却即可.3、调节培养基的、调节培养基的pH值值,用浓度为用浓度为1mol/L的的_或或_溶液进行调节溶液进行调节.营养需要营养需要培养基培养基牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨琼脂琼脂HClNaOH4、对培养基进行灭菌就是要利用高温杀死、对培养基进行灭菌就是要利用高温杀死_.5、搁置斜面时培养基温度不能、搁置斜面时培养基温度不能_否否则培养基会变成则培养基会变成_应趁热将试管放置成应趁热将试管放置成斜面形斜面形培养基中的一切微生物培养基中的一切微生物太低太低固体固体6、微生物接种时各项操作必须在、微生物接种时各项操作必须在_条件条件下进行下进行.因此必须在因此必须在_上操作上操作.接种环境接种环境在在_上用灼烧去灭菌上用灼烧去灭菌,双手用双手用_%的酒精消毒的酒精消毒.无菌无菌超净工作台超净工作台酒精灯酒精灯75（11年新课标卷）年新课标卷）39.【生物 选修1：生物技术实践】（15分）有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。回答问题：在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以 为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于培养基。纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即 和 。为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力 。通常情况下，在微生物培养过程中实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、和 。无菌技术要求试验操作应在酒精灯 附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。原油 选择平板划线法 稀释涂布平板法强。干热灭菌法 高压蒸汽灭菌法 火焰讨论讨论1在高压蒸汽灭菌开始以前，为什在高压蒸汽灭菌开始以前，为什 么要将灭菌锅内的冷空气排尽？么要将灭菌锅内的冷空气排尽？在高压蒸汽灭菌以前，如果高在高压蒸汽灭菌以前，如果高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，当压力上升到当压力上升到 100 kPa时，锅内的时，锅内的温度就不会上升到应有的高度，导温度就不会上升到应有的高度，导致灭菌不彻底。致灭菌不彻底。2灭菌完毕以后，如果压力未降到灭菌完毕以后，如果压力未降到0就打开排气阀，会出现什么现象？就打开排气阀，会出现什么现象？为什么？为什么？如果压力未降到零就打开排气如果压力未降到零就打开排气阀，试管内的培养基就会冲出管口。阀，试管内的培养基就会冲出管口。这是因为高压蒸汽灭菌锅内外压力这是因为高压蒸汽灭菌锅内外压力不平衡的缘故不平衡的缘故 3接种操作为什么一定要在火焰接种操作为什么一定要在火焰 旁边进行？旁边进行？空气中存在有大量的微生物，空气中存在有大量的微生物，而接种灯的火焰旁能形成一个无菌而接种灯的火焰旁能形成一个无菌区域，在这里操作，可以避免杂菌区域，在这里操作，可以避免杂菌污染污染